Bài viết trình bày việc góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu tơ xanh, chống nhầm lẫn với tơ hồng, nghiên cứu này tiến hành khảo sát đặc điểm vi học và hóa học, đặc biệt là nhóm aporphinoid của tơ xanh.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC APORPHINE ALKALOID TỪ CÂY TƠ XANH (CASSYTHA FILIFORMIS L.) Bùi Thế Vinh*, Đoàn Nam Trung*, Trần Cơng Luận** TĨM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu tơ xanh, chống nhầm lẫn với tơ hồng; nghiên cứu tiến hành khảo sát đặc điểm vi học hóa học, đặc biệt nhóm aporphinoid tơ xanh Đối tượng nghiên cứu: Cây tơ xanh thu hái tỉnh Long An, định danh phòng Tài nguyên Dược liệu, Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh Phân lập xác định cấu trúc kỹ thuật sắc ký kỹ thuật phổ Kết quả: Qua sắc ký cột silicagel pha thuận phân lập xác định cấu trúc aporphine alkaloid Kết luận: Phân lập xác định cấu trúc aporphine alkaloid Cassythidine Thalicminine Từ khóa: Tơ xanh, aporphine alkaloid, cassythidine, thalicminine ABSTRACT ISOLATION AND STRUCTURE IDENTIFICATION OF APORPHINOID ALKALOID FROM CASSYTHA FILIFORMIS L Bui The Vinh, Đoan Nam Trung, Tran Cong Luan* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No - 2016: 186 - 190 Objectives: This study was made to develope the marker compound contributing a standardization of this plant Materials and methods: Isolation and structural elucidation based on chromathography and spectrum technique Results: By using chromathography and spectrum technique, two aporphine alkaloid were isolated and elucidated Conclusions: Two novel aporphinoid alkaloid from Cassytha filiformis L named Cassythidine and Thalicminine were isolated by using the repeated column chromatography on total alkaloid residue Their structure was elucidated based on the NMR – spectroscopic data Key words: Cassytha filiformis L., cassythidine, thalicminine, aporphinoid alkaloid nhóm hợp chất alkaloid với cấu tạo khung ĐẶT VẤN ĐỀ aporphine Trên giới, nhóm aporphine Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) thuộc chi alkaloid tơ xanh nghiên cứu hoạt Cassytha, họ Long não (Lauraceae) Chi Cassytha tính sinh học, chúng thể hoạt tính độc tế dị biệt họ dây leo bán ký sinh có bào ung thư, kháng ký sinh trùng trypanosoma, tiêu giảm thành vảy Trong chi gồm khoảng 20 chống kết tập tiểu cầu(2,3) Ở Việt Nam, chưa tìm lồi, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, thấy nghiên cứu nhóm aporphine Australia có 15 lồi Ở Việt Nam, chi có loài alkaloid tơ xanh, nghiên cứu tiến hành tơ xanh (Cassytha filiformis L.) tơ xanh chiết tách, tinh xác định cấu trúc Cassytha capillaris Meissn.)(5,6) aporphine alkaloid từ tơ xanh, góp phần định Thành phần hóa học tơ xanh Trung tâm Sâm Dược liệu Tác giả liên lạc: DS Bùi Thế Vinh 186 ** Đại học Tây Đô ĐT: 0918 0918 64 Email: buithe_vinh@yahoo.com.vn Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 hướng cho nghiên cứu sâu hóa học hoạt tính sinh học đối tượng VẬTLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Vật liệu nghiên cứu Tơ xanh thu hái tỉnh Long An, mẫu thu thời kỳ hoa, khoảng tháng 7-8 Mẫu định danh phòng Tài nguyên Dược liệu, Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.Hồ Chí Minh Mẫu thu hái rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô xay thành bột để nghiên cứu Phương pháp Phương pháp chung: Phổ MS ghi máy HR-MS micrOTOF-Q II 10187 Phổ 1H, 13C NMR ghi máy Bruker AM500 FTNMR, đo MeOH Sắc ký lớp mỏng thực mỏng tráng sẵn silica gel 60F254 (Merck), hệ dung môi khai triển CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ (9 : : giọt) Silica gel 60 F254 (0,063-0,200 mm) (Merck) dùng sắc ký cột Chiết xuất: 4,2 kg bột tơ xanh kiềm hóa dung dịch NH4OH 15% đến pH 10 Thêm CH2Cl2 đến ngập bề mặt bột tơ xanh Ngâm khoảng 12 h, có khuấy trộn, lọc thu dịch chiết Kiểm tra diện alkaloid dịch chiết phương pháp sắc ký lớp mỏng, sau tiến hành quay giảm áp thu cao chiết, dung môi CH2Cl2 thu hồi sử dụng để chiết tiếp bã dược liệu Quy trình lặp lại dịch chiết khơng alkaloid Cao alkaloid tổng thu 380 g 100 g cao phân đoạn qua sắc ký cột (SKC) pha tĩnh diaion HP-20, rửa giải với dumg môi nước, MeOH nước 20%, 40%, 60%, 80%, 100% thu phân đoạn Phân đoạn tập trung nhiều alkaloid (MeOH 100%, 67 g) tiến hành nhiều lần SKC silica gel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với độ phân cực tăng dần (100:0; 99:1; 98:2 đến 95:5) thu khoảng 10 mg chất V2 80 mg chất V4 tinh Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chất V2 (thalicminine) Chất V2 cô lập dạng tinh thể màu vàng cam, tan CHCl3, MeOH, SKLM hệ dung môi CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ (9 : : 0,2) cho vết tắt quang UV 254 nm, hình thuốc thử Dragendorff xuất vết tròn màu cam đậm với Rf = 0.4 Biện giải kết phổ chất V2 (thalicminine) Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng ứng với diện ba nhóm proton methoxy H [3,814 (3H; s; 3-OMe); 4,026 (3H; s; 10-OMe); 4,284 (3H; s; 11-OMe)], proton methylen vùng trường thấp [H 6,223; (2H; O-CH2-O)], bốn proton methine nhân thơm H [8,123 (H-4); 8,855 (H-5); 8,35 (d; J=8,5 Hz; H-8); 7,181 (d; J=8,5 Hz; H-9)] Các liệu phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy V2 có tổng số 20 carbon cho tín hiệu phổ từ 20 ppm đến 180 ppm Trong có 12 carbon bậc IV (C) tín hiệu 181,48 nhóm ceton (C-7), carbon bậc III (CH), carbon bậc II (CH2) carbon bậc I (CH3) Tất 12 carbon bậc IV carbon bậc III dịch chuyển vùng trường thấp (δC từ 110 ppm đến 180 ppm) Có carbon bậc II [δC 101,75 ppm] đặc trưng carbon methylen dioxid O-CH2-O khung aporphine Trong nhóm methyl, có nhóm có độ dời hóa học đặc trưng nhóm methoxy [δC 61,15 ppm; δH 3,814; 3H; 3-OMe], [δC 56,10 ppm; δH 4,02; 3H; 10-OMe] [δC 60,21 ppm; δH 4,28; 3H; 11-OMe] Với liệu phổ NMR ta dự đốn V2 alkaloid có nhóm -OCH2-O-, ba nhóm -OMe, nhóm C=O nhóm –N= Tham khảo tài liệu cơng bố đặc điểm phổ NMR dự đốn V2 khung oxoaporphine Dựa vào phổ HMBC, hai proton nhóm methylen dioxid (δH 6,22) có tương tác với hai carbon bậc IV δC (137,38 149,73; C-1 C-2) 187 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Proton methoxy (δH 4,284; 3-OMe) cho tương quan với carbon bậc IV (δC 136,21), nên carbon C-3, tương tự hai carbon methoxy lại 10-OMe 11-OMe cho tương quan với carbon bậc IV (δC 145,85 δC 157,91) nên carbon C-10 C-11, cấu trúc khung oxoaporphine có proton methine nhân thơm vi trí 5; dựa phổ 1H-NMR cho tín hiệu (δH 8,12 δH 8,85), hai tín hiệu đề nghị H-4 H-5, phổ COSY cho thấy tín hiệu tương quan proton Chức C=O khung oxoaporphine đề nghị vị trí C-7 (δC 181,48) Trên phổ HMBC, tín hiệu proton methine nhân thơm (δH 8,35) cho tương quan với C-7 nên tín hiệu H-8; H-8 cho tương quan với carbon bậc IV (δC 126,85) nên carbon đề nghị C-7ª Đồng thời H-8 ghép với proton methine nhân thơm (δH 7,181; J=8,5 Hz) nên proton H-9, ghép cặp vị trí orto H-9 cho tương quan với C-10 C-11 (δC 145,85 δC 157,91) Từ kết phổ NMR chiều, kết hợp đối chiếu với tài liệu tham khảo, nhận định V2 thalicminine, alkaloid cấu tạo khung oxoaporphine Bảng Kết phổ NMR chất V2 δ (ppm), J (Hz), CDCl3, 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) Carbon 1a 1b 3a 7a 10 11 11a 3-OMe 10-OMe 11-OMe O-CH2-O 13 C-NMR 149,50 100,32 123,36 137,38 136,21 126,85 118,41 143,82 144,50 181,48 126,85 126,13 111,68 145,85 157,91 128,81 61,15 56,10 60,21 101,75 DEPT C C C C C C CH CH C C C CH CH C C C CH3 CH3 CH3 CH2 H-NMR 8,123 (br) 8,855 (br) 8,35 (d, J=8,5 Hz) 7,181 (d, J=8,5 Hz) 4,284 (s) 3,814 (s) 4,026 (s) 6,223 (s) COSY HMBC H-5 H-4 H-9 H-8 C-11; C-10; C-9; C-7a C-11; C-10; C-8 C-3 C-10 C-11 C-1; C-2 13 C-NMR Thalicminine [5] 148,6 102,9 122,2 136,4 135,9 130,6 118,9 144,2 145,2 181,2 125,1 109,4 108,1 153,9 148,9 128,2 60,2 56,2 56,1 102,2 Chất V4 (cassythidine) Chất V4 cô lập dạng tinh thể màu cam đậm, tan CHCl3, MeOH, SKLM hệ dung môi CHCl3 : MeOH : NH4OH đđ (9 : : 0,2) cho vết tắt quang UV 254 nm, hình thuốc thử Dragendorff xuất vết tròn màu cam đậm với Rf = 0.5 Hình Cơng thức cấu tạo V2 (thalicminine) 188 Biện giải kết phổ chất V4 (cassythidine) Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng ứng với diện hai nhóm proton methoxy H [4,003 (3H; s; 3-OMe)], năm nhóm proton Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 methylen có nhóm vùng trường thấp [H 6,037; H 5,952 (O-CH2-O, A; O-CH2-O, B)] [H 5,933; H 5,910 (O-CH2-O, A; O-CH2-O, B)], số nhóm lại vùng trường cao [2,630; 2,697 (H-4A; H-4B); 3,401; 2,925 (H-5A, H-5B); 2,763; 2,674 (H-7A, H-7B)], ba nhóm proton methine H [3,853 (1H;H-6), 6,707 (1H; H-8), 7,564 (1H; H-11)] Các liệu phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy A1 có tổng số 19 carbon cho tín hiệu phổ từ 20 ppm đến 150 ppm Trong có 10 carbon bậc IV (C), carbon bậc III (CH), carbon bậc II (CH2) carbon bậc I (CH3) Tất 10 carbon bậc IV dịch chuyển vùng trường thấp (δC từ 115 ppm đến 150 ppm) Trong có carbon mang dị tố oxy (δC 143,357; 135,125; 139,930; 146,511; 146,058 ppm), carbon lại nối đơi Trong số carbon bậc III có carbon vùng trường cao (δC 53,692 ppm; δH 3,853 ppm), carbon lại vùng trường thấp (105 – 115 ppm) Có carbon bậc II, có carbon bậc II xuất vùng trường thấp [δC 100,875 ppm, δH (6,037; 5,952) ppm] [δC 100,600 ppm, δH (5,933; 5,910) ppm] Đây đặc trưng nhóm methylendioxid thường gặp alkaloid chi Stephania Các carbon bậc II lại carbon mang nối đơn xuất vùng trường cao [δC 43,048 ppm; δH (3,401; 2,925) ppm], [δC 37,087 ppm; δH(2,763; 2,674) ppm] [δC 23,814 ppm; δC (2,630; 2,697) ppm] Có nhóm có độ dời hóa học đặc trưng nhóm methoxy [δC 59,469 ppm; δH (4,003; 3H) ppm] Với liệu phổ NMR ta dự đốn V4 alkaloid có hai nhóm methylen dioxid, nhóm methoxy, ba nhóm methylen, nhóm NH nhóm -OH Tham khảo tài liệu cơng bố đặc điểm phổ NMR dự đoán V4 khung aporphine Dựa vào phổ HMBC, hai proton nhóm methylen dioxid δH (6,037 5,952) có tương Nghiên cứu Y học tác với hai carbon bậc IV δC (143,357 135,125, C-1 C-2) Proton nhóm methoxy δH (4,003) tương quan với carbon bậc IV (δC 139,930) carbon bậc IV C-3 nhóm methoxy gắn vị trí C-3 Cả hai proton methylen (δH 2,630; δH 2,697) hai proton methylen (δH 2,925; δH 3,401) cho tương tác với carbon bậc IV (δC 119,158) nên dự đoán carbon bậc IV (δC 119,158) C-3a Hơn nữa, hai proton methylen (δH 2,630; δH 2,697) có tương tác carbon bậc IV (δC 128,505) hai proton methylen (δH 2,925; δH 3,401) tương tác với carbon methine (δC 53,692), nên carbon bậc IV (δC 128,505) phải vị trí C-1b, carbon methylen (δC 53,692) vị trí C-6 hai proton methylen (δH 2,630; δH 2,697; H-4) gắn với carbon (δC 23,814) vị trí C-4 hai proton methylen (δH 2,925; δH 3,401; H-5) gắn với carbon (δC 43,048) vị trí C-5 Phổ COSY cho tương quan H-4 H-5 Dựa vào phổ COSY, H-6 ghép cặp với hai proton methylen (δH 2,674; δH 2,801), nên hai proton H-7a, H-7b Hai proton H-7a, H7b lại gắn với carbon (δC 37,087) carbon C-7 HMBC cho thấy, H-6 có tương quan với carbon bậc IV (δC 128,505) nên carbon bậc IV (δC 128,505) vị trí C-1b Tương tự H-7 tương quan với carbon bậc IV (δC 124,829); (δC 110,924); (δC 108,467) (δC 128,742) nên carbon vị trí C-7a; C-1a; C-8 C-11a Một proton methine C-8 (δC 108,467; δH 6,707) cho tương tác với C-7; C-7a carbon bậc IV (δC 146,511) nên carbon bậc C-9 Một proton methine (δH 7,564) cho tương quan với C-1a C-11a carbon bậc IV (δC 146,058) nên proton H-11, carbon vị trí C-11 (δC 107,103) carbon bậc IV (δC 146,058) C-10 Dựa kết phổ kết hợp so sánh tài liệu tham khảo cấu trúc tương tự khác nhóm methylendioxid vị trí C-9 C-10 cassythine, nhận định chất V4 aporphine alkaloid có tên cassythidine 189 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Bảng Kết phổ NMR V4 δ (ppm), J (Hz), CDCl3 : MeOD (9:1), 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) Vị trí 1a 1b 3a C C C C C C CH2 CH2 CH CH2 7a 10 11 11a 3-OMe O-CH2-O A B O-CH2-O A B CH C C CH C H (a) 2,630-2,697 (m) 3,401 (m) 2,925 (td) 3,853 (dd) 2,763-2,801 (dd) 2,674 m 6,707 (s) 7,564 (s) 4,003 6,037 (d; Hz) 5,952 (d; Hz) 5,933 (d; 3Hz) 5,910 (d; Hz) 13 C (a) 143,357 110,924 128,505 135,125 139,930 119,158 23,814 43,048 HMBC COSY C-3a; C-1b C-3a; C-6 H-5 H-4 53,692 37,087 C-1b; C-7 C-1a; C-6; C-7a; C-8; C-11a H-7 H-6 124,829 108,467 146,511 146,058 107,103 128,742 59,469 100,875 C-7; C-7a; C-8; C-9 C-1a; C-10; C-11a C-3 C-1; C-2 100,600 C-9; C-10 Hình Cấu trúc V4 (Cassythidine) KẾT LUẬN Từ cao chiết alkaloid tổng, sử dụng kỹ thuật sắc ký cột diaion HP-20 silica gel pha thuận kết hợp kỹ thuật phổ, phân lập xác định cấu trúc hợp chất aporphine alkaloid thalicminine cassythidine TÀI LIỆU THAM KHẢO 190 Chang FR, Chao YC, Teng CM and Wu YC (1998) Chemical constituents from Cassytha filiformis II Journal of natural products, 61, number 7, 863-866 Hoet S, Stevigny C, Block S, Opperdoes S, Colson P, Baldeyrou B, Lansiaux A, Bailly C and Quetin-Leclercq J (2004) Alkaloid from Cassytha filiformis and Related Aporphines: Antitrypanosomal Activity, Cytotocixicity, and Interaction with DNA and Topoisomerases Planta Med, 70, 407-413 Maekh SKh, Gorovoi PG and Yunusov SY (1976)., Alkaloids of Thalictrum strictum Vol III Khimiya Prirodnykh Soedinenii, Vol 4, p 560, July-August Stevigny C, Block S, De Pauw-Gillet MC, De Hoffmann E, Liabres G, Adjakidje V and Quetin-Leclercq J (2002) Cytotoxic Aporphine Alkaloid from cassytha filiformis Planta Med, 68, 1042-1044 Viện dược liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập NXB Khoa học kỹ thuật, tr.978 Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.1236 Wu YC, Chao YC, Chang FR and Chen YY (1997) Alkaloids From Cassytha filiformis Phytochemistry, Vol 46, No, l, pp 181184 Ngày nhận báo: 30/08/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/09/2016 Ngày báo đăng: 25/11/2016 ... Hình Cấu trúc V4 (Cassythidine) KẾT LUẬN Từ cao chiết alkaloid tổng, sử dụng kỹ thuật sắc ký cột diaion HP-20 silica gel pha thuận kết hợp kỹ thuật phổ, phân lập xác định cấu trúc hợp chất aporphine. .. khơng alkaloid Cao alkaloid tổng thu 380 g 100 g cao phân đoạn qua sắc ký cột (SKC) pha tĩnh diaion HP-20, rửa giải với dumg môi nước, MeOH nước 20%, 40%, 60%, 80%, 100% thu phân đoạn Phân đoạn... quan với C-10 C-11 (δC 145,85 δC 157,91) Từ kết phổ NMR chiều, kết hợp đối chiếu với tài liệu tham khảo, nhận định V2 thalicminine, alkaloid cấu tạo khung oxoaporphine Bảng Kết phổ NMR chất V2 δ