3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Diệp Hạ Châu
(Phyllanthus urinaria (L.))
2.3.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên * Định tính flavonoid
Mẫu thử được pha trong ethanol với một lượng thích hợp.
- Phản ứng Shinoda: cho thêm vài giọt acid chlohidric vào dung dịch mẫu. Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh magie và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
- Phản ứng diazo hóa: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo. Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu da cam.
- Phản ứng với acid sunfuric: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng với dung dịch kiềm: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt natri hidrocid 10%. Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
- Phản ứng định tính catechin: nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong acid chlohidric đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính.
* Định tính tannin
Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:
- Phản ứng với vanilin/H2SO4: chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
- Phản ứng với gelatin/NaCl: cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện kết tủa.
* Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch acid chlohidric: phản ứng với thuốc thử Bouchardat cho kết tủa màu nâu sẫm.
- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong H2O): phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendrorf (hỗn hợp Bi(NO3)3) và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
* Định tính glycoside
Phản ứng Keller-Killian:
Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử gồm:
Dung dịch A: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid acetic 10%. Dung dịch B: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid sunfuric đặc. Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
* Định tính các polyphenol khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: dung dịch mẫu thử được pha như trên. Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5 M vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau
Bảng 2.1. Các phản ứng định tính Nhóm
hợp chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Shinoda Mg/HCl
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính. Dung dịch
kiềm NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid
sulfuric H2SO4 10%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron. Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có
mặt của catechin.
Tannin
Vanilin/H2SO4
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5% Gelatin/1% NaCl
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid
Bouchardat Hỗn hợp KI + I2 /HCl
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm.
Vans-Mayer Hỗn hợp HgCl2+ KI
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Polyphenol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau
* Nguyên tắc
Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo mg acid galic chuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dùng chất chuẩn là acid gallic.
* Các bước tiến hành
- Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
- Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5 mg/ml.
- Dung dịch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000 ml.
- Dung dịch mẫu cần định lượng.
- Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic
- Chuẩn bị các định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
- Cho vào mỗi cốc 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58 ml H2 O + 100 µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 µl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
- Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 µl (0,02 ml) để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
2.3.2.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) là kĩ thuật sắc kí khá nhanh gọn và tiện lợi. Nó giúp nhận biết các nhóm chất có trong mẫu nghiên cứu. Phương pháp sắc kí lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sách hệ số lưu của hỗn hợp (Rf)và hệ số lưucủa một số chất đã biết [3].
* Nguyên tắc
Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau với pha tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc kí). Pha tĩnh có thể là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamide.... Pha động là một hỗn hợp từ hai dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích.
* Phương pháp
Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thước phù hợp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất. Một số hệ dung môi được sử dụng:
- TEAF: 5 : 3 : 1 : 1 (Toluen - ethylacetate - acetone - acid formic). - Toluen: etylaxetate: acid focmic = 5 : 4 : 1.
- Etylaxetat: acid focmic: nước = 8 : 1 : 1.
- Dùng ống vi quản để chấm mẫu lên bản sắc ký. Mẫu chấm phải nhỏ gọn, không để lan rộng, dùng máy sấy làm khô ngay. Chấm lặp lại nhiều lần. - Tiến hành chạy sắc ký: cho bản sắc ký vào bình sắc ký đã chứa sẵn
dung môi triển khai. Đặt bản sắc ký vào gờ nhỏ ở đáy bình. Đậy nắp bình, dung môi sẽ thấm lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần hoạt chất của mẫu. Chấm dứt chạy mẫu khi dung môi thấm đến 2/3 bản sắc ký.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
- Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%: sau khi tiến hành chạy sắc ký, cho bản sắc ký vào dung dịch H2SO4 10% để lên màu, hơ nguội trên ngọn lửa đèn cồn, quan sát và đánh giá. Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b. Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi.