Bài viết trình bày kết quả phân lập gien LTP, gien mã hóa Protein vận chuyển Lipit ở cây đậu xanh địa phương của tỉnh Cao Bằng. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
31(1): 92-96 3-2009 Tạp chí Sinh học PHÂN LậP GiEN M HóA PRôTêIN VậN CHUYểN LIPíT CÂY ĐậU XANH NGUYễN Vũ THANH THANH Trờng đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên CHU HOàNG MậU Đại học Thái Nguyên C¸c protein vËn chun lipÝt LTP (Lipid Transfer Proteins - LTP) protein có liên quan tới dặc tính chịu khô hạn thực vật LTP có khối lợng phân tử khoảng 9,12 kDa có phân tử xystein làm nhiệm vụ tạo cầu nối đisulfit [5] LTP có khả xúc tác tới vận chuyển phốtpholipit lớp màng tế bào [2, 3] hỗ trợ việc tạo lớp sáp lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng đáp ứng lại thay đổi môi trờng [3, 5] Trong năm gần đây, có nhiều công trình nghiên cứu phân lập gien LTP từ c©y Arabidopsis thaniana L [1], Zea mays L [8], Triticum L [7], Vigna radiata L [6] vµ Oryza sativa L [9] Dựa vào trình tự gien m hoá protein LTP đ công bố Ngân hàng gien Quốc tế với m số AY300807, đ thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gien m hoá protein LTP cđa ®Ëu xanh b»ng kü tht PCR, nh»m phơc vụ cho việc nghiên cứu giống đậu xanh có khả chống chịu với điều kiện bất lợi môi trờng Đoạn gien LTP đợc nhân lên phơng pháp PCR sau gắn vào véctơ pBT, dòng hoá đọc trình tự nuclêôtít gien Bài báo trình bày kết phân lập gien LTP đậu xanh địa phơng tỉnh Cao Bằng I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu Giống đậu xanh địa phơng Cao Bằng (kí hiệu CB) có đặc điểm: chống chịu tốt, vỏ hạt màu xanh bóng, khối lợng 1000 hạt khoảng 30,50 g Cặp mồi đặc hiệu sử dụng để nhân gien LTP có trình tự nuclêôtít nhiệt độ gắn mồi đợc 92 trình bày bảng 1: Bảng Cặp mồi nhân gien LTP Mồi Trình tự mồi (5 -3 ) Xuôi atggctagcctgaaggttgc Ngợc ttacttgatgttagcgcagtt Nhiệt độ gắn mồi 56oC 56oC Phơng pháp ADN tổng số đợc tách chiết theo phơng pháp Gawel Jarnet (1991) có cải tiến [4] Nhân gien LTP kỹ thuật PCR PCR đợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng 50 àl gồm: ADN mẫu (50 ng/µl) µl, måi (10 pM) µl, dNTP (2,5 mM) µl, MgCl2 (25 mM) µl, Taq polymeraza (5 unit/µl) 0,8 µl, buffer PCR (10X) µl, H2O khử ion 27,2 àl Chu trình nhiệt bao gồm b−íc sau: 94oC - phót; 94oC - 50 gi©y, 56oC - phót, 72oC - 30 gi©y lặp lại 30 chu kì; 72oC - 10 phút lu giữ 4oC Sản phẩm PCR gien LTP đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% Gien đợc làm Kit h ng Bioneer gắn trực tiếp vào véctơ pBT, sau đợc biến nạp vào tế bào khả biến E coli chđng DH5α T¸ch plasmit mang gien LTP phơc vơ cho ®äc tr×nh tù gien b»ng bé Kit AccuPrep Plasmid Extraction h ng Bioneer Trình tự nuclêôtít gien LTP đợc xác định máy đọc trình tự nuclêôtít tự ®éng ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer cña h ng Ampplied Biosystem Kết đọc trình tự gien đợc xử lý phần mềm DNAstar BioEdit II KếT QUả Và THảO LUậN Kết PCR nhân gien LTP Dựa sở liệu khai thác từ Ngân hàng gien Quốc tế với m số AY300807, đ thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân phát có mặt gien LTP giống đậu xanh địa phơng CB Đoạn gien LTP đợc nhân từ ADN tổng số phơng pháp PCR Kết điện di đợc thể hình Hình cho thấy, đ nhân đợc đoạn ADN đặc hiệu có kích thớc khoảng 350 bp, hàm lợng sản phẩm đủ lớn để thực cho nghiên cứu Độ dài đoạn ADN vừa nhân đợc phù hợp với lý thuyết thiết kế mồi chiều dài tơng tự nh với gien LTP đ đăng ký Ngân hàng gien với m sè AY300807 M 350 bp 250 bp H×nh Hình ảnh điện di kết nhân gien LTP M Marker 1kb M 500 bp 474 bp H×nh KÕt điện di sản phẩm colony - PCR M Marker Kb Tách dòng gien LTP Vì sản phẩm PCR có sản phẩm phụ nên đ tiến hành gel để thu nhận đoạn gien mong muốn trớc biến nạp Quá trình tách dòng đợc thực nh sau: gắn sản phẩm PCR sau đợc tinh vào véctơ tách dòng pBT, đợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E coli DH5 Sau cấy trải môi trờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl agar) có kháng sinh ampixilin (100 mg/ml), IPTG (0,1 mM) vµ X - gal (40 mg/ml), ñ hép lång petri ë 37oC 16 giê Kết thu đợc có khuẩn lạc màu xanh màu trắng (hình 2) Chọn khuẩn 93 lạc có màu trắng chuyển sang nuôi môi trờng có LB lỏng (có bổ sung ampixilin 100mg/ml) qua đêm Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phảm chọn dòng PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có mang gien mong muốn Sản phẩm colony - PCR đợc kiểm tra điện di gel agaroza 0,8% ®Ưm TAE 1X, nhm gel ethidium bromit 1% chụp ảnh dới ánh sáng đèn cực tím (hình 2) Hình Kết điện di tách plasmit mang gien LTP cđa gièng ®Ëu xanh CB pUC mồi thiết kế chung cho véctơ tách dòng nên kiểm tra sản phẩm PCR vừa dòng hóa kích thớc đoạn gien cao 124 bp Điều có nghĩa kích thớc đoạn gien vừa nhân khoảng 474 bp Kết điện di hình cho thấy, sản phẩm colony PCR từ AY300807 CB AY300807 CB AY300807 CB AY300807 CB AY300807 CB 94 khuẩn lạc màu trắng cho kết dơng tính với băng Các băng kích thớc dự đoán Sau kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiếp tục tiến hành tách plasmit Sản phẩm tách plasmit đợc kiểm tra điện di gel agaroza 0,8% đệm TAE 1X, nhuộm gel ethidium bromit 1% chụp ảnh dới ánh sáng đèn cực tím (hình 3) Kết điện di cho thấy sản phẩm tách plasmit sạch, đảm bảo chất lợng số lợng phục vụ cho việc xác định trình tự nuclêôtít Kết xác định trình tự nuclêôtít Để xác định xác trình tự nuclêôtít gien LTP, tiến hành đọc trình tự nuclêôtít gien LTP máy đọc tự động ABI PRISM@ 3100 Avant Genetic Analyzer Kết đọc trình tự đợc đem phân tích, xử lý phần mềm BioEdit Sau xử lý kết đọc trình tự nuclêôtít cho thấy, chiều dài gien LTP giống đậu xanh CB có kích thớc 351 nuclêôtít Khi so sánh trình tự BLAST NCBI, kết cho biết trình tự gien m hoá LTP đậu xanh Từ kết xác định trình tự trên, so sánh trình tự gien LTP giống CB với trình tự giống đậu xanh Ngân hàng gien Quốc tế có m số AY300807 Kết hình cho thÊy, gien LTP cđa hai gièng ®Ëu xanh có độ tơng đồng cao (chỉ sai khác nuclêôtít vị trí 276, 302, 313, 314) | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT | | | | | | | | | | AY300807 CB AY300807 CB AY300807 CB 260 270 280 290 300 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA 351 A A Hình So sánh trình tự nuclêôtít gien LTP giống đậu xanh CB trình tự đ công bố AY300807 So sánh trình tự axit amin protein gien LTP đợc phân lập nhận thấy, có hai vị trí sai khác vị trí 101 (N thay I) vị trí 105 (K thay G) Kết đợc thể hình Sự sai khác trình tự nuclêôtít trình tự axit amin sở để có nghiên cứu nhiều giống đậu xanh so sánh hai nhóm chịu hạn tốt nhằm tìm kiếm thay đổi vị trí nuclêôtít axit amin liên quan đến tính trạng chịu hạn giống đậu xanh địa phơng Đây tiền đề tạo sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh có khả chịu hạn tốt phục vụ cho phát triển đậu xanh vùng Trung du miỊn nói phÝa B¾c AY300807 CB | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA AY300807 CB | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV AY300807 CB | | | 110 NVPYKISTFT NCANIK* IVPYWISTFT NCANIK* H×nh So sánh trình tự axit amin protein LTP giống đậu xanh CB AY300807 III KếT LUậN Đ nhân đợc gien LTP phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đợc thiết kế dựa sở liệu khai thác Ngân hàng gien Quốc tế Sản phẩm PCR đợc dòng hoá nhờ véctơ pBT Trình tự nuclêôtít đợc xác định xử lí cho kết gien LTP giống đậu xanh CB nghiên cứu dài 351 nuclêôtít Sản phẩm protein dài 116 axit amin So sánh trình tự nuclêôtít giống đậu xanh CB với giống đậu xanh có m số AY300807 Ngân hàng gien Quốc tế cho thấy gien LTP thu đợc có độ tơng đồng cao (98,8%), trình tự axit amin tơng đồng 98,2% TàI LIệU THAM KHảO Arondel V et al., 2000: Plant Science, 157: 1-12 Blein J P et al., 2002: Trends in Plant Science, 7: 293-296 Bourgis F., Kader J P., 1997: Physiol Plant, 100: 78-84 Gawel N J., Jarret R L., 1991: Genomic DNA isolation Http://www.igd.cornell.edu/ pretoria%20 lab % 20 manual.doc Kader J C., 1996: Annual Review of Plant Molercular Biology, 47: 627-654 95 Liu K H., Lin T Y., 2003: DNA Sequence-The Journal of sequencing and mapping, 14(6): 420-426 Monia A., Garcia O F., 1993: The Plant Journal, 4: 983-991 Sossountzov L et al., 1991: The Plant Cell, 3: 923-933 Vignols F et al., 1994: Gene, 142: 420-426 ISOLATION OF GENE ENCODING LTP (LIPID TRANSFER PROTEINS) FROM VIETNAMESE MUNGBEAN NGUYEN VU THANH THANH, CHU HOANG MAU SUMMARY LTP (Lipid transfer proteins) protein is associated with tolerance to drought in plant LTP have the ability to transfer phospholipids between membrane vesicles LTP is implicated in cuticle biosynthesis and thought to play a role in the protection of plant LTP are 9.12 kDa cysteine-rich cationic peptides and contain cysteine residues formed disulfide bridges [2, 3, 5] LTP have been isolated from Arabidopsis thaniana L [1], Zea mays L [8], Triticum L [7], Vigna radiata L [6] and Oryza sativa L [9] Based on the sequence of LTP gene of a mungbean cultivar in NCBI sequence database with the accession number AY300807, specific primer pair was designed to amplify the gene in a Vietnamese mungbean cultivar using polymerase chain reaction (PCR) The PCR product containing the LTP fragment was cloned in pBT vector and the sequencing of the fragment was carried out using ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Ampplied Biosystem) 351 nucleotides in length of LTP gene fragment was successfully amplified from Vietnamese mungbean cultivar The correspond a polypeptide sequence of obtained LTP gene was 116 amino acids residues Ngµy nhËn bµi: 20-5-2008 96 ... Kết PCR nhân gien LTP Dựa sở liệu khai thác từ Ngân hàng gien Quốc tế với m số AY300807, đ thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân phát có mặt gien LTP giống đậu xanh địa phơng CB Đoạn gien LTP đợc... chiều dài gien LTP giống đậu xanh CB có kích thớc 351 nuclêôtít Khi so sánh trình tự BLAST NCBI, kết cho biết trình tự gien m hoá LTP đậu xanh Từ kết xác định trình tự trên, so sánh trình tự gien. .. ACATCAAGTA 351 A A Hình So sánh trình tự nuclêôtít gien LTP giống đậu xanh CB trình tự đ công bố AY300807 So sánh trình tự axit amin protein gien LTP đợc phân lập nhận thấy, có hai vị trí sai khác vị trí