Nghiên cứu quy trình xác định atorvastatin bằng phương pháp von ampe trên điện cực glassy cacbon ( GC)”

Mặt khác, ngoài việc định lượng và kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bàochế, thì cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinhhọc để có thể tìm hiểu khả năng t

Lời cảm ơn

Những dòng đầu tiên của bản kháo luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâusắc đối với TS Nguyễn Thị Kim Thường đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn vàđộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn chỉnh đề tài này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Hóa nói chung

và bộ môn phân tích nói riêng đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quýbáu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại khoa, và tạo mọi điều kiện hếtsức thuận lợi về mặt thiết bị và hóa chất giúp em hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, các bạn trong lớp Hóa học, và các bạn sinh viên trên phòng thí nghiệm hóa phân tích đã trao đổi giúp

K57A-đỡ cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm Sinh Viên

Phạm Thị Hương

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 Anodic Stripping

Voltammetry Von-ampe hòa tan anốt ASV

2 Asorptive StrippingVoltammetry Von-ampe hòa tan hấp phụ AdSV

3 Cathodic StrippingVoltammetry Von-ampe hòa tan catốt CSV

5 Differential Pulse

Voltammetry

Von-ampe hòa tan xung

7 Limit of Quantity Giới hạn định lượng LOQ

8 Tandem Mass SpectrometryLiquid Chromatography- Sắc kí lỏng khối phổ khối phổ MS/MS

10 Mercury Film Electrode Điện cực màng thủy ngân MFE

11 Hanging Mercury DroppingElectrode Điện cực giọt thủy ngân treo HMDE

12 High Perfomanc Liquid

Chromatography

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

13 High performance thinlayer chromatography Sắc kí bản mỏng hiệu năngcao HPTLC

14 Reversed- Phase High-Performance Liquid

Chromatography

Sắc kí lỏng pha đảo HPLC

RP-15 Static Mercury DroppingElectrode Điện cực giọt thủy ngân tĩnh SMDE

16 Stripping Voltammetry Von-ampe hoà tan SV

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG KHÓA LUẬN

Mục Lục

Contents

Mở đầu

Hiện nay, các hợp chất có hoạt tính sinh học dùng làm thuốc chữa bệnh chocon người có rất nhiều loại, mà hàm lượng các hoạt chất trong dược phẩm có tínhchất quyết định đến liều dùng và khả năng chữa bệnh, đồng thời khả năng chuyểnhóa và đào thải thuốc trong cơ thể người cần được theo dõi và kiểm tra Thuốc được

sử dụng nhằm mục đích chữa bệnh nhưng nhiều tổ chức cá nhân đã lợi dụng cho rađời nhiều loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng làm nguy hại cho sức khỏe và kinh

tế cho con người Ngày 27-5-2014, theo các nghiên cứu của Tổ chức Y tế Thế giới(WHO), tốc độ tăng trưởng hàng năm của "ngành công nghiệp tội lỗi" này lên tới100% từ năm này sang năm khác Theo WHO, thuốc giả chiếm tới 30% và thậmchí, có khi còn lên tới 50% lượng dược phẩm lưu hành ở một số nước đang pháttriển, còn tại Nigeria và Guinee, cứ 10 viên thuốc bán ra có tới 6 viên là thuốc giả.Các mẫu thuốc giả chủ yếu là thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau, thuốc giảm cácyếu tố độc hại trong cơ thể (hạ đường huyết, giảm cholesterol ) Điều khiến nhiềungười quan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam ngày một diễn biến phức tạp, nên côngtác kiểm tra ngày càng khó khăn hơn Theo TS Trương Quốc Cường, Cục trưởngCục Quản lý dược- Bộ Y tế, tỷ lệ thuốc kém chất lượng ở Việt Nam hiện dao độngkhoảng 3% và thuốc giả dưới 0,02% Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng củathuốc theo đúng tiêu chuẩn là một vấn đề rất quan trọng và thực sự cần thiết

Mặt khác, ngoài việc định lượng và kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bàochế, thì cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinhhọc để có thể tìm hiểu khả năng tồn tại, cũng như khả năng hấp phụ của thuốc trong

cơ thể Ngày nay, có rất nhiều phương pháp được dùng để xác định xác nhóm chất

có hoạt tính sinh học, chủ yếu là các phương pháp sắc ký như HPLC, GC, , phươngpháp UV-VIS… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi thiết bị tương đối đắt tiền,quy trình phân tích phức tạp…Vì thế cần đòi hỏi một phương pháp có thể đảm bảo

độ đúng, độ chọn lọc mà quy trình đơn giản và chi phí phân tích không cao Trongcác phương pháp phân tích công cụ hiện đại, thì phương pháp Von-ampe hòa tan cóthể đáp ứng được các yêu cầu đặt ra Vì vậy, tôi đã chọn phương pháp Von-ampe

hòa tan hấp phụ để thực hiện đề tài khóa luận của mình:“ Nghiên cứu quy trình xác định Atorvastatin bằng phương pháp von-ampe trên điện cực glassy cacbon ( GC)” Atorvastatin là thuốc làm giảm lượng Cholesterol trong máu và bổ

trợ cho các quá trình làm giảm các lipid khác, được dùng cho người tăngCholesterol trong máu, những người có nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu về Atorvastatin

1.1.1.Cấu tạo của Atorvastatin và hoạt chất điện hóa Atorvastatin canxi

Atorvastatin là một thuốc làm giảm cholesterol Tên khoa học, theo IUPAC:(3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-5-(propan-2-yl)- 1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic axit và được biết đến với tên thương mại làLiptor hay Atova.[1]

Công thức cấu tạo của Atorvastatin:

Hình 1: Công thức cấu tạo của AtorvastatinCông thức phân tử là : C33H35FN2O5, khối lượng mol là 558,64( g/mol); pKa= 4,6[1] Hoạt chất sử dụng của Atorvastatin là Atorvastatin Canxi

Hình 2: Công thức cấu tạo của Atorvastatin CanxiAtorvastatin Canxi có tên khoa học theo IUPAC là: (bR, dR)-2-(r-fluorophenyl)-b,ddihydroxy-5-isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl) pyrrole-1-hepatanoicacid(1:2)trihydrate Công thức cấu tạo là C18H68CaF2N4O10.3H2O hay (C33H34FN2O5)2Ca.3H2O.[1]

Atrovastatin canxi có khối lượng phân tử là 1209,4( g/mol), Atorvastatin và dạng muối Atorvastatin Canxi tồn tại ở dạng bột tinh thể rất

ít tan trong nước: 20,4 µg/mL( ở pH 2,1); 1,23 mg/mL( ở pH 6,0), tan ít trongetanol, tan hoàn toàn trong metanol.[1]

1.1.2.Dược lực học và động học của Atorvastatin Canxi

1.1.2.1 Dược lực học

Atorvastatin là chất ức chế cạnh tranh và chọn lọc men khử methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA), là một enzyme khóa trong sinh tổng hợpcholesterol Sử dụng Atorvastatin làm giảm lượng cholesterol, Atorvastatin làmgiảm lipoprotein và cholesterol Atorvastatin ức chế quá trình chuyển hóa HMG-CoA thành mevalonat, một tiền chất của sterol, bao gồm cholesterol Atorvastatincanxi tan rất ít trong nước cất; acetonitrin; tan ít trong etanol và tan nhiều trongmetanol Atorvastatin để điều trị tăng lipit trong máu và phòng các bệnh về timmạch.[2][3]

3-hydroxy-3-1.1.2.2.Dược động học

Atorvastatin được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ thuốc tronghuyết tương tối đa đạt được trong vòng 1-2 giờ Mức độ hấp thu và nồng độAtorvastatin tăng tỉ lệ với liều lượng Atorvastatin Atorvastatin dạng viên có độ khảdụng sinh học 95-99% so với dạng dung dịch Độ khả dụng sinh học tuyệt đối củaAtorvastatin là khoảng 14% và độ khả dụng toàn thân của hoạt động ức chế menkhử HMG- CoA là khoảng 30% Tính khả dụng toàn thân thấp là do sự thanh lọc ởniêm mạc đường tiêu hóa hoặc chuyển hóa lần đầu ở gan Khoảng 98 % atorvastatingắn kết với các protein trong huyết tương Nồng độ thuốc trong huyết tương khidùng thuốc buổi chiều tối thấp hơn khi dùng buổi sáng, tuy nhiên nồng độ thuốctrong huyết tương xấp xỉ 0,25 % cho thấy sự thấm thuốc vào tế bào hồng cầu thấp,

nhưng hiệu quả giảm LDL thì như nhau Thể tích phân phối trung bình của

Atorvastin khoảng 381 lít Trên 98% Atorvastatin được gắn kết với protein huyếttương Tỉ lệ hồng cầu huyết tương xấp xỉ 0,25 cho thấy sự thấm thuốc vào tế bào

hồng cầu thấp Atorvastatin và các chuyển hóa của nó được thải trừ chủ yếu qua

mật sau quá trình chuyển hóa tại gan hoặc ngoài gan Tuy nhiên, thuốc không đi quachu trình gan ruột Thời gian bán hủy trong huyết tương trung bình của Atorvastatin

ở người khoảng 14 giờ, nhưng một nửa thời gian của hoạt động ức chế men khửHMG- CoA là 10-20 giờ do có sự đóng góp của các chất chuyển hóa có hoạt tính.Dưới 2% lượng Atorvastatin uống vào được tìm thấy trong nước tiểu.[2][3]

1.2.Các phương pháp xác định Atorvastatin

1.2.1.Phương pháp sắc kí.

BaHia và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC kết hợp với detecterhuỳnh quang dùng để xác định đồng thời Amlodipin và Atorvastatin trong hỗn hợpthuốc Quá trình đo huỳnh quang sử dụng bước sóng kích thích và bước sónghuỳnh quang lần lượt là 361nm và 274nm; 442nm và 378nm cho Amlodipin vàAtorvastatin Trong phương pháp này, BaHia đã tách Atorvastaitn và Amlodipinbằng cách cho qua cột C18 với thành phần pha động là hỗn hợp dung dịchacetonitrin: photphat (C= 0,015M; pH=3, tỉ lệ thể tích v/v=45:55) LOD và LOQcủa Atorvastatin và Amlodipin lần lượt là 0,869 µg/mL; 1,149 µg/mL và 2,633µg/mL; 3,483 µg/mL.[15]

Beata Stanisz và Lukas Kania sử dụng phương pháp HPLC để xác địnhAtorvastatin trong các mẫu dược phẩm Tác giả đã sử dụng cột C18 để táchAtorvastatin; dung môi là hỗn hợp acetonitrin và nước theo tỉ lệ thể tích v/v = 48 :

52, pH được điều chỉnh về pH = 2 với axit orthophotphoric Chất phân tích đượcphát hiện ở bước sóng λ = 245 nm Khoảng tuyến tính của thuốc là 0,04 - 0,4mg/mL, hệ số tương quan là R2 = 0,9990.[19]

Hafez sử dụng phương pháp HPLC để xác định Amlodipin và Atorvastatintrong mẫu thuốc Phương pháp được thực hiện trên cột C18 100A(250×4,6mm;2,6µm); pha động là hỗn hợp dung dịch dihydrogen photphat( pH=5,5; C= 0,03M)

và acetonitrin ( 65:35v/v), được bơm vaò hệ thiết bị với tốc độ 1,2ml/phút ở 40°C.Mẫu thuốc được phát hiện ở bước sóng 240nm Từ điều kiện trên, tác giả đã thuđược khoảng tuyến tính là 5,18- 15,54; 5,26- 15,78 µg/mL; độ chính xác: 99,73±0,46%; 100,22± 1,04%; độ chụm: 100,34± 0,61; 101,01± 1,72%; giới hạn phát hiện:0,16 và 0,17µg/ mL; giới hạn định lượng: 0,48 và 0,52 µg/ mL tương ứng choAmlodipin và Atorvastatin.[20]

Srinivasa và cộng sự đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượngAtorvastatin, Metformin and Glimepiride trong huyết tương người Tác giả đã sửdụng Carbamazepin như một chất nội chuẩn(IS) Mẫu được tách trên cột C18

Alltima HP, với thành phần pha động là acetonitrin và 10mM amoni axetat ( pH3,0) với tỉ lệ 60:40( V/V); tốc độ dòng 1,1mL/phút Khoảng tuyến tính 0,50–150,03 ng/mL cho Atorvastatin, 12,14– 1207,50 ng/mL cho Metformin và 4,97–494,29 ng/mL cho Glimepiride.[26]

Borek và cộng sự đã xác định đồng thời Atorvastatin và 2-hydroxyatorvastatintrong huyết tương người và thuốc bằng phương pháp HPLC- MS/MS Tác giả thuđược kết quả sau: khoảng tuyến tính 0,10- 40,00ng/mL cho cả Atorvastatin và 2-hydroxyatorvastatin Giới hạn định lượng là 0,02ng/mL và 0,07ng/mL choAtorvastatin và 2-hydroxyatorvastatin.[17]

Waghmare A N đã sử dụng phương pháp RP-HPLC đánh giá đồng thờiAmlodipin và Atorvastatin trong mẫu thuốc Phương pháp chuẩn, đơn giản, nhạy,nhanh với thành phần pha động acetonitrin và KH2PO4 0,02M (55:45V/V), sử dụngcột BEH C18( 100mm×2,1mm; 1,7µm) với tốc độ dòng 0,3mL/phút Tác giả thuđược khoảng tuyến tính cho Amlodipin và Atorvastatin đều là 0,5- 40,0 µg/mL, R2

là 0,9999 cho Amlodipin và 0,9997 Atorvastatin Hiệu suất thu hồi trung bình;LOD; LOQ cho Amlodipin là 100,79%; 0,062µg/mL; 0,078 µg/mL vàAtorvastatin là 99,87%; 0,02µg/mL; 0,026 µg/mL.[27]

K.R.Alagawadi và cộng sự sử dụng phương pháp HPTLC để xác định đồngthời Atorvastatin, Glimiprid và Metformin trong hỗn hợp thuốc Phương pháp dùngbản nhôm TLC, lớp phủ với silica gel 60F-254 như pha tĩnh; hệ thống dung môi gồm

có nước: metanol: amoni sulphat( 3,5: 3,5: 12,6, v/v/v) Xác định Atorvastatin,Glimiprid và Metformin tại bước sóng 245nm Hệ số tương quan và khoảng tuyếntính của Atorvastatin là R2 = 0,9995 ; 100- 700 ng/mL; Glimiprid: R2 = 0,9987; 20-

140 ng/ml và Metformin: R2 = 0,9967; 100 -1500 ng/mL Từ điều kiện trên, thuđược giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 20ng/mL và 80 ng/mL choAtorvastatin; 5 và 20 ng/mL cho Glimiprid; 50 và 100 ng/mL cho Metformin.Phương pháp có độ chụm, độ thu hồi tương đối tốt và trong giới hạn cho phép.[22]

Sandeep và cộng sự đã ứng dụng phương pháp quang phổ UV và RP-HPLC

để xác định đồng thời Atorvastatin Canxi và Ezetimib trong mẫu dược phẩm tại 2bước sóng hấp phụ cực đại là 246,0nm và 232,5nm; khoảng tuyến tính 5-25µg/mLcho cả hai thuốc Phương pháp RP-HPLC sử dụng cột Luna C18 và thu đượckhoảng tuyến tính 8- 22 µg/mL cho cả 2 loại thuốc.[25]

1.2.2 Phương pháp trắc quang

Baldha và cộng sự sử dụng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử UVxác định đồng thời Atorvastatin Canxi và Ezetimib trong thuốc Atorvastatin có haibước sóng hấp thụ cực đại là 227,0; 246,5nm và Ezetimibe là 235,0; 258,2nm Từđiều kiện trên, tác giả thu được khoảng tuyến tính là 5- 30 µg/mL cho cả hai loại

100,5± 0,95 cho Atorvastatin Canxi; Ezetimib là 2,106; 98,50±0,65 đến 100,9±0,49.[16]

1.2.3 Phương pháp Von-ampe

Abdul và cộng sự đã sử dụng phương pháp cực phổ xung vi phân để xác địnhAtorvastatin trong mẫu thuốc sử dụng điện cực giọt thủy ngân( HMDE) với đệmborat ở pH=7,5 thì thu được một píc khử ở -1310 đến -1340mV( Ep) Khoảng tuyếntính là 2-60 µM Độ lệch chuẩn không vượt quá 3,8% cho nồng độ của Atorvastatin2,00 µM( 1,117 µg/mL) Phương trình hồi quy được thể hiện qua hệ số tương quantương đối tốt( R2= 0,9994) giữa Ip và khoảng nồng độ: 1,117 đến 33,52 µg/mL Giớihạn phát hiện( LOD) và giới hạn định lượng( LOQ) lần lượt là 0,129 µg/mL và0,390 µg/mL Hiệu suất thu hồi trung bình là 97,2 đến 104,2%.[14]

Korany và cộng sự sử dung phương pháp von-ampe cực phổ xung vi phân vàvon-ampe sóng vuông xác định đồng thời Etofibrat, Fenofibrat và Atorvastatintrong mẫu dược phẩm và huyết tương Hệ điện cực: điện cực làm việc là điện cựcgiọt thủy ngân, điện cực so sánh Ag/AgCl Độ lệch chuẩn tương đối< 2% Giới hạnphát hiện( LOD) và giới hạn định lượng( LOQ) lần lượt là 0,0370- 0,21g/mL và0,12- 0,71g/mL.[21]

Nevin và cộng sự đã phát triển phương pháp điện hóa để xác định Atorvastatintrong mẫu dược phẩm và huyết tương Phương pháp được thực hiện trong đệm B-

R Tác giả tiến hành đo bằng hai phương pháp DPV và SqW với điện cực than ởpH=2 Tác giả đã pha mẫu chuẩn trong hỗn hợp CH3OH: H2O( 9:1V/V) Trong quátrình đo bằng phương pháp DPV, tác giả cài đặt các thông số như sau: tốc độ quét:20mV/s; thời gian điện phân: 20s; thế hấp phụ: 0,4mV; biên độ xung: 50mV Vớiphương pháp SqW, cài đặt các thông số: biên độ xung: 25mV; thời gian hấp phụ:20s; thế điện phân 0,4mV; bước thế: 4mV; tần số: 15Hz Khoảng tuyến tính:3,5×10-7M ÷ 4,7×10-7M Giới hạn phát hiện là 4,0×10-9M; 2,0×10-9M với DPV và1,0×10-8M; 2,0×10-8M với SqW.[23]

Tác giả Ramadan và cộng sự đã sử dụng phương pháp cực phổ xung vi phântrên điện cực giọt thủy ngân tĩnh( SMDE) để xác định Atorvastatin trong mẫu dượcphẩm Tác giả đã pha mẫu chuẩn 15,18 mg Atorvastatin Canxi trong 50 ml dungdịch gồm metanol và nước có tỉ lệ thể tích là ( 9:1, V/V) Dung dịch đệm được sửdụng trong quá trình đo là dung dịch đệm borat( gồm 28,5 g Na2B4O7.10H2O và 26

ml H3PO4 1 M, định mức trong 1000 ml), nồng độ dung dịch đệm được xác định là0,075 M ; pH = 7,5 Trong quá trình đo, tác giả cài đặt các thông số đo: biên độ

xung 100 mV, khí trơ N2, thời gian sục khí 200s, khoảng quét thế từ -900mV đến-1500mV, bước thế 8 mV, thời gian xung 40ms, tốc độ quét thế 5,714mV/s Kết quảxác định được cho thấy píc của Atorvastatin xuất hiện trong khoảng thế Ep là từ-1340 đến 1385 mV, % RSD = 3,2 % cho nồng độ AT( 0,0234μg/mL) Giới hạnphát hiện( LOD) và giới hạn định lượng( LOQ) lần lượt là 0,024 và 0,071 μg/mL.Hiệu suất thu hồi từ 97,0 đến 100,5 %.[24]

Wli Mohammadi đã xác định đồng thời Amlodipin và Atorvastatin Canxi bằngđiện cực graphit biến tính bề mặt bằng nano cacbon So với điện cực glassy cabonthì ống nano cacbon có diện tích bề mặt và độ dẫn điện tốt hơn nên có độ nhạy tốthơn Bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ thì xác định được khoảng tuyếntính là 2,5- 100 µg/mL Độ lệch chuẩn của Amlodipin là 2,7 đến 7,1% và đối vớiAtorvastatin Canxi là 1,8 đến 8,3% Giới hạn phát hiện của 2 chất đều là 1 mg/mLtrong dung dịch đệm pH=6.[28]

Bercu và cộng sự đã nghiên cứu tính chất điện hóa và xác định đồng thờiAmlodipin Besylat và Atorvastatin Canxi sử dụng đạo hàm bậc 1 của phương phápVon-ampe tỉ số Ngiên cứu tính chất điện hóa của Atorvastatin và Amlodipin trênđiện cực than gương, sử dụng các kĩ thuật von-ampe là DP và SqW Khoảng tuyếntính : 4×10-6M đến 10-4M cho Amlodipin và 2×10-6M đến 10-4M cho Atorvastatin.Giới hạn phát hiện( LOD) cuả Amlodipin là 8,01×10-7M( ±0,22) ; 8,53×10-

7M( ±0,13) và Atorvastatin là 5,95×10-7M ( ±0,11); 4,7×10-7M( ±0,08) tương ứngcho DP và SqW Giới hạn định lượng( LOQ) của Amlodipin là 2,67×10-6M;2,84×10-6M cho DP và SqW ; của Atorvastatin là 1,98×10-6M và 1,57×10-6M cho

DP và SqW.[18]

Qua tổng quan tài liệu cho thấy, phương pháp Von-Ampe có giới hạn xácđịnh tới 2.10-8 M, thời gian xác định nhanh, chính xác So sánh với các phương phápkhác thì phương pháp Von-Ampe hòa tan có những lợi thế lớn đó là thiết bị đơngiản, chi phí thấp, thời gian xác định ngắn, có thể xác định được các chất ở nồng độthấp và có tính chất chọn lọc, đặc trưng

1.3 Giới thiệu phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ

1.3.1 Nguyên tắc

Về cơ sở lý thuyết, phương pháp AdSV khác biệt cơ bản với phương phápASV ở cơ chế của quá trình làm giàu( hay quá trình tích luỹ chất trên bề mặt cựclàm việc)

+ Giai đoạn làm giàu: trong phương pháp AdSV như sau: trước hết phức củaion kim loại với phối tử hữu cơ được hình thành sau khi thêm phối tử vào dung dịchphân tích, tiếp theo phức đó được tích luỹ bằng cách hấp phụ điện hóa lên ranh giớitiếp xúc dung dịch - điện cực làm việc Trong thời gian làm giàu, thế trên cực làmviệc được giữ không đổi Thông thường AdSV có thể được thực hiện trên hầu hếtcác loại điện cực dùng trong von-ampe, ví dụ như: HMDE, SMDE, Pt, thannhão( CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học Tuynhiên đa số các nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV thường sử dụng điện cực HMDE

do điện cực này có nhiều ưu điểm: bề mặt được tự làm sạch và lặp lại, dễ tự độnghoá

Nếu trong dung dịch phân tích, ion kim loại Men+ tạo với phối tử L (giả sử L

là phối tử trung hòa) phức chất MeLnn+ có tính chất hoạt động bề mặt, thì nó có thểtích luỹ theo trên bề mặt điện cực làm việc theo cơ chế sau:

Phản ứng này xảy ra trong dung dịch và đây là giai đoạn hóa học của quá trình:

tử L, mà sản phẩm của quá trình oxy hoá hoặc khử điện hoá sẽ phản ứng tạo phứcvới phối tử L:

Men+ ± me ⇒ Men ± m

Men ± m + (n ± m) L ⇔ Men ± m L(n ± m)

Men ± m L(n ± m) (dd) ⇔Men ± m L(n ± m) (hp)

(4) Cuối cùng và cũng thường gặp là quá trình làm giàu Men+ xảy ra theo cơ

chế bao gồm cả cơ chế (2) và (3) ở trên:

nL (dd) ⇔ nL (hp)

Men+± me ⇒Men ± m (dd)

Men ± m + (n ± m) L(hp) ⇔ Men ± m L(n ± m) (hp)

+ Giai đoạn hoà tan: thế được quét theo chiều catot (chiều âm hơn) và lúc

này xảy ra quá trình khử các tiểu phần đã bị hấp phụ theo ba cơ chế sau:

(1) Khử ion kim loại trong phức chất

(2) Khử phối tử trong phức chất

(3) Khử xúc tác hydro

Trong phương pháp AdSV, khi ghi đường von-ampe hoà tan, có thể sử dụngcác kỹ thuật ghi đường von-ampe như trong phương pháp ASV Tín hiệu đỉnh trênđường von-ampe hoà tan là cơ sở để định lượng theo phương pháp AdSV Tín hiệuvon-ampe hoà tan tỷ lệ thuận với nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên cựclàm việc theo phương trình (1)

Q = n.F.S.C0Trong đó,

Q : điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp phụ

n : Số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng

F (C/mol): hằng số Faraday

S (cm2): diện tích bề mặt cực làm việc

C0 (mol/cm2): nồng độ bề mặt của phức hấp phụ trên điện cực

Với một tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh hoà tan (Ip) tỷ lệ thuận với Q,nên Ip tỷ lệ với S và C0 Mà C0 tỷ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C),nên Ip tỷ lệ với S và C: IP = S.C Để đạt được độ nhạy cao khi phân tích bằngAdSV, cần tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình hấp phụ Do vậy, cường độdòng píc phụ thuộc vào một số yếu tố: loại điện cực, thời gian tích luỹ, thế tích luỹ,dung môi, đặc tính bề mặt của chất, diện tích điện cực, lực ion, pH và nhiệt độ.[5]

1.3.2 Các kĩ thuật ghi đo tín hiệu hòa tan chất cần phân tích

1.3.2.1.Kỹ thuật DPV

Điện cực chỉ thị được phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm( vài mV/s), cuối chu kỳ giọt người ta đặt vào một xung vuông góc với biên độ 10- 100 mV( thường chọn 50 mV), thời gian đặt xung 40-100 ms, cường độ dòng được ghi 2 lần tại thời điểm 16,7 ms trước khi nạp xung và ngắt xung.Đường biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định và có độ phân giải cao Do vậy xung vi phân giảm tối đa dòng dư, một hạn chế của cực phổ cổ điển.

Thông thường các điều kiện được chọn như sau: thời gian giữa các xung 100 ms; độ dài xung 30ms; thời gian đo 10ms; bước thế 5mV; khi đó tốc

độ quét cũng đạt 50mV/giây Cho kết quả tốt với cả hệ thuận nghịch và không thuận nghịch, nhưng không quét được với tốc độ cao.[5]

1.3.2.2.Kỹ thuật SqW

Đặt vào điện cực một thế một chiều biến đổi tuyến tính theo thời gian

và một điện áp xoay chiều vuông góc Biên độ từ 1 đến 50mV, tần số 200Hz, nhờ thiết bị đồng bộ ghi được cường độ dòng điện ở gần cuối chu kỳ giọt Tại thời điểm này dòng tụ điện bằng không.

50-Nếu dùng kỹ thuật SQW thì chọn tần số từ 50 đến 100Hz (nếu máy cho phép); bước thế 5mV, thì tốc độ quét thế đến từ 100 đến 500mV/giây.

Kỹ thuật SQW tỏ ra thích hợp nhất là đối với các hệ thuận nghịch

1.3.2.3.Kỹ thuật DC

Kỹ thuật này dựa vào cách chọn thời gian ghi tại thời điểm dòng tụ điện cực tiểu, cường độ dòng cần đo cực đại Cho píc hấp phụ cân đối, nhưng khi quét với tốc độ cao, đường von ampe bị dốc.

1.3.2.4.Kỹ thuật xung thường

Điện cực được phân cực bằng điện áp một chiều không đổi trong suốt thời gian ghi, tại một thời điểm xác định điện cực được phân cực thêm một xung điện dạng vuông góc có thời gian tồn tại ngắn( 30-50 ms), sau đó xung

bị ngắt và cả quá trình phân cực biên độ xung tăng dần, dòng khử cực được ghi tại thời điểm xác định( thường 16,7 ms trước khi ngắt xung).[5]

1.3.3 Các cực làm việc thường dùng trong phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ

1.3.3.1 Cực HMDE

Cực HMDE là loại cực được dùng phổ biến nhất trong phương pháp von-ampe hòa tan Nó là một giọt thủy ngân hình cầu kích thước nhỏ được treo trên đầu cuối của một mao quản có đường kính trong 0,15–0,5 mm Sau mỗi phép đo, giọt thủy ngân bị cưỡng bức rơi ra khỏi mao quản và nó được thay thế bằng một giọt mới tương tự Một kiểu cực giống với cực HMDE cũng thường được dùng là cực giọt thủy ngân tĩnh( SMDE) do hãng PAR( USA) chế tạo Cực HMDE và SMDE cho kết quả đo có độ chính xác cao và độ lặp lại cao, có quá thế với hidro lớn khoảng -1,5 V trong môi trường kiềm và trung tính, -1,2 V trong môi trường axit, nên các cực này có khoảng điện hoạt rộng, do đó cho phép chúng ta ngiên cứu trong một khoảng thế rộng Chúng được dùng rộng rãi để xác định các kim loại, các hợp chất hữu cơ Điểm hạn chế của HMDE và SMDE là khó chế tạo, vì rất khó tạo ra các giọt thủy ngân có kích thước lặp lại hoàn hảo Ngoài ra chúng không cho phép xác định các kim loại có thế hòa tan dương.[4]

1.3.3.2 Cực MFE

Cực MFE là một màng mỏng thủy ngân phủ trên bề mặt cực rắn trơ (thường là cực rắn đĩa quay) có đường kính 2 ÷ 4 mm và làm bằng các loại vật liệu trơ như than thủy tinh( glassy carbon), graphit, than nhão( paste carbon)… Cực MFE được chuẩn bị dễ dàng bằng cách điện phân dung dịch

HgII 10-4–10-5 M trên điện cực rắn đĩa ở thể thích hợp( khoảng -0,8 ÷ -1,3 V so với điện cực Ag/AgCl/KClbh hoặc Hg/Hg2Cl2/KClbh) và trong thời gian thích hợp( thường khoảng 3–5 phút) Bằng cách như vậy, cực MFE có thể được hình thành theo 2 kiểu insitu và exsitu.

- Theo kiểu insitu, dung dịch HgII được thêm vào dung dịch phân tích

và như vậy, khi điện phân làm giàu, cực MFE được hình thành đồng thời với quá trình tập trung chất phân tích lên cực MFE.

- Theo kiểu exsitu, cực MFE được tạo ra trước bằng cách điện phân dung dịch HgII như trên, sau đó tia rửa cực cẩn thận bằng nước sạch, rồi nhúng cực vào dung dịch phân tích để tiến hành nghiên cứu Cực MFE dạng exsitu thường có bề dày màng thủy tinh lớn hơn so với dạng insitu.

Cho đến nay, bản chất của cực MFE vẫn còn là vấn đề hấp dẫn các nhà nghiên cứu Khi khảo sát các cực MFE được tạo ra theo kiểu insitu và exsitu, H.Ping Wu cho rằng: cực MFE như một màng mỏng gồm các giọt thủy ngân nhỏ li ti và liên tục trên cực rắn đĩa, kích thước các giọt thủy ngân đó phụ thuộc vào lượng thủy ngân trên mặt cực rắn đĩa và thường khoảng từ 0,1 đến

1 μg.

Ngoài những ưu điểm giống như đối với HMDE, cực MFE còn có một

số ưu điểm khác, do nồng độ kim loại trong hỗn hống của cực MFE cao hơn, tốc độ khuếch tán của kim loại ra khỏi điện cực MFE nhanh hơn và có đặc điểm của quá trình điện phân lớp mỏng Mặt khác, có thể sử dụng cực MFE quay, nên điều kiện đối lưu và đi kèm là sự chuyển khối sẽ tốt hơn, do đó cực MFE có độ nhạy và độ phân giải cao hơn so với cực HMDE Nhưng với vấn

đề phân tích các dung dịch có khả năng hòa tan lên bề mặt điện cực thì dùng cực HMDE và cực SMDE là tốt hơn, có độ nhạy cao hơn.

Nhược điểm: độ lăp lại và độ phục hồi của các phép đo khi đi từ cực MFE này đến cực MFE khác thường kém hơn so với các cực HMDE và SMDE [4]

1.3.3.3 Cực rắn đĩa

Cực rắn đĩa là một mặt phẳng hình đĩa có đường kính khoảng 2 ÷ 4 mm

và được làm bằng kim loại vật liệu trơ như than thủy tinh( GC), than nhão ( PC), graphit, graphit ngâm tẩm…Hầu hết các cực rắn đĩa thường dùng để xác định các kim loại như Mn, Co, Ce, Sb, As… theo phương pháp CSV.

Điện cực rắn được dùng để xác định các kim loại có thế oxi hóa- khử tương đối dương như Ag, Au, Hg hoặc các kim loại không tan trong thủy ngân như As, Mn

Trong bài khóa luận này, chúng tôi sử dụng điện cực làm việc là điện cực than gương để xác định Atorvastatin bằng phương pháp von-ampe.

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

2.1 Nội dung, mục đích và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mục đích và đối tượng nghiên cứu

Mục đích nghiên cứu của đề tài này là: Nghiên cứu quy trình xác địnhAtorvastatin bằng phương pháp von-ampe trên điện cực than gương( GC)

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Từ mục đích và đối tượng nghiên cứu trên thì nội dung cần làm gồm cácphần sau:

- Khảo sát các đặc tính điện hóa của Atorvastatin bằng phương pháp ampe vòng( CV)

von Tối ưu hóa các điều kiện xác định Atorvastatin

- Khảo sát ảnh hưởng của Amlodipin tới Atorvastatin

- Đánh giá phương pháp phân tích

- Phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm- Autolab có ghép nối với máy tính vàphần mềm điều khiển.

Hệ đo gồm 3 điện cực:

 Điện cực làm việc: điện cực than gương

 Điện cực so sánh: Ag/AgCl/KCl bão hòa

 Điện cực phụ trợ: thanh platin

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.3.1 Thiết bị

Máy đo pH meter TOA –Nhật Bản

Cân phân tích StarTorius (độ chính xác 0,1 mg)

Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab có ghép nối với máy tính vàphần mềm điều khiển.

Chất chuẩn Atorvastatin dạng bột, tinh khiết 99,99%( Mỹ).

Axit axetic( CH3COOH) đặc( Merck)

NaOH( Merck)

Axit boric( H3BO3) ( Merck)

Na2B4O7.10H2O( Merck)

Metanol(CH3OH) ( Merck)

Mẫu thuốc mua tại các hiệu thuốc trên thị trường

2.3.4 Chuẩn bị dung dịch

2.3.4.1 Pha dung dịch đệm BR có pH( 4÷12)(dung dịch đệm vạn năng)

Dung dịch A: Dung dịch hỗn hợp 3 axit H3BO4, H3BO3 và CH3CHOOH cùng

ở nồng độ 0,04 M

Dung dịch B: Dung dịch NaOH 0,2 M

Pha dung dịch đệm vạn năng bằng cách trộn hai dung dịch A và B có tỉ lệthích hợp

2.3.4.2 Pha dung dịch gốc Atorvastatin 10 -3 M

Dung dịch gốc Atorvastatin được pha trong metanol

Cân 0,01397g chất chuẩn Atorvastatin( M=558,64mg, cân bằng cân phântích StarTorius) pha trong 5÷ 7mL metanol, rung siêu âm 15-20 phút và chuyểnvào bình định mức 25,00mL và định mức tới vạch, được dung dịch có nồng độ10mM

Dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh, các dung dịch đo có nồng độthấp hơn được pha từ dung dịch gốc và dùng trong ngày

2.4 Xử lý mẫu

Cân mười viên thuốc có hàm lượng của Atorvastatin bằng cân phân tích, đemnghiền bằng cối mã não Cân một lượng thuốc chính xác trên cân phân tích, thêm 5-7mL metanol vào cốc 100mL, rung siêu âm 15- 20 phút cho thuốc tan hết Lọc dungdịch bằng giấy lọc băng xanh vào bình định mức 25,00mL Sau đó pha loãng và đotrên hệ thiết bị Autolab

2.5 Đánh giá thông số phân tích

2.5.1 Xây dựng đường chuẩn

2.5.2 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng của phương pháp(LOQ)

Giới hạn phát hiện( LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích màphương pháp phân tích có thể xác định được Dựa vào phương trình hồi quy có thểtính được LOD

LOQ=10

Là đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi tiến hành trên cácmẫu thử giống hệt nhau, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong

cùng điều kiện thí nghiệm( cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thínghiệm, trong các khoảng thời gian ngắn).

Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độlệch chuẩn tương đối (RSD%)

Công thức tính độ lêch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) như sau :

S

SD RSD

tb

=

Trong đó:

- Si: chiều cao pic

- Stb: chiều cao trung bình của n lần chạy

- n: số lần chạy lặp( n =6)

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các đặc tính điện hóa của Atorvastatin bằng phương pháp von- ampe vòng( CV)

3.1.1 Khảo sát quá trình hấp phụ của Atorvastatin trên điện cực than gương.

Để hiểu được quá trình điện hóa xảy ra trên bề mặt điện cực than gương, phươngpháp von-ampe vòng được sử dụng để nghiên cứu

Điều kiện đo: Nồng độ Atorvastatin 5.10-5M, thế bắt đầu 0V, thế kết thúc+1,3V, tốc độ quét 10mV/s

Hình 3: Đường CV tại pH=4 Đường a là đường CV nền đệm khi có thờigian tích lũy 60s, đường b là đường CV của Atorvastatin 5.10-5M khi không hấpphụ làm giàu, đường c là đường CV của Atorvastatin 5.10-5M khi hấp phụ làm giàu

60s

Đường CV ghi trong trường hợp có hấp phụ tại thế 0V, thời gian hấp phụ60s, có giá trị cường độ dòng tăng gấp 1,5 lần khi không có hấp phụ làm giàu

Trên đường phân cực anot( 0V đến +1,3V) có xuất hiện 1 píc anot tại thế Ep

= +1,01V, trên đường phân cực catot(+1,3V đến 0V) không xuất hiện píc nào Nhưvậy, quá trình điện hóa của Atorvastatin là bất thuận nghịch

Hình 4: Đường von-ampe vòng quét 5 vòng liên tục có hấp phụ 60s tại thế0V: 1- quét vòng thứ nhất, 2- vòng quét thứ 2; 3,4,5- vòng quét thứ 3,4,5Đường CV được quét 5 vòng, vòng đầu tiên thì giá trị cường độ dòng cao hơn, 4vòng sau đó thì giá trị cường độ dòng thấp hơn Nguyên nhân là do, quét vòng thứnhất, Atorvastatin đã được hấp phụ trên bề mặt điện cực tại thế 0V, thời gian hấpphụ 60s, sau khi quét vòng thứ nhất thì chất phân tích đã được hòa tan ra khỏi bềmặt điện cực, vòng thứ 2 cao hơn các vòng 3, 4, 5 có lẽ do chất chưa được hòa tan