NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH, xác ĐỊNH cấu TRÚC các HOẠT CHẤT từ cây BÁCH bộ (STEMONA PIERREI GAGN)Ở lào

LỜI CẢM ƠN Luận văn thạc sĩ hoàn thành Bộ môn Hóa học Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn Thầy giáo PGS.TS Đặng Ngọc Quang giao đề tài, hướng dẫn tận tình, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô tổ Bộ môn Hóa Hữu thầy cô khoa Hóa học – Trường Đại học sư phạm Hà Nội giúp đỡ cho ý kiến đóng góp quý báu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ để hoàn thành tốt luận văn Cuối xin cảm ơn gia đình bè bạn động viên, tạo điều kiện để hoàn thành luận văn thạc sĩ Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên K22 Lâm Thị Hải Yến DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN  Kí hiệu phương pháp sắc kí • TLC: Thin Layer Chromatography (sắc kí lớp mỏng) • CC: Column Chromatography (sắc kí cột) • Prep HPLC: Preparative High Performance Liquid Chromatography (sắc kí lỏng điều chế)  Kí hiệu phương pháp phổ • NMR: Nuclear Magnetic Resonance Spectrum (cộng hưởng từ hạt nhân) • • 13 HNMR: CNMR: Phổ cộng hưởng từ proton Phổ cộng hưởng từ 13C • HSQC: Phổ hai chiều, tương tác trực tiếp C – H • HMBC: Phổ hai chiều, tương tác gián tiếp C – H  Các kí hiệu khác • N-E: Hệ dung môi n-hexan: etyl axetat • S Stemona • APG II Angiosperm Phylogeny Group II (một hệ thống phân loại sinh học thực vật đại dựa việc phân tích phân tử công bố vào tháng năm 2003) • APG III Angiosperm Phylogeny Group III (được công bố tháng 10 năm 2009) MỤC LỤC 1.1.1 Khái quát họ Bách Bộ (Stemonaceae) chi Stemona 2.1 Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.2.1 Thiết bị 19 2.2.2 Hóa chất 19 2.2.3 Dụng cụ .20 2.3 Thực nghiệm .20 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết tách 20 2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 25 2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25 2.4.2 Phương pháp phổ NMR .26 2.5 Đặc trưng vật lý - phổ chất phân lập .26 DANH MỤC SƠ ĐỒ, BẢNG SỐ LIỆU VÀ HÌNH ẢNH TRONG LUẬN VĂN  Danh sách sơ đồ: 1.1.1 Khái quát họ Bách Bộ (Stemonaceae) chi Stemona 2.1 Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.2.1 Thiết bị 19 2.2.2 Hóa chất 19 2.2.3 Dụng cụ .20 2.3 Thực nghiệm .20 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết tách 20 2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 25 2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25 2.4.2 Phương pháp phổ NMR .26 2.5 Đặc trưng vật lý - phổ chất phân lập .26  Danh sách bảng: 1.1.1 Khái quát họ Bách Bộ (Stemonaceae) chi Stemona 2.1 Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.2.1 Thiết bị 19 2.2.2 Hóa chất 19 2.2.3 Dụng cụ .20 2.3 Thực nghiệm .20 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết tách 20 2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 25 2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25 2.4.2 Phương pháp phổ NMR .26 2.5 Đặc trưng vật lý - phổ chất phân lập .26  Danh sách hình: 1.1.1 Khái quát họ Bách Bộ (Stemonaceae) chi Stemona 2.1 Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.2.1 Thiết bị 19 2.2.2 Hóa chất 19 2.2.3 Dụng cụ .20 2.3 Thực nghiệm .20 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết tách 20 2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 25 2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25 2.4.2 Phương pháp phổ NMR .26 2.5 Đặc trưng vật lý - phổ chất phân lập .26 DANH MỤC PHỤ LỤC 1.1.1 Khái quát họ Bách Bộ (Stemonaceae) chi Stemona 2.1 Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.2.1 Thiết bị 19 2.2.2 Hóa chất 19 2.2.3 Dụng cụ .20 2.3 Thực nghiệm .20 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết tách 20 2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 25 2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25 2.4.2 Phương pháp phổ NMR .26 2.5 Đặc trưng vật lý - phổ chất phân lập .26 MỞ ĐẦU Lào số quốc gia nhiều rừng nguyên sinh với thảm thực vật đa dạng, phong phú Dựa vào kinh nghiệm thực tiễn, nguồn tài nguyên quý giá người dân sử dụng để phòng chữa bệnh nhiều năm qua Tuy nhiên kinh nghiệm dân gian, chưa có sở khoa học Ngày nay, với việc áp dụng tiến khoa học kỹ thuật để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, tác dụng dược lý thuốc dân gian – làm sáng tỏ khả chữa bệnh thuốc, mà nâng cao giá trị, hiệu sử dụng khả khai thác loài thuốc cách hiệu Hiện nay, hợp chất có hoạt tính sinh học phân lập từ thực vật ngày ý, nghiên cứu chúng có hoạt tính sinh học giá trị chống viêm nhiễm, chữa ung thư … làm chất dẫn đường cho trình tổng hợp qui mô lớn dẫn xuất với hoạt tính sinh học mới, phong phú hiệu Cây Bách thuộc loại bụi, mọc hoang vùng đồng Nam Bộ Việt Nam, Lào, Đông Bắc Thái Lan, Campuchia, Trung Quốc loài thuốc quí Theo kinh nghiệm dân gian Nam Lào, người ta sử dụng phần củ Bách để làm thuốc chữa nhiều loại bệnh có hiệu bệnh da, ung thư gan … Ngoài củ Bách có khả làm thuốc diệt sâu bọ, mối mọt… So với loài Bách Việt Nam, Trung Quốc Thái Lan, Bách Lào chưa nghiên cứu nhiều, số lượng công trình nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học loài Vì lý đây, khuôn khổ Luận văn Thạc sĩ Hóa học này, chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc hoạt chất từ Bách (Stemona pierrei Gagn) Lào” CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Bách 1.1.1 Khái quát họ Bách Bộ (Stemonaceae) chi Stemona 1.1.1.1 Giới thiệu chung Họ Bách (tên khoa học Stemonaceae), họ thực vật có hoa, bao gồm 3-4 chi khoảng 25-35 loài dây leo hay thân thảo Hệ thống APG II năm 2003 hệ thống APG III năm 2009 đặt Dứa dại (Pandanales) nhánh mầm (Monocots) ngành hạt kín (Angiosperms) Họ Bách Bộ chia thành chi: + Croomia Torr + Stemona Lour + Stichoneuron Hook + Pentastemona Steenis (đôi tách thành họ riêng Pentastemonaceae) Trong đó, chi Stemona lớn nhất: có khoảng 30 loài, thường mọc hoang dại vùng trung du, miền núi, tập trung các nước Châu Á nơi có khí hậu nóng ẩm Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan, [21, 34] Các loài thuộc chi Stemona thường có đặc điểm chung sau: [1,7,9] • Thân thảo, mọc đứng, bò leo, mọc đối, so le hay mọc vòng, thường hình tim • Cụm hoa kẽ lá, riêng lẻ hay nhiều hoa, có cuống không cuống, lưỡng tính Bao hoa mảnh, hai ngoài, hai giống nhau, mảnh rộng hơn, nhiều gân Nhị 4, nhau, mọc đối xứng với phận hoa.Chỉ nhị ngắn, bao phấn hướng trong, trung đới có phần phụ dài hình đùi Bầu ô, tiêu giảm Vòi nhụy phân biệt rõ ràng với bầu Đầu nhụy tận gần phân đôi Noãn 2-11, mọc đứng, dính phía ô • Quả nang hình trứng hình mác dẹt, mở hai van Hạt hình trứng, phôi thẳng, có nội nhũ • Rễ củ dài, thịt rễ nạc 1.1.1.2 Giới thiệu Bách Lào Bách nhỏ Theo tài liệu [5,28] Lào có 11 loài thuộc chi Stemona : Stemona tuberosa, Stemona phyllantha Gagnep, Stemona squamigera Gagnep, Stemona cochinchinensis Gagnep, Stemona pierrei Gagnep, Stemona saxorum Gagnep, Stemona collinsae Craib, Stemona aphylla Craib, Stemona burkillii Prain, Stemona griffithiana Kruz Stemona kerrii Craib Các loài phân bố rải rác vùng núi miền bắc, đồng miền trung miền nam nước Lào Cây Bách nhỏ có tên khoa học Stemona pierrei Gagnep thuộc họ Bách (Stemonaceae) • Mô tả: Dây leo có thân mảnh, dài từ 10-15m, gốc có nhiều rễ củ mọc thành chùm Lá mọc đối hay so le • Bộ phận dùng nghiên cứu:Cây Bách nhỏ thu hái tỉnh Savannakhet, CHDCND Lào, tháng 5/2012 Sau thu hái, củ rễ phơi sấy khô, thái nhỏ • Nơi sống thu hái: Cây Bách nói chung - ưa khí hậu ôn hòa, thường mọc hoang đồi núi hay ven suối, ẩm mát, thích đất pha cát, nhiều mùn Có thể trồng cách gieo hạt chồi gốc Bách tìm thấy ở: Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Lào,… 1.1.2.Tác dụng dược lý Bách Bộ Theo lý luận y học cổ truyền, Bách vị cam khổ, tính vi ôn, quy kinh phế, công nhuận phế hạ khí khái, sát trùng, sử dụng phổ biến dạng sống qua chế biến điều trị chứng ho dùng điều trị bệnh giun sán Bách sống tác dụng thiên khái hoá đàm, sát trùng, dùng trường hợp ngoại cảm dẫn đến ho, có tác dụng phụ gây kích ứng dày Chích mật hoà hoãn tính kích thích dày, đồng thời tăng cường tác dụng nhuận phế khái, dùng trường hợp ho lao (ho lâu ngày), bách nhật khái, phế âm hư khái thấu, đờm có máu [11] Ngoài ra, theo phương pháp cổ truyền, Bách chế biến với phụ liệu dịch chiết cam thảo, mật ong, rượu sau [10]: • Bách phiến: Rễ bách sau thu hái rửa đất cát, cắt bỏ đầu đuôi, thái phiến chéo, dài 3-5 cm, dày 5-6 mm, sấy 50-60 oC khô • Bách chưng rượu: Lấy rượu 40% tẩm vào bách phiến theo tỉ lệ 1/5 (thể tích/khối lượng) Cho vào cốc có dung tích phù hợp, đậy kín, đặt vào nồi cách thuỷ sôi, tiếp tục đun sôi giờ, lấy phơi, sấy 50-60oC khô • Bách chích mật ong: Cân mật ong bách phiến theo tỉ lệ 1/10, thêm nước pha loãng mật ong theo tỉ lệ 1:1 trộn vào bách phiến, ủ cho ngấm Sấy khô qua, lửa nhỏ đến miếng bách chuyển màu vàng đậm, sờ không dính tay, mùi thơm, vị đắng • Bách chích cam thảo: Cân cam thảo bách theo tỉ lệ 1/8 Sắc cam thảo với lượng nước gấp 15 lần lượng cam thảo hai lần, đun sôi 1,5 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Võ Văn Chi (1999) Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học (10) Phạm Hữu Điển, Pham Văn Kiệm, Châu Văn Minh, (2000) Alkaloid từ rễ củ bách Stemona tuberosa Lour Tạp chí hóa học, Tập 38, số 1, tr 64-67 (6) Phạm Hữu Điển, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh (2002), Chiết tách thử hoạt tính sinh học số ancaloit từ củ Bách thân đứng Tạp chí Hoá học ứng dụng, số 9, tr 21-27 (7) Nguyễn Thị Thu Hà (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Bách Bộ thân leo (Stemona pierrei Gagn) Lào, Luận văn thạc sĩ Hoá học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội (3) Vonganantha Khamko (2013), Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học ba loài thuộc chi Bách (Stemona) mọc Lào, Luận án tiến sĩ Hoá học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội (11) Vũ Ngọc Kim, (1996) Nghiên cứu ba loài bách thuộc chi Stemona dung làm thuốc Việt Nam, Luận án tiến sĩ khoa học y dược, trường Đại học dược Hà Nội (12) Đỗ Tất Lợi (1977) Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB KHKT, Hà Nội, tr 180-181 (1) Nguyễn Thị Nhàn (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học từ phân đoạn phân cực trung bình củ Bách Bộ nhỏ Stemona pierrei Lào, Luận văn thạc sĩ Hoá học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội (4) Sách đỏ Việt Nam, Phần: Thực vật, (1990) NXB KH &CN, Hà Nội, tr 372-375 (9) 42 10 Phạm Xuân Sinh (2006), Phương pháp chế biến thuốc cổ truyền, NXB Y học, tr 60-61 (8) 11 Bùi Thị Tho (2003), Nghiên cứu tác dụng dược lý bách với số ngoại ký sinh trùng thú y, ứng dụng điều trị thử nghiệm, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr 58-63 (2) 12 Nguyễn Mạnh Tuyển (2010), Nghiên cứu tác dụng giảm ho, trừ đờm bách (Radix Stemona tuberosae) trước sau chế biến, Tạp chí dược học, số 407, tr 15-17 (5) B Tiếng Anh 13 A.Tanaka, A.Kato, T.Tsuchiya (1997) Isolation of methyl ferulate from rice bran oil J of the Amer Oil Chem Soc., Vol 48, No 3, pp 95-97 DOI: 10.1007/BF02545727 (13) 14 B B Seger (2002) Feeding deterrence and contact toxicity of Stemona ancaloit – a source of potent natural insecticides J Agric Food Chem Vol 50, No 22, pp 6383-6388 (14) 15 Chaturvedula and Prakash (2012), Isolation of Stigmasterol and βSitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus, International Current Pharmaceutical Journal, Vol.1, No.9, pp.239-242 (19) 16 D.Hailai (2013) “Isolation of alkaloids from Stemona sp.” J Nat Prod Res., Vol 89, pp.257-264 (15) 17 E Kaltenegger, B Brem, K Mereiter, H Kalchhauser, H Kahlig, O Hofer, S Vajirodaya, H Greger (2003) Insecticidal pyrido[1,2a]azepine alkaloids and related derivatives from Stemona specie Phytochemistry, 63, No.7, pp 803-816 (16) 18 H Greger at al (2006) “Stilbenoids from Stemona collinsae” Planta Med., Vol.72, pp.99-113 (17) 43 19 H Greger (2006) Structural relationships, distribution and biological activities of Stemona alkaloids Planta medica, Vol 72, pp 99-113 (18) 20 K.Kostecki, D.Engelmeier, T.Pacher, O.Hofer, S.Vajrodaya, H.Greger, (2004) Dihydrophenanthrenes and other antifungal stilbenoids from Stemona cf.pierrei Phytochemistry, Vol 65, No.1, pp 99-106 (20) 21 L.D Cheng et al (1988) A study of stemona ancaloit J Nat Prod Res Vol 51, pp 202-211 (21) 22 Li-Gen Lin, Chun-Ping Tang, Pham Huu Dien, Ren-Sheng Xu, Yang Ye (2007) “Cochinchistemonine, a novel skeleton alkaloid from Stemona cochinchinensis” Tetrahedron Letters, N.48, pp 1559-1561 (22) 23 Nurettin YAYLI, Nuri YILDIRIM, Asu USTA, Serpil ӦZKURT, Vildan AKGÜN (2003), Chemical constituents of Campanula lactiflora, Turk J Chem, Vol 27, pp 749-755 (34) 24 P.H Dien, L.G Lin, C.P Tang, C.Q Ke, Y Ye (2008) Bisbenzopyrans and alkaloids from the roots of Stemona cochinchinensis Nat Prod Res., 22, No.10, pp 915-920 (23) 25 P Mungkornasawakul, S.G Pyne, A Jatisatienr, D Supyen, C Jatisatienr, W Lie, A.T Ung, B W Skelton, A H White (2004) Phytochemical studies on Stemona burkillii Prain: two new dihydrostemofolines alkaloids J Nat Prod., 67, pp 675 – 679 (24) 26 R.A Pili, M.C Oliveira (2000) Recent progress in the chemmistry of Stemona alkaloids Nat Prod Rep., 17, No.1, pp.117-127 (25) 27 R.S Xu (2000) Studies in Natural Products Chemistry Elsevier Press, Amsterdam, 21, p.729-742 (26) 44 28 T L Do (2001) Vietnamese Traditional Medicinal Plants and Drugs, 3rded,; Publishing House of Medicine, Hanoi, pp 180 (27) 29 Vonganatha Khamko, Pham Huu Dien, Dang Ngoc Quang (2012) “Cytotoxic and anti-microbial constituents from the roots of Stemona cochinchinensis in Laos” J of Chemistry, VAST, Vietnam, Vol 50, No.4A, pp.203-206 (28) 30 W M Zhao, G.W Qin, Y Ye, R.S Xu, X.F Le (1995) “ Stemanthrenes from the roots of Stemona sp.” Phytochemistry, Vol 38, pp 711-716 (29) 31 W M Zhao, G.W Qin, Y Ye, R.S Xu, X.F Le (1995) “Bibenzyls from Stemona tuberosa.” Phytochemistry, Vol 38, No 3, pp 711-713 (30) 32 X Zhou, C.P Tang, Y Ye (2003) “Stilbenoids from Stemona japonica” J Nat Prod, Vol 8, No 1, pp 47-53 (31) 33 X.Z Yang, C.P Tang, C.Q Ke, Y.Ye (2007) Stibenoids from Stemona sessilifolia J of Asian Nat Prod Res., Vol 9, No 3, pp 261266 (32) 34 Zhi-Hua Chen et al (2011) Total synthesis of (±)-maistemonine and (±)-stemonamide Chem Commun., Vol.47, No.6, pp.1836-1838, DOI: 10.1039/C0CC02612C (33) 45 PHỤ LỤC 46 Phổ 1H NMR hợp chất YE3 47 48 Phổ 1H NMR hợp chất YE6.5 49 Phổ 13C NMR hợp chất YE6.5 50 Phổ HSQC hợp chất YE6.5 51 Phổ HMBC hợp chất YE6.5 52 Phổ 1H NMR hợp chất YE8.3 53 Phổ 13C NMR hợp chất YE8.3 54 Phổ 1H NMR hợp chất YE10.3 55 Phổ 13C NMR hợp chất YE10.3 56 ... Nội dung nghiên cứu Xác định tên khoa học Bách nhỏ Khảo sát định tính lớp chất có củ Bách nhỏ Chiết tách, xác định cấu trúc số hợp phần củ Bách nhỏ Thử nghiệm số hoạt tính sinh học chất 18 2.1.3... tách, xác định cấu trúc hoạt chất từ Bách (Stemona pierrei Gagn) Lào CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Bách 1.1.1 Khái quát họ Bách Bộ (Stemonaceae) chi Stemona 1.1.1.1 Giới thiệu chung Họ Bách. .. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học Bách Bộ 1.2.1 Nghiên cứu Bách nói chung Bách Bộ loại dược liệu quí nên nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Cho đến có nhiều công trình nghiên cứu Bách công