Bài viết nghiên cứu sự phát triển và hình thái tế bào của hỗn hợp vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20; khả năng sử dụng Dioxin của hỗn hợp vi khuẩn SETDN20; sự đa dạng cảu vi sinh vật trong hỗn hợp chủng SETDN20. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung.
29(4): 64-69 12-2007 Tạp chí Sinh học nghiên cứu khả phân hủy dioxin phân loại gien mã hóa dioxin dioxygienaza Hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc setDN20 từ đất nhiễm độc hóa học đà nẵng Nguyễn Thị Sánh, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Quốc Việt, Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học Hiện nay, đất số điểm nóng quân trớc Mỹ bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ, polycloinated dibenzodioxin (PCDDs), polycloinated dibenzofuran (PCDFs) hợp chất khác Tẩy độc điểm nóng Đà Nẵng công nghệ phân hủy sinh học đợc tiến hành cho kết khả quan, phơng pháp có giá thành thấp thân thiện với môi trờng Vai trò tập đoàn vi sinh vật hiếu khí đợc nghiên cứu vi sinh vật kị khí kị khí không bắt buộc cha đợc quan tâm nhiều Vi khuẩn kị khí kị khí không bắt buộc đóng vai trò đặc biệt trình loại khử halogien hợp chất hữu chứa halogien khó phân hủy có dioxin Điều kiện trình khử loại halogien nói chung clo nói riêng đợc thực môi trờng hoạt động vi khuẩn kị khí nh: vi khuẩn khử sắt, khử sunfat, vi khuẩn sinh methan [12, 13] Từ nghiên cứu đợc công bố, thống kê đợc số loài có khả loại clo điều kiƯn kÞ khÝ: Dehalobacter, Desulfomonile, Desulfitobacterium, Dehalospirillum, Dehalobacterium, Dehalococcoides [3, 5] Phân hủy hiếu khí DD DBF diễn theo hai chế oxi hóa vị trí bên vị trí góc nhân thơm, oxi hóa vị trí góc đợc thực enzim dioxygienaza, trình chuyển hóa hoàn toàn DD DBF [1, 4] Việt Nam, công nghệ chôn lấp tích cực tổ hợp phơng pháp cô lập hấp phụ phân hủy sinh học đợc nghiên cứu đợc triển khai khử độc điểm nóng nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Tuy nhiên, để nâng cao hiệu khử độc qui trình công nghệ áp dụng rộng rãi điểm nóng khác cần có thêm hiểu biết sâu đa dạng, khả phân hủy sinh học 64 gien tham gia trình phân hủy chất độc tập đoàn vi sinh vật địa Để tìm hiểu vai trò vi sinh vật điều kiện chôn lấp tích cực mà môi trờng chủ yếu kị khí kị khí không bắt buộc, tiến hành nuôi cấy tập đoàn vi sinh vật kị khí điều kiện có oxy môi trờng Khả phân hủy chất độc đặc biệt 2,3,7,8TCDD vi sinh vật địa đợc xác định thông qua hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu khả phát triển nh khả phân hủy vi sinh vật môi trờng chứa dịch chiết đất (chứa 2,3,7,8-TCDD) đồng thời nghiên cứu đa dạng hỗn hợp chủng Sự phát gien chức dioxin dioxygenaza hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 đợc công bố báo I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Hỗn hợp chủng SETDN20 đợc phân lập phơng pháp làm giàu nhiều lần từ lô đất xử lý tẩy độc phân hủy sinh học DN100T sân bay Đà Nẵng Hỗn hợp chủng đợc nuôi điều kiện kị khí không sử dụng hỗn hợp khí N2, CO2 H2 tủ nuôi cấy kị khí chuyên dụng (có nghĩa vi sinh vật đợc nuôi điều kiện kị khí không bắt buộc) Cặp mồi sử dụng cho việc khuyếch đại đoạn gien 16S ARN ribosom phục vụ nghiên cứu đa dạng hỗn hợp chủng vi khuẩn đất b»ng kü thuËt PCR-DGGE: 341F (5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3) - có gắn kẹp GC 907R (5-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3) Cặp mồi suy diễn sử dụng nhân đoạn gien mã hóa enzim ph©n hđy dioxin : DF (5’ - TGYASNTAYCAYGGVTGG -3’), DR (5 - TBVGGNCCVYKNGGVTGCC - 3) Cặp mồi đợc sử dụng để nhân gien mã hóa cho enzim dioxin dioxygenaza (khoảng 700 bp) hỗn hợp chủng SETDN20 Cặp mồi suy diễn đợc thiết kế dựa trình tự công bố [8] đợc sử dụng để tìm hiểu gien mã hóa cho enzim dioxin dioxygenaza có mặt hỗn hợp chủng SETDN20 nuôi điều kiện kị khí không bắt buộc Kit TA Cloning(R) có vector pCR2.1, T4 ADN ligaza, tế bào khả biến E coli INVF' hãng InvitrogienTM Xác định trình tự gien máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gientic Analyzer Trình tự nucleotit đợc xử lý b»ng phÇn mỊm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 ADN Sequencing Analysis Phơng pháp a Phơng pháp ph©n lËp vi khn Ph©n lËp chđng vi khn theo phơng pháp làm giàu Mẫu đất ban đầu cha xử lý tẩy độc (mẫu đối chứng) mẫu xử lý công nghệ phân hủy sinh học đợc làm giàu môi trờng xử lý có bổ sung dịch chiết đất (tách từ đất nhiễm chất độc hóa học) làm nguồn cacbon lợng Quá trình làm giàu đợc tiến hành lần, thể tích bình nuôi cấy kị khí 125 ml, nuôi điều kiƯn tÜnh, bãng tèi ë 30oC Ngn cacbon vµ lợng sử dụng cho nghiên cứu dịch chiết đất chứa chủ yếu đồng phân 2,3,7,8-TCDD đồng phân độc với hệ số độc 1, đồng phân dioxin, furan chứa clo khác phân tích đợc Dịch chiết đất đợc tách từ mẫu đất Đà Nẵng theo phơng pháp Envirograd [7] b Nghiên cứu hình thái tế bào vi khuẩn Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn kính hiển vi ®iƯn tư qt JSML 5410 víi sù céng t¸c cđa Viện 69, Bộ T lệnh Lăng c Phơng pháp tách ADN tổng số, PCR nhân dòng đọc trình tự Tách ADN tổng số theo phơng pháp Sambrook Russel [11] nhân đoạn gien 16S ARN ribosom có độ dài khoảng 550 bp kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 907R, 341F kẹp GC Điều kiện PCR đợc tiến hành nh mô tả Nguyễn Thanh Thủy [9] với nhiệt độ gắn mồi 65oC Nhân ®o¹n gien m· hãa cho enzim dioxin dioxygenaza cã ®é dài khoảng 700 bp kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi DF, DR với thể tích 25 àl, thành phần phản ứng gồm 2,5 àl PCR buffer 10x, mM MgCl2, 0,25 mM hỗn hợp dNTPs, 20 pM loại mồi DF DR, đơn vị Taq ADN polymeraza, nhiệt độ gắn mồi 50oC Sản phẩm PCR đợc điện di gel agaroza nồng độ 0,8%, sau đợc gắn trực tiếp vào vector pCRR 2.1 nhờ T4-ADN ligaza; sản phẩm gắn đợc biến nạp vào chủng E coli INV F' chọn lọc môi trờng LB đặc có chứa 100 mg/l ampixillin, nuôi cấy 370C qua đêm Tách chiết làm ADN plasmit theo Sambrook Russel [11] d Ph ơng pháp điện di gel gradient biến tính (DGGE) để xác định mức độ đa dạng vi sinh vật tập đoàn Sau thu đợc sản phẩm PCR đảm bảo chất lợng, sử dụng phơng pháp điện di kiểm tra gel biến tính, nồng độ gel 6% với dải biến tính từ 20-70% để nghiên cứu đa dạng tập đoàn vi sinh vật [9] e Phơng pháp xác định độ tồn lu PCDDs PCDFs Sự thay đổi thành phần hóa học (PCDDs/PCDFs) mẫu đợc tách chiết phân tích theo phơng pháp EPA 8270 GC/MS (Hewlett Packard 6890 GC/MSD 5972 A víi khèi phỉ EPA 98 th− viện khối phổ, quét từ 35 đến 500 amu) so sánh với thời gian lu phổ khối lợng mẫu chất chuẩn II Kết thảo luận Sự phát triển hình thái tế bào hỗn hợp vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 65 A B Hình Sự phát triển (A) hình thái tế bào (B) hỗn hợp vi khuẩn SETDN20 Để nghiên cứu hỗn hợp chủng vi khuẩn này, sử dụng phơng pháp nuôi cấy kị khí hỗ trợ phòng nuôi cấy kị khí loại khí cần thiết SETDN20 đợc làm giàu ba lần Các chủng tách đợc khỏi hỗn hợp nên nghiên cứu hỗn hợp chủng SETDN20 Nhìn vào hình thái tế bào kính hiển vi điện tử quÐt ë h×nh ta thÊy, cã Ýt nhÊt hai loài vi khuẩn tồn loại vi khuẩn chiếm u hình thái giống nh đại diện Sarcina Khả sử dụng dioxin hồn hợp vi khuẩn SETDN20 Độ tồn lu dioxin furan dịch nuôi cấy mẫu có SETDN20 mẫu đối chứng (không có vi sinh vật) đợc trình bày bảng Bảng Khả sử dụng đồng phân PCDDs PCDDFs hồn hợp vi khuẩn SETDN20 Tên đồng phân PCDDs 2,3,7,8-TCDD 1,2,3,7,8 PeCDD 1,2,3,4,7,8 HxCDD 1,2,3,6,7,8 HxCDD 1,2,3,7,8,9 HxCDD 1,2,3,4,6,7,8 HpCDD 1,2,3,4,6,7,8,9 OCDD PCDFs 2,3,7,8 TCDF 1,2,3,7,8 PeCDF 2,3,4,7,8 PeCDF 1,2,3,4,7,8 HxCDF 1,2,3,6,7,8 HxCDF 1,2,3,7,8,9 HxCDF 2,3,4,6,7,8 HxCDF 1,2,3,4,6,7,8 HpCDF 1,2,3,4,7,8,9 HpCDD 1,2,3,4,6,7,8,9 OCDF Tổng độ độc Phần trăm phân hủy 66 Nồng độ độc tơng đơng (pg TEQ/1 ml) Đối chứng Hỗn hợp vi khuẩn kị khí vi sinh vật SETDN20 4272,774 13,876 0,22 0,956 0,566 0,356 0,89 3506,466 11,476 0,177 0,834 0,495 0,307 0,737 8,433 0,040 0,923 0,098 0,036 0,031 0,038 0,002 4299,243 7,313 0,037 0,744 0,082 0 0,038 0,031 0,001 3528,742 17,9% Hỗn hợp chủng SETDN20 sau 60 ngày nuôi cấy môi trờng xử lý có bổ sung dịch chiết đất loại bỏ 17,9% tổng độ độc, 2,3,7,8-TCDD giảm từ 4299,243 pg TEQ/ml xng cßn 3528,742pg TEQ/ml So víi mét số chủng vi sinh vật có khả phân hủy dioxin hiếu khí công bố nh Streptomyces danangiensis XKDN19 có khả phân hủy 85,97% lợng 2,3,7,8-TCDD sau 14 ngày với hàm lợng ban đầu 333 pg/ml [6] khả phân hủy hỗn hợp chủng SETDN20 thấp nhiều Bên cạnh đó, chủng thuộc chi Nocardiopsis Bacillus megaterium đợc phân lập từ đất trang trại có khả phân hủy 2,3,7,8-TCDD nồng độ ppb [10] Tuy nhiên dioxin hòa tan nớc thấp, tích tụ nhiều trầm tích thiếu oxy, phân hủy dioxin điều kiện hiếu khí có ý nghĩa VÝ dơ nh− chđng vi khn kÞ khÝ Dehalococcoid CBDB1 đợc phân lập từ trầm tích có khả chuyển hóa 1,2,3-TrCDD 1,3,4-TrDD để tạo thành hợp chất độc Sau 57 ngày nuôi cấy điều kiện kị khí 60% lợng 1,2,3-TrCDD nồng độ ban đầu 25 àM 37% lợng 1,3,4-TrCDD nồng độ ban đầu 60 àM chuyển hóa thành 2-MCDD [2] Các kết nghiên cứu khả sử dụng dioxin cho thấy, SETDN20 thuộc vi sinh vật sử dụng nguồn chất độc nh nguồn cacbon lợng Nh vậy, hỗn hợp chủng SETDN20 có khả sử dụng dioxin chủ yếu đồng phân 2,3,7,8-TCDD thực có ý nghĩa nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ tẩy độc dioxin Vì vậy, hỗn hợp chủng đợc sử dụng để nghiên cứu đa dạng gien chức dioxin dioxygenaza Sự đa dạng vi sinh vật hỗn hợp chủng SETDN20 Bằng quy trình tách chiết ADN Sambrook Russel (2001), thu nhận đợc ADN tổng số hỗn hợp chủng SETDN20 đủ số lợng chất lợng đợc dùng cho nghiên cứu Sản phẩm ADN thu đợc làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gien 16S ARN ribosom có độ dài khoảng 550 bp kỹ thuật PCR nh mô tả phần phơng pháp sản phẩm PCR đợc điện di kiểm tra gel biến tính DGGE để nghiên cứu đa dạng hỗn hợp chủng Kết gel cho ta thấy, có băng khác hỗn hợp chủng thể hình (giếng số 7) Hình ảnh điện di gel gradient biÕn tÝnh (Denature gradient gel electrophoresis - DGGE) mẫu hỗn hợp chủng SETDN20 giếng cuối (số 7) (các giếng 1-6 kết mẫu khác) 67 Nh quan sát dới kính hiển vi điện tử quét nhìn thầy có hai loài, dùng phơng pháp điện di gel gradient biến tính cho ta thấy rõ có mặt loài hỗn hợp chủng, gồm có băng tơng ứng với ba loài khác Cần có nghiên cứu xác định trình tự nucleotit để biết tên vị trí phân loại băng Trong hỗn hợp chủng kị khí không hoàn toàn có khả sử dụng dioxin, vai trò hỗn hợp nh nào? Trớc tiên nghiên cứu gien mã hóa cho enzim dioxin dioxygenaza hỗn hợp SETDN20 cặp mồi DR, DF a Nhân dòng xác định trình tự gien dioxin dioxygienaza SETDN20 Nh phần phân lập mẫu nghiên cứu đa dạng đề cập, SETDN20 hỗn hợp gồm chủng mà cha thể tách làm thành chủng đơn đợc Nhng hỗn hợp chủng lại có khả phân hủy dịch chiết từ đất nhiễm dioxin (chủ yếu thành phần 2,3,7,8-TCDD), tiến hành xác định gien mã hóa cho enzim dioxin dioxygenaza hỗn hợp chủng SETDN20 ADN tổng số hỗn hợp chủng SETDN20 sau tách chiết làm đợc dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gien mã hóa dioxin dioxygenaza với cặp mồi mồi DF DR nh nêu phần phơng pháp MK Sản phẩm PCR thu đợc có kích thớc khoảng 700 bp đặc hiệu (hình 3, giếng 1, 2) Sau đó, sản phẩm PCR đợc gắn vào vector pCR 2.1 biến nạp vào tế bào E.coli INV F Sản phẩm đợc kiểm tra enzim giới hạn EcoRI Kết rằng, băng ADN có kích thớc khoảng 700 bp đợc phát Để khẳng định rõ điều ADN plasmit có mang đoạn gien 16S ARN ribosom cã kÝch th−íc kho¶ng 700 bp (s¶n phÈm PCR) đợc sử dụng làm khuôn chạy lại PCR điệu kiện phản ứng nh lần đầu Kết nhận đợc đoạn ADN (sản phẩm PCR) có kích thớc nh ban đầu khoảng 700 bp (hình 3, giếng 2) ADN plasmit có mang sản phẩm PCR nh mong muốn đợc chọn để tách làm lợng lớn phục vụ cho đọc trình tự Trình tự gien dioxin dioxygenaza SETDN20 đợc xác định máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyse, sư dơng bé Kit BibDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kết nhận đợc đoạn trình tự nucleotit khoảng 700 bp rõ ràng Trình tự đoạn gien đợc đa vào khung đọc mở (ORF) để dịch mã trình tự axit amin Trình tự đợc so sánh với trình tự axit amin Ngân hàng Protein giới EMBL Kết cho thấy enzim có độ tơng đồng cao với nhóm enzim phenylpropionate dioxygenaza (99%) Điều chứng tỏ, hỗn hợp vi khuẩn SETDN20 có mang nhóm gien mã hóa cho enzim dioxin dioxygenaza mà quan tâm công nghệ tẩy độc dioxin III KÕt luËn 750 bp 500 bp H×nh Điện di đồ sản phẩm PCR gien mã hóa cho enzim dioxin deoxygienaza ë SETDN20 MK Marker ph©n tư 1kb; giếng sản phẩm PCR lần 1; giếng sản phẩm PCR lần 68 Hỗn hợp chủng SETDN20 bao gồm loài khác có khả phát triển nguồn dịch chiết đất với hàm lợng cao điều kiện kị khí không bắt buộc Sau hai tháng nuôi tĩnh nhiệt độ 30oC, hỗn hợp chủng SETDN20 loại bỏ 17,9% tổng độ độc có 2,3,7,8-TCDD Trong hỗn hỵp chđng SETDN20 chøa gien m· hãa enzim dioxin dioxygenaza Enzim có độ tơng đồng cao với nhóm enzim phenylpropionate dioxygienaza (99%) điều kiện kị khí không bắt buéc, gien m· hãa cho c¸c enzim dioxygenaza tham gia vào trình cắt vòng thơm có mặt Lời cảm ơn: kinh phí thực công trình thuộc đề tài độc lập cấp nhà nớc Chơng trình 33 giai đoạn 2001-2004 Chúng xin chân thành cảm ơn hợp tác Trung tâm XLMT, thuộc Bộ T lệnh Hóa học cộng tác đồng nghiệp Viện Công nghệ Sinh học Mai Anh Tuấn., 2005: Luận văn Thạc sĩ khoa học sinh học Trờng Đại học Bách khoa Hà Nội Nông Văn Hải cs., 2003: Hội thảo Khoa học Việt Nam - Hoa Kỳ phơng pháp xác định, xử lý đánh giá vùng ô nhiễm dioxin: 64-70 Hà Nội, Việt Nam Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, 2007: Tạp chí Sinh học, 29(4): 80-85 Tài liệu tham khảo Nguyễn Thanh Thủy cs., 2004: Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(3): 381-388 Armengaud J et al., 1998: J Bacteriol., 180: 3954-3966 10 Parson J P et al., 1998: Chemosphere, 37: 1915-1922 Bunge M et al., 2003: Nature., 421:357360 Field A J., 2002: Report prepared for EUROCLO 11 Sambrook J., Russell D W., 2001: Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Hiraishi A., 2003: Microbes Environ, 18: 105-125 12 Vargas C et al., 2001: Appl Microbiol Biotechnol 57: 786-790 Madigan T M et al 2000: Brock biology of Microorganism Pretice Hall International, Inc: 698-702 13 Young L Y., Cerniglia C E., 1995: John Wiley and Sons, Inc., publication: 396-398 dioxin degradating capability and the identification of gene encode for dioxin dioxygenase of Facultative Anaerobic Bacterial mixture setdn20 from toxic chemicals contaminated soils in danang Nguyen Thi Sanh, Nghiem Ngoc Minh, Nguyen Quoc Viet, Dang Thi Cam Ha Summary The facultative bacterial mixture SETDN20 were isolated from 100 DNT biotreatment in toxic chemical contaminated site of Danang former military base This bacterial mixture grews well in treated media that added soil extract This soil extract not only contains 2,3,7,8-tetracloodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) but also contain the other chlorinated congeners such as polychlorinated dibenzodioxin (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs) The SETDN20 grews well at temperature 30oC in treated media which added soil extract and SETDN20 was able to remove 17.9% total toxicity The diversity of bacterial mixture SETDN20 was studied base on the observer under TEM and DGGE (Denature gradient gel electrophoresis) techniques and showed that there are three diffirent strains Results of encoding dioxin dioxygenase gene (with approximately 700 bp in lengh) and the deduced amino acid sequence analysis and comparison to those in the EMBL databases showed that enzyme was high homology (~99% identity) to some representative of phenylpropionate dioxygienase The preliminary results obtained indicate that SETDN20 may play certain role in dioxin degradation in facultative anaerobic condition which samely with condition of detoxification treatment by “active land fill” on the spot Ngµy nhËn bµi: 18-6-2007 69 ... triển hình thái tế bào hỗn hợp vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 65 A B Hình Sự phát triển (A) hình thái tế bào (B) hỗn hợp vi khuẩn SETDN20 Để nghiên cứu hỗn hợp chủng vi khuẩn này, sử dụng... cấy kị khí hỗ trợ phòng nuôi cấy kị khí loại khí cần thiết SETDN20 đợc làm giàu ba lần Các chủng tách đợc khỏi hỗn hợp nên nghiên cứu hỗn hợp chủng SETDN20 Nhìn vào hình thái tế bào kính hiển vi. .. SETDN20 Nh phần phân lập mẫu nghiên cứu đa dạng đề cập, SETDN20 hỗn hợp gồm chủng mà cha thể tách làm thành chủng đơn đợc Nhng hỗn hợp chủng lại có khả phân hủy dịch chiết từ đất nhiễm dioxin (chủ