3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2.Dụng cụ thí nghiệm
- Dụng cụ và thiết bị tách chiết: Bình ngâm mẫu, phễu chiết, giấy lọc, bình tam giác. - Bóng đèn, quạt điện.
- Ống nghiệm, đũa thuỷ tinh. - Tủ sấy Memert, Đức.
- Bản sắc kí giấy.
- Cân kĩ thuật GM612, Đức.
- Máy li tâm eppendorf, li tâm lạnh.
- Máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa OLYMPUS AU 640, Nhật. - Máy đo đường huyết tự động OneTouch Ultra và que thử, Mỹ.
- Micropipet và các dụng cụ đo đếm khác. - Máy quang phổ UV - VIS 1000.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu
Cây Diệp Hạ Châu được thu về phơi khô, sau đó nghiền nhỏ. Tiến hành ngâm 3 kg Diệp Hạ Châu với ethanol 90% theo tỉ lệ mẫu : dung môi = 1 : 3 (khối lượng : thể tích) trong vòng 1 tuần (mỗi ngày khuấy đều một lần). Quá trình này lặp lại 3 lần. Các dịch chiết được gom lại và lọc 3 lần qua giấy lọc để loại bỏ cặn khỏi dịch chiết. Cô cất loại dung môi dưới bóng điện 220V-200W thu được cao ethanol tổng số. Cao ethanol tổng số được hòa tan trong một thể tích tối thiểu nước ấm cho đến khi hòa tan hoàn toàn và chiết lần lượt với các
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethylacetate. Cô loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao các phân đoạn tương ứng.
2.3.2. Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) (Phyllanthus urinaria (L.))
2.3.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên * Định tính flavonoid
Mẫu thử được pha trong ethanol với một lượng thích hợp.
- Phản ứng Shinoda: cho thêm vài giọt acid chlohidric vào dung dịch mẫu. Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh magie và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
- Phản ứng diazo hóa: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo. Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu da cam.
- Phản ứng với acid sunfuric: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng với dung dịch kiềm: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt natri hidrocid 10%. Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
- Phản ứng định tính catechin: nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong acid chlohidric đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính.
* Định tính tannin
Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:
- Phản ứng với vanilin/H2SO4: chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
- Phản ứng với gelatin/NaCl: cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện kết tủa.
* Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch acid chlohidric: phản ứng với thuốc thử Bouchardat cho kết tủa màu nâu sẫm.
- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong H2O): phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendrorf (hỗn hợp Bi(NO3)3) và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Định tính glycoside
Phản ứng Keller-Killian:
Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử gồm:
Dung dịch A: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid acetic 10%. Dung dịch B: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid sunfuric đặc. Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
* Định tính các polyphenol khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: dung dịch mẫu thử được pha như trên. Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5 M vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau
Bảng 2.1. Các phản ứng định tính Nhóm
hợp chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCl
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính. Dung dịch
kiềm NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid
sulfuric H2SO4 10%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron. Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có
mặt của catechin.
Tannin
Vanilin/H2SO4
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5% Gelatin/1% NaCl
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid
Bouchardat Hỗn hợp KI + I2 /HCl
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vans-Mayer Hỗn hợp HgCl2+ KI
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Polyphenol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau
* Nguyên tắc
Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo mg acid galic chuẩn.
dùng chất chuẩn là acid gallic.
* Các bước tiến hành
- Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
- Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5 mg/ml.
- Dung dịch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000 ml.
- Dung dịch mẫu cần định lượng.
- Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic
- Chuẩn bị các định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
- Cho vào mỗi cốc 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58 ml H2 O + 100 µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 µl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
- Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 µl (0,02 ml) để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
2.3.2.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) là kĩ thuật sắc kí khá nhanh gọn và tiện lợi. Nó giúp nhận biết các nhóm chất có trong mẫu nghiên cứu. Phương pháp sắc kí lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sách hệ số lưu của hỗn hợp (Rf)và hệ số lưucủa một số chất đã biết [3].
* Nguyên tắc
Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau với pha tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc kí). Pha tĩnh có thể là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamide.... Pha động là một hỗn hợp từ hai dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích.
* Phương pháp
Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thước phù hợp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất. Một số hệ dung môi được sử dụng:
- TEAF: 5 : 3 : 1 : 1 (Toluen - ethylacetate - acetone - acid formic). - Toluen: etylaxetate: acid focmic = 5 : 4 : 1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Etylaxetat: acid focmic: nước = 8 : 1 : 1.
- Dùng ống vi quản để chấm mẫu lên bản sắc ký. Mẫu chấm phải nhỏ gọn, không để lan rộng, dùng máy sấy làm khô ngay. Chấm lặp lại nhiều lần. - Tiến hành chạy sắc ký: cho bản sắc ký vào bình sắc ký đã chứa sẵn
dung môi triển khai. Đặt bản sắc ký vào gờ nhỏ ở đáy bình. Đậy nắp bình, dung môi sẽ thấm lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần hoạt chất của mẫu. Chấm dứt chạy mẫu khi dung môi thấm đến 2/3 bản sắc ký.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
- Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%: sau khi tiến hành chạy sắc ký, cho bản sắc ký vào dung dịch H2SO4 10% để lên màu, hơ nguội trên ngọn lửa đèn cồn, quan sát và đánh giá. Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b. Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi.
2.3.3. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Trong nghiên cứu bào chế, thử nghiệm thuốc và các chế phẩm tự nhiên giai đoạn tiền lâm sàng, việc thử độc cấp tính có vai trò quan trọng trong đánh giá hiệu lực an toàn của thuốc và phương hướng dùng liều cho các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình hay là liều làm chết 50% số động vật thí nghiệm (LD50) trong những điều kiện nhất định. Chỉ số LD50 là cơ sở để đánh giá độc tính của thuốc, liều dùng thí nghiệm dược lý một cách đúng đắn.
Xác định LD50 của dịch chiết cây Diệp Hạ Châu bằng đường uống theo phương pháp Lorke [15]. Chuột nhịn đói trước 12 giờ thí nghiệm và được phân lô ngẫu nhiên với số lượng 10 con mỗi lô, cho uống theo liều tăng dần lên đến mức tối đa là 8 g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết cây Diệp Hạ Châu.
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ cây Diệp Hạ Châu
(Phyllanthus urinaria (L.))
Hình 3.1. Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.))
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Với quy trình chiết rút trên chúng tôi đã thu được hiệu suất các phân đoạn dịch chiết từ 3000 g cây Diệp Hạ Châu như sau:
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ cây Diệp Hạ Châu
(Phyllanthus urinaria (L.))
Phân đoạn Mẫu ban đầu (g) Hiệu suất chiết rút (%)
Cao ethanol 325,81 10,86
Cao n - hexan 64,52 2,15
Cao chloroform 27,46 0,94
Cao ethylacetate 38,15 1,27
PĐ nước 52,37 1,75
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (10,86%) so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu là 3000g, tiếp đến là cao phân đoạn n - hexan (2,15%), cao phân đoạn nước (1,75%), cao phân đoạn ethylacetate (1,27%) và thấp nhất là cao phân đoạn chloroform (0,94%). Kết quả này cho thấy trong dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên.
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên của cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) Châu (Phyllanthus urinaria (L.))
3.2.1. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.))
Nhằm góp phần xác định thành phần hóa học của cao các phân đoạn EtOH, phân đoạn n-hexan, CHCl3 và phân đoạn EtOAc từ dịch chiết của cây Diệp Hạ Châu chúng tôi tiến hành các phản ứng hóa học với một số thuốc thử đặc trưng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.))
Nhóm chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng đặc trƣng
Mẫu
EtOH n - hexan chloroform ethylacetate Nƣớc
Flavonoid Shinoda +++ ++ +++ ++ + Diazo +++ ++ ++ ++ + H2SO4 đặc +++ ++ ++ + + Vanilin/HCl(đ) +++ + +++ ++ + Tannin Vanilin +++ + ++ ++ + Gelatin/NaCl +++ ++ ++ + - Acetate chì ++ + ++ + + Polyphenol khác NaOH 10% ++ + + - - FeCl3 5% +++ ++ +++ ++ + Glycoside Keller-Killian - - - - - Alkaloid Vans-Mayer ++ ++ ++ ++ - Dragendroff ++ + ++ ++ + Bouchardat +++ ++ ++ + + Chú thích: (-): Không phản ứng (++): Phản ứng mạnh (+): Phản ứng (+++): Phản ứng rất mạnh
Từ kết quả các phản ứng định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong dịch chiết của cây Diệp Hạ Châu khá phong phú, có các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến. Cao của cả 5 phân đoạn EtOH, n-hexan, CHCl3, EtOAc và phân đoạn nước đều chứa hầu hết flavonoid, tannin, alkaloid nhưng không chứa glycoside. Điều này chứng tỏ đây là những dung môi khá phù hợp để chiết rút các hợp chất thứ sinh từ dịch chiết của cây Diệp Hạ Châu. Căn cứ
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
vào mức độ phản ứng cho thấy ở cao phân đoạn EtOH và cao phân đoạn CHCl3, chứa hàm lượng rất lớn các nhóm chất flavonoid, tannin, alkaloid trong khi cao phân đoạn n - hexan chứa các chất này với hàm lượng ít hơn, cao phân đoạn nước cũng chứa tương đối đầy đủ các nhóm chất flavonoid, tannin, alkaloid (trừ phản ứng với Gelatin/NaCl, NaOH 10% và phản ứng Mayen) nhưng với hàm lượng ít nhất. Ở cả 5 phân đoạn cao EtOH, n-hexan, CHCl3, EtOAc và phân đoạn nước đều chứa nhiều polyphenol, đặc biệt là cao EtOH và CHCl3 có mức phản ứng rất mạnh. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch
chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.)) bằng sắc ký lớp mỏng.
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 ở hệ dung môi n - hexan : Ethylacetate (2 : 1)
Kết quả sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch có màu sắc khác nhau.
Hình 3.2. Chạy sắc kí bản mỏng của dịch chiết Diệp Hạ Châu
(Phyllanthus urinaria (L.))
Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Qua quan sát trên sắc ký đồ, chúng tôi nhận thấy các phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp hạ châu có nhiều vạch băng với nhiều màu sắc khác nhau. Vạch càng đậm thì các chất có nồng độ càng cao, vạch nhạt thì các chất có nồng độ càng thấp. Trên sắc kí đồ xuất hiện khá nhiều băng vạch màu vàng (đặc trưng của flavonoid), màu nâu (đặc trưng cho dầu béo), màu xanh (diệp lục). Quan sát trên sắc kí đồ chúng tôi nhận thấy phân đoạn cao EtOH xuất hiện nhiều băng vạch nhất, các phân đoạn còn lại chứa ít băng vạch hơn.
3.2.3. Định lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết từ cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria (L.))