7. Những đóng góp mới của đề tài
2.2.2.Khảo sát sơ bộ thành phần của hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L.)
ngâm với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong vòng 14 ngày (quá trình đƣợc lặp lại 3 lần). Gộp dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất loại dung môi dƣới bóng điện 220V - 200W chúng tôi thu đƣợc cao tổng số ethanol. Cao tổng số đƣợc bớt lại một phần (20%) để làm các thí nghiệm tiếp theo. Phần còn lại đƣợc hòa tan trong nƣớc ấm và chiết lần lƣợt với các dung môi n - hexan, chloroform, ethylacetate. Tiếp theo cất loại dung môi dƣới bóng điện 220V - 200W thu đƣợc các cao phân đoạn dịch chiết tƣơng ứng.
2.2.2. Khảo sát sơ bộ thành phần của hạt loài đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) Wilczek)
2.2.2.1. Thử định tính Flavonoid
Lấy mẫu thử pha trong ethanol với một lƣợng thích hợp, cho thêm vài giọt acid chlohidric đặc để tạo thành dung dịch thử, sử dụng cho các phản ứng sau:
- Phản ứng Shinoda: lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử
+ Ống 1: dùng làm đối chứng.
+ Ống 2: thêm vài mảnh Mg, đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng thấy có màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
- Phản ứng diazo hóa: lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử
20
+ Ống 2: thêm vài giọt diazo. Kết quả cho màu da cam là phản ứng dƣơng tính.
- Phản ứng với acid sulfuric: lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử
+ Ống 1: dùng làm đối chứng
+ Ống 2: thêm vài giọt acid sulfuric. Phản ứng có màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
2.2.2.2. Thử định tính tannin.
- Phản ứng vanillin: lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử
+ Ống 1: dùng làm đối chứng
+ Ống 2: thêm vài giọt vanillin/ H2SO4. Phản ứng dƣơng tính khi dung dịch thu đƣợc có màu đỏ đậm.
- Phản ứng Gelatin/1%/NaCl: cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dƣơng tính khi trong dung dịch xuất hiện kết tủa.
- Phản ứng với Acetate chì 10%: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa [2], [3], [13].
2.2.2.3. Thử định tính với alkaloid.
Hòa tan 0,01g dịch chiết vào trong 1ml H2SO4 lọc qua giấy lọc thu đƣợc dịch lọc làm dịch mẫu. Lấy 1ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm để làm phản ứng với các thuốc thử.
- Thuốc thử Dragendorf (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): nhỏ từ từ thuốc thử vào ống nghiệm. Trong môi trƣờng acid thì alkaloid cho kết tủa da cam.
21
- Thuốc thử Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nƣớc): với hỗn hợp HgCl2 và KI trong thuốc thử Mayer sẽ phản ứng với alkaloid trong nƣớc cho kết tủa màu trắng hoặc màu vàng nhạt.
- Thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu đỏ thẫm [1], [3], [12].
2.2.2.4. Thử định tính glycoside
Phản ứng Keller - Killian:
Dung dịch A: 50ml CH3COOH 10% + 0,5ml dung dịch FeCl3 5%. Dung dịch B: 0,5ml H2SO4 10% + 0,5ml dung dịch FeCl3 5%.
Lấy 0,05g cao dịch chiết cho vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A hòa cho hết mẫu, nghiêng ống và cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện màu đỏ nâu giữa hai lớp chất lỏng.
2.2.2.5. Thử định tính Catechin
- Phản ứng vanillin: lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Ống 1: dùng làm đối chứng
+ Ống 2: thêm vài giọt vanillin/HCl. Phản ứng có màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
2.2.2.6. Thử định tính các polyphenol khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: lấy 2 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cho 1ml dung dịch thử.
+ Ống 1: dùng làm đối chứng
+ Ống 2: thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng cho kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3 1% trong nƣớc: cho vài giọt thuốc thử đã pha loãng bằng EtOH 98% vào dung dịch thử. Phản ứng dƣơng tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu lục, xanh, đen.
22
2.2.3. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin Ciocalteau.
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất pholyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bƣớc sóng λ = 765nm, dùng acid gallic làm chất chuẩn để định lƣợng polyphenol tổng số.
Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Cân 10g mỗi loại: Cao phân đoạn EtOH, phân đoạn n - hexan, phân đoạn CHCl3, phân đoạn AtOAc và hòa loãng trong EtOH 98%. Sau đó, các dung dịch trên đƣợc hòa loãng ở các nồng độ thích hợp để làm phản ứng định lƣợng.
- Dung dịch acid gallic: 0,5g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O, bảo quản lạnh. Thể tích tổng số dung dịch gốc là 100ml (cồn 90%). Nhƣ vậy, 1ml dung dịch gốc acid gallic chứa 5mg (5mg acid gallic/ml)
- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi, thêm vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nƣớc cất tới 1000ml.
Tiến hành xây dựng đƣờng đồ thị chuẩn với acid gallic nhƣ sau:
- Chuẩn bị cốc định lƣợng theo tỉ lệ 0, 1, 2, 3, 5 và 10ml, sau đó dẫn nƣớc cất tới 100ml ta thu đƣợc các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500mg/ml acid gallic
- Cho vào mỗi cốc định lƣợng 20μl mẫu thử + 1,58ml H2O + 100μl thuốc thử Folin - Ciocalteau, sau 30giây đến 8 phút cho thêm 300μl Na2CO3.
Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 20ºC rồi xác định ở bƣớc sóng 765nm. Tiến hành định lƣợng acid gallic để định lƣợng đƣờng chuẩn.
Định lƣợng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20μl (0,02ml) để định lƣợng tƣơng tự nhƣ đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
23
2.2.4. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC).
Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp hiệu quả để phân tách nhiều hợp chất hữu cơ. Hệ thống sắc ký này cũng có nguyên tắc chung của mọi hệ thống sắc ký là phân tách các chất dựa trên sự phân bố của chúng giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là chất lỏng hoặc chất khí, đẩy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng. Mẫu phân tích chứa các chất có ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh. Nếu một chất có ái lực lớn hơn với pha tĩnh thì nó di chuyển chậm trong pha tĩnh, ngƣợc lại chất có ái lực thấp trong pha tĩnh thì nó di chuyển nhanh hơn trong pha tĩnh. Khả năng hòa tan của chất trong pha động càng lớn thì chất càng di chuyển nhanh hơn do chuyển động của pha động. Nhƣ vậy, các chất khác nhau đƣợc phân tích, tách rời là do chúng có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.
Phƣơng pháp: Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) đƣợc tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC - Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thƣớc phù hợp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất. Một số hệ dung môi đƣợc sử dụng:
- TEAF: 5: 3: 1: 1 (Toluen - ethylacetate - acetone - acid formic) - Ethylacetate: acid fomic: nƣớc = 8: 1: 1
- n - hexan: acetone = 5: 2
Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều trên bản mỏng. Xác định hệ số Rf theo công thức a/b, trong đó:
a: là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu. b: khoảng di chuyển của dung môi [12].
24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ hạt loài đậu xanh
Để tìm hiểu thành phần hóa học của hạt đậu xanh và qua tham khảo các tài liệu chúng tôi lựa chọn quy trình tách chiết đƣợc mô tả nhƣ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình tách chiết hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh
Chiết phân đoạn 3 lần với EtOAc (1: 1)
Cao PĐ nƣớc (64.19g) Cao PĐ EtOAc
(15.26g)
Loại dung môi
Loại dung môi
Phân lớp CHCl3 Phân lớp nƣớc
Cao PĐ CHCl3
(21.07g)
Phân lớp EtOAc Phân lớp nƣớc Loại dung môi
HẠT ĐẬU XANH (3000g)
Cao cồn tổng số (186.71g)
Phân lớp n - hexan Phân lớp nƣớc
Cao PĐ n - hexan (33.28g) Để lại 20% (37.34g)
cao cồn tổng số
Ngâm kiệt 3 lần với EtOH, lọc thu dịch chiết, cô loại dung môi
Hòa tan trong nước, chiết phân đoạn 3 lần với n - hexan (1: 1)
Loại dung môi Chiết phân đoạn 3 lần với CHCl3 (1: 1)
25
Quy trình tách chiết các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh đƣợc thực hiện nhƣ sau: Ngâm 3000g bột mịn hạt đậu xanh trong 10 lít cồn 96% trong vòng 2 tuần ở nhiệt độ phòng, sau đó cất lại dung môi. Tiếp tục cho cồn vào cất lại lần 2 nữa, cô loại dung môi thu đƣợc 186.71g cao cồn tổng số. Chúng tôi để lại 20% (37.34g) cao cồn để làm các thí nghiệm tiếp theo. Phần còn lại hoà tan vào nƣớc ấm, chiết 3 lần qua dung môi n - hexan theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Lấy phân lớp n - hexan đi cô loại dung môi đƣợc 33.28g cao phân đoạn n - hexan. Phân lớp nƣớc còn lại hoà tan với chloroform theo tỷ lệ 1:1 về thể tích (lặp lại 2 lần nữa), thu phân lớp chloroform cô loại dung môi đƣợc 21.07g cao phân đoạn chloroform. Phân lớp nƣớc tiếp tục đem hoà tan với ethylacetate (lặp lại 2 lần nữa), thu phân lớp ethylacetate cô loại dung môi đƣợc 15.26g cao phân đoạn ethylacetate. Cuối cùng cô cạn lớp nƣớc còn lại thu đƣợc 64.19g cao phân đoạn nƣớc.
Với quy trình chiết rút nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ hạt đậu xanh nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ hạt đậu xanh
Phân đoạn Mẫu ban đầu
(g)
Hiệu suất chiết rút (%) Cao PĐ ethanol 186.71 6.22 Cao PĐ n - hexan 33.28 1.1 Cao PĐ chloroform 21.07 0.7 Cao PĐ ethylacetate 15.26 0.5 Cao PĐ nƣớc 64.19 2.14
Căn cứ vào kết quả thực nghiệm thu đƣợc, chúng tôi nhận thấy rằng hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn ethanol (6.22%) so với khối lƣợng nguyên liệu khô ban đầu là 3000g, tiếp đến là cao phân đoạn nƣớc (2.14%),
26
cao phân đoạn n - hexan là (1.1%), cao phân đoạn chloroform (0.7%) và thấp nhất là ở cao phân đoạn ethylacetate (0.5%). Kết quả này cho thấy trong hạt đậu xanh có chứa một lƣợng lớn các hợp chất tự nhiên. Khối lƣợng cao các phân đoạn thu đƣợc đủ để chúng tôi thực hiện các phản ứng định tính, định lƣợng.
3.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài đậu xanh. hạt loài đậu xanh.
Nhằm xác định các hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết các phân đoạn EtOH, n - hexan, CHCl3, AtOAc, nƣớc từ hạt loài đậu xanh. Chúng tôi tiến hành thử định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trƣng. Kết quả định tính đƣợc trình bày ở bảng 3.2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết hạt đậu xanh
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu Cao PĐ EtOH Cao PĐ n - hexan Cao PĐ CHCl3 Cao PĐ EtOAc Cao PĐ Nƣớc Flavonoid Shinoda ++ + ++ ++ + Diazo ++ + + + - H2SO4 đặc +++ + ++ + - Catechin Vanilin/HCl(đ) ++ - + - - Tannin Vanilin + + + - + Gelatin/NaCl + + + + + Acetat chì + - - + - Polyphenol khác NaOH 10% ++ + + + + FeCl3 5% ++ + + - + Glycoside Keller-killian + + + + +
27 Alkaloid
Mayer + - - + -
Dragendroff + + + - -
Bouchardat + - ++ + -
(Ghi chú: (+): Các mức phản ứng dương tính, (-): Phản ứng âm tính; Mức độ phản ứng được thể hiện bằng số dấu cộng)
Từ bảng 3.2 cho thấy trong thành phần hạt đậu xanh có chứa các hợp chất tự nhiên khác nhau nhƣ flavonoid, alkaloid, glycoside và một số polyphenol khác. Flavonoid có phản ứng dƣơng tính ở tất cả các phân đoạn, chứng tỏ trong hạt đậu xanh có chứa nhiều nhóm hợp chất này. Đặc biệt hai phân đoạn cao cồn và cao chloroform có chứa tƣơng đối đầy đủ các nhóm hợp chất và có hàm lƣợng lớn hơn so với các phân đoạn khác do cho phản ứng mạnh với thuốc thử. Còn ở cao phân đoạn n - hexan, ethylacetate và cao phân đoạn nƣớc cho thấy có mặt của nhiều nhóm chất nhƣ flavonoid, catechin, tannin nhƣng với hàm lƣợng thấp vì nhiều phản ứng vẫn cho kết quả âm tính.
Nhƣ vậy hai phân đoạn cao cồn tổng số và phân đoạn chloroform chứa nhiều hợp chất polyphenol nhƣ flavonoid, tannin… là những chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thƣ…
3.3. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phƣơng pháp Folin - Ciocalteau.
3.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bƣớc sóng 765nm. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
28
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic
TT Acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hình 3.2. Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic
y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) O D 7 6 5 n m
29
3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Bảng 3.4. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh Mẫu OD765nm Hàm lƣợng Polyphenol (mg/l) Tỷ lệ polyphenol (%) Cao EtOH 0.437 424.2 4.242 Cao n - hexan 0.083 70.2 0.702 Cao CHCl3 0.261 248.2 2.482 Cao EtOAc 0.097 84.2 0.842 Cao nƣớc 0.034 21.2 0.212
Từ kết quả bảng định lƣợng 3.4 cho thấy rằng, hàm lƣợng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn nƣớc là thấp nhất (0.212%). Ở phân đoạn cao cồn hàm lƣợng polyphenol tổng số chiếm tỉ lệ cao nhất (4.242%) sau đó đến phân đoạn cao chloroform (2.482%). Trong khi đó phân đoạn n - hexan và EtOAc có hàm lƣợng polyphenol gần tƣơng đƣơng nhau (chiếm 0.702% và 0.842% tƣơng ứng). Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong hạt đậu xanh có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong ethanol và chloroform. Hàm lƣợng polyphenol tổng số chiếm tỷ lệ nhiều nhất trong cao phân đoạn ethanol. Đồng thời kết quả định lƣợng này cũng hoàn toàn phù hợp với mức độ các phản ứng định tính ở trên.
3.4. Phân tích thành phần các chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh bằng sắc ký lớp mỏng. chiết từ hạt đậu xanh bằng sắc ký lớp mỏng.
Chúng tôi tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua thăm dò cho thấy hệ
30
dung môi (n - hexan : Acetone) = 5 : 2 là cho kết quả rõ nét nhất và đƣợc chúng tôi lựa chọn. Kết quả thể hiện trên ảnh sắc ký đồ hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh chạy sắc ký đồ dịch chiết hạt đậu xanh
Nhìn trên ảnh sắc ký ta thấy xuất hiện rất nhiều các băng vạch khác nhau về màu sắc và Rf. Về mặt lý thuyết thì mỗi băng vạch tƣơng ứng với một chất nhất định, nhƣng trên thực tế có nhiều chất cùng Rf, thậm chí cùng màu sắc nằm gối lên nhau nên mỗi vạch đƣợc coi là có ít nhất một chất trong nó. Vạch nào càng đậm thì các chất có nồng độ cao, vạch càng nhạt thì các chất có nồng độ càng nhỏ.
Ghi chú :
1. Cao phân đoạn nƣớc 2. Cao phân đoạn n-hexan 3. Cao phân đoạn EtOAc 4. Cao phân đoạn EtOH 5. Cao phân đoạn CHCl3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
31
Bảng 3.5. Đặc điểm các băng vạch của các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu xanh
STT Cao EtOH
Cao n -
hexan Cao CHCl3 Cao EtOAc Cao nƣớc Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu
1 0.31 Vàng 0.29 Xanh nhạt 0.26 Nâu 0.34 Vàng 0.29 Xanh nhạt 2 0.34 Xanh nhạt 0.30 Vàng nhạt 0.34 Xanh 0.28 Nâu 0.39 Vàng nhạt 3 0.38 Nâu 0.34 Nâu 0.59 Vàng 0.40 Vàng nhạt 0.46 Nâu 4 0.46 Vàng 0.49 Nâu 0.64 Xanh nhạt 0.45 Nâu 5 0.51 Nâu