Khảo sát đặc điểm vi học và hợp chất alkaloid của cây Tơ xanh (Cassytha filiformis L.)

Góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Tơ xanh (Cassytha filiformis L.), chống nhầm lẫn với Tơ hồng (Cuscuta sinensis Lamk.), nghiên cứu này tiến hành khảo sát đặc điểm vi học và hóa học, đặc biệt là nhóm aporphinoid của Tơ xanh.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VI HỌC VÀ HỢP CHẤT ALKALOID CỦA CÂY TƠ XANH (CASSYTHA FILIFORMIS L.) Bùi Thế Vinh*, Trần Công Luận** TĨM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Tơ xanh (Cassytha filiformis L.), chống nhầm lẫn với Tơ hồng (Cuscuta sinensis Lamk.), nghiên cứu tiến hành khảo sát đặc điểm vi học hóa học, đặc biệt nhóm aporphinoid Tơ xanh Đối tượng nghiên cứu: Cây Tơ xanh thu hái tỉnh Long An, định danh phòng Tài nguyên Dược liệu, Trung tâm Sâm Dược liệu Tp HCM Khảo sát đặc điểm thực vật học kính hiển vi; phân lập xác định cấu trúc kỹ thuật sắc ký kỹ thuật phổ Kết quả: Từ mẫu thực vật tươi Tơ xanh, khảo sát đặc điểm vi học, vi phẫu; qua sắc ký cột silicagel pha thuận phân lập xác định cấu trúc aporphine alkaloid cassythin Kết luận: Khảo sát đặc điểm vi học nhóm chất alkaloid Tơ xanh (Cassytha filiformis L.), phân lập xác định cấu trúc aporphin alkaloid cassythin Từ khóa: Tơ xanh, aporphin alkaloid, cassythin ABSTRACT STUDIES ON MICROSCOPIC CHARACTERISTICS AND THE ALKALOID OF CASSYTHA FILIFORMIS L Bui The Vinh, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No - 2016: 191 - 196 Objectives: This study was developed to reveal a standardization of this plant Materials and methods: Phytology research was performed by determination the microscopic characteristics; isolation and structural elucidation based on chromatography and spectrum technique Results: The botany characteristics, microscopic characteristics and the strutural elucidation of one aporphine alkaloid were reveal Conclusions: The botany characteristics, microscopic characteristics and the strutural elucidation of one aporphine alkaloid named cassythine Keywords: Cassytha filiformis L., cassythine, aporphinoid alkaloid dương, mắt mờ, chân tay yếu mỏi(4,5) Tuy ĐẶT VẤN ĐỀ nhiên, có dược liệu với hình thái Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) tương tự Tơ xanh tính vị, cơng thuốc dân gian dùng từ lâu phổ dụng hoàn toàn khác hẳn Tơ xanh Tơ biến nhiều nước giới hồng (Cuscuta sinensis Lamk.) Với mục tiêu Indonesia Châu Phi dùng chữa giun sán, ký góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Tơ xanh, sinh trùng, Trung Quốc dùng chữa vàng da chống nhầm lẫn với Tơ hồng; nghiên cứu trẻ em Nước ta, Tơ xanh xem tiến hành khảo sát đặc điểm vi học hóa học, vị thuốc dân gian có ích, nước sắc Tơ đặc biệt nhóm aporphinoid Tơ xanh xanh dùng làm thuốc bổ, chữa thận hư, liệt  Trung tâm Sâm Dược liệu , ** Trường Đại học Tây Đô Tác giả liên lạc: DS Bùi Thế Vinh ĐT: 0918 0918 64 Email: buithe_vinh@yahoo.com.vn 191 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 NGUYÊNLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nguyên liệu nghiên cứu Khảo sát đặc điểm thực vật học Cây Tơ xanh (thân bán ký sinh chủ) thu hái tỉnh Long An, định danh phòng Tài nguyên Dược liệu, Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh Thân Dài 1,5 – m hay hơn, dây leo, xoắn, thân có rãnh dọc, có lơng nâu mịn, nhẵn Màu vàng lục đến xanh lục, tiết diện tròn, dẹp, đường kính trung bình 1,5 – mm, khoảng cách lóng -9 cm, nhánh thường bên mọc thẳng góc với trục Không thấy nhánh cấp Phương pháp Khảo sát đặc điểm thực vật học Mơ tả hình thái ngồi đặc điểm hoa, hạt mẫu tươi Khảo sát đặc điểm vi phẫu cắt ngang thân tươi với thuốc nhuộm kép đỏ carmin lục iod, khảo sát đặc điểm bột dược liệu Khảo sát thành phần alkaloid Định tính nhóm alkaloid phản ứng hóa học sắc ký lớp mỏng: Làm ẩm 10 g bột dược liệu NH4OH 10%, ngâm chiết với 100 ml CH2Cl2 x lần Gộp dịch chiết CH2Cl2 cô giảm áp đến cắn Hòa phần cắn với lượng H2SO4 1% vừa đủ thực phản ứng định tính với thuốc thử alkaloid đặc trưng: Dragendorff, Mayer, Bouchardat Phần cắn lại hòa với CH2Cl2 thực sắc ký lớp mỏng với hệ pha động CH2Cl2 : MeOH : NH4OH (9 : : giọt), phát thuốc thử Dragendorff Chiết xuất, phân lập alkaloid: 4,2 kg Bột Tơ xanh kiềm hóa dung dịch NH4OH 15% đến pH 10 Thêm CH2Cl2 đến ngập bề mặt bột Tơ xanh Ngâm khoảng 12 giờ, có khuấy trộn, lọc thu dịch chiết Kiểm tra diện alkaloid dịch chiết phương pháp sắc ký lớp mỏng, sau tiến hành cô quay giảm áp thu cao chiết, dung môi CH2Cl2 thu hồi sử dụng để chiết tiếp bã dược liệu Quy trình lặp lại dịch chiết khơng alkaloid Cao alkaloid tổng thu 380 g Dùng 10 g cao tiến hành sắc ký qua nhiều cột silica gel pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với độ phân cực tăng dần (100:0; 99:1; 98:2 đến 95:5) Thu nhận 27 mg chất A kết tinh hình kim, màu cam nhạt 192 Lá Tiêu giảm thành vảy, vảy hình tam giác dài khoảng 1-1,5mm Nơi thân tiếp xúc với phận chủ hay với thân có giác mút hình bầu dục kích thước 1-1,5 mm Hoa Cụm hoa dạng gié, mọc nhánh bên Trục mang hoa dài 1,5-5 cm, màu xanh, có lơng mịn nốt bì khổng, mang khoảng hoa, hoa khơng cuống Hoa lưỡng tính, màu trắng, chưa nở có hình trứng cỡ 1,5-2 mm Đài Có đài phụ, đài màu xanh có lơng nâu Lá đài dính đáy, tồn với vành hoa đến Vành: Có vành hoa màu trắng Đài vành dính đáy Nhụy đực: xếp thành luân sinh, luân sinh gồm tiểu nhụy Ln sinh ngồi dính vào cánh hoa, ln sinh lép Tiểu nhụy khai nắp Nhụy cái: Bầu nỗn thượng, bầu nhụy, vòi, hoa Quả Giả quả, đài vành không rụng mà đồng trưởng tạo thành bao dày, mọng, màu xanh, có chất nhầy Giả hình cầu, kích thước 5-8 mm, trơn nhẵn Bao lấy bế bên trong, hình trứng nhọn đầu, chín màu nâu đen, vỏ sù sì, kích thước khoảng 3-4 mm Hạt Trong hạt có mầm to, màu xanh lục nhạt, có lớp vỏ, bao ngồi lớp vỏ cứng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 đen nâu Đặc điểm Tơ xanh qua khảo sát nhiều mẫu có đặc tính cấu tạo chung trên, phù hợp với tài tiệu công bố (4,5) Tuy nhiên, Tơ xanh loài sống bán kí sinh, tùy vào chủ mà đặc điểm sinh học khác kích thước màu sắc Vi phẫu thân Thân tiết diện tròn, ngồi lớp biểu bì kích thước có cutin dày, mang nhiều Nghiên cứu Y học lông che chở đơn bào Mô dày phiến – lớp, vùng mô mềm vỏ đạo chiếm khoảng 4-6 lớp, rải rác có hạt lục lạp Nội bì khơng rõ, sợi trụ bì xếp thành cụm úp bó libe 1, khoảng 20-26 bó libe gỗ xếp vòng, bó gỗ nhỏ, 3-4 mạch phân hóa li tâm rõ, bên cạnh gỗ quanh mô mềm tủy có mạch gỗ hậu mộc to Mơ mềm tủy kích thước to, dạng gần tròn xếp chừa đạo nhỏ Hình Dạng hoa, hạt Tơ xanh Lơng che chở Biểu bì có cutin Mô dày Mô mềm vỏ Sợi mô cứng Libe Mơ mềm tủy Gỗ Hình Vi phẫn thân Tơ xanh 193 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Hình Các cấu tử bột dược liệu (1: Lông che chở; 2: Mảnh mạch điểm; 3: Biểu bì lỗ khí; 4: Bó sợi mô cứng; 5: Mảnh mạch xoắn) thơm (1608,73; 1516,53; 1410,51 cm-1); C-O-C Bột dược liệu (1249,08 cm-1); O-CH2-O (1054,86; 869,21 cm-1) Bột màu nâu xám, mùi cỏ đặc trưng Trong bột tìm thấy nhiều cấu tử: Lơng che chở gập đứt gãy, mảnh biểu bì với nhiều lỗ khí kiểu song bào xếp thành dãy, mảnh mạch xoắn, mạch điểm, bó sợi mơ cứng, khối chất nhựa màu cam Khảo sát thành phần alkaloid Định tính alkaloid phản ứng hóa học Thuốc thử Dragendorff Bouchardat Mayer Kết định tính Ghi +++ +: Phản ứng dương tính +++ +++: Phản ứng dương tính rõ +++ Kết định tính phản ứng hóa học sắc ký lớp mỏng cho thấy mẫu chiết có diện nhóm alkaloid rõ Trên sắc ký đồ, thấy vết chất bắt màu dương tính với thuốc thử Dragendorff, cho thấy Tơ xanh có nhiều hàm lượng loại alkaloid Phân lập biện giải cấu trúc alkaloid phân lập A chất kết tinh hình kim, màu nâu, tan tốt dung môi phân cực methanol, không tan nước Phổ UV cho đỉnh hấp thu 220 nm, 283 nm, 303 nm Phổ IR cho tín hiệu nhóm chức OH (3416,63 cm-1); C=C nhân 194 Hình 4: Định tính alkaloid sắc ký lớp mỏng hệ dung môi: CHCl3 : MeOH : NH4OH (9:1:0,5); mẫu: Alkaloid toàn phần; phát thuốc thử Dragendorff Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng ứng với diện hai nhóm proton methoxy H [4,06 (3H; s; 3-OMe); 3,87 (3H; s; 10-OMe)], bốn nhóm proton methylen có nhóm vùng trường thấp [H 6,12; H 6,01 (OCH2-O, A; O-CH2-O, B)], số nhóm lại vùng trường cao [2,96; 2,98 (H-4A; H-4B); 3,73; 3,35 (H-5A, H-5B); 3,02; 2,84 (H-7A, H-7B)], ba nhóm proton methin H [4,36 (1H;H-6a), 6,75 (1H; H-8), 7,63 (1H; H-11)] Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Các liệu phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy A1 có tổng số 19 carbon cho tín hiệu phổ từ 20 ppm đến 150 ppm Trong có 10 carbon bậc IV (C), carbon bậc III (CH), carbon bậc II (CH2) carbon bậc I (CH3) Tất 10 carbon bậc IV dịch chuyển vùng trường thấp (δC từ 115 ppm đến 150 ppm) Trong có carbon mang dị tố oxy (δC 145,73; 137,66; 148,48; 147,41 ppm), carbon lại nối đôi Nghiên cứu Y học tác với C-1, C-2 carbon bậc IV (δC 140,61) carbon bậc IV C-3 C-3ª Cả hai proton methylen (δH 2,96; δH 2,96) hai proton methylen (δH 3,73; δH 3,35) cho tương tác với carbon bậc IV (δC 117,54) nên carbon bậc IV (δC 140,61) phải vị trí C-3 carbon bậc IV (δC 117,54) phải vị trí C3a Thêm vào hai proton methylen (δH 2,96; δH 2,96) có tương tác với C-3, carbon bậc IV (δC 122,13) carbon methylen (δC 42,55), nên carbon bậc IV (δC 122,13) phải vị trí C-1b, carbon methylen (δC 42,55) vị trí C-5 hai proton methylen (δH 2,96; δH 2,98) gắn với carbon (δC 21,47) vị trí C-4 Hơn H-5A, H-5B tương quan với C-3a, C-4 carbon bậc III (δC 54,52) nên carbon bậc III phải C-6a Trong số carbon bậc III có carbon vùng trường cao (δC 54,52 ppm; δH 4,36 ppm), carbon lại vùng trường thấp (110 – 115 ppm) Có carbon bậc II, có carbon bậc II xuất vùng trường thấp [δC 102,73 ppm, δH (6,12; 6,01) ppm] Đây đặc trưng nhóm methylendioxid thường gặp alkaloid chi Stephania Các carbon bậc II lại carbon mang nối đơn xuất vùng trường cao [δC 42,55 ppm; δH (3,73; 3,31) ppm], [δC 33,67 ppm; δH(3,02; 2,84) ppm], [δC 21,47 ppm; δC (2,96; 2,98) ppm] Dựa vào phổ COSY (PL 6.4.6), H-6a ghép cặp với hai proton methylen (δH 3,02; δH 2,84), nên hai proton H-7a, H-7b Hai proton H-7a, H-7b lại gắn với carbon (δC 33,67) carbon C-7 Phổ HMBC cho thấy H-6a có tương quan với carbon bậc IV (δC 112,25) mà khơng tương quan với carbon bậc IV (δC 125,78) H-7 ngược lại, nên (δC 112,25) vị trí C-1a, (δC 125,78) vị trí C-11a Ngồi ra, H-6ª H-7 tương quan với carbon bậc IV (δC 123,23), nên (δC 123,23) vị trí C-7a H-7a tương quan với hai carbon methine (δC 111,89; δC 116,16) proton methin (δH 6,75) khơng tương quan với carbon methin (δC 111,89), nên (δC 111,89) vị trí C-11 (δC 116,16) vị trí C-8 Cả hai H-7a H-8 có tương quan với carbon bậc IV (δC 148,48), nên (δC 148,48) vị trí C-9 Còn lại vị trí C-10 Dựa kết phổ kết hợp so sánh tài liệu tham khảo (1) (2) (3), nhận định chất A aporphin alkaloid tên gọi cassythin Trong nhóm methyl, có nhóm có độ dời hóa học đặc trưng nhóm methoxy [δC 60,12 ppm; δH (4,06; 3H) ppm] [δC 56,66 ppm; δH (3,87; 3H) ppm] Với liệu phổ NMR ta dự đốn A1 alkaloid có nhóm methylen dioxid, hai nhóm methoxy, hai nhóm methylen, nhóm NH nhóm -OH Tham khảo tài liệu cơng bố đặc điểm phổ NMR dự đốn A1 khung aporphin Dựa vào phổ HMBC (PL 6.4.5), hai proton nhóm methylen dioxid (6,12 6,01) có tương tác với hai carbon bậc IV δC (145,73 137,66, C-1 C-2) Thêm vào proton nhóm methoxy δH (4,06) có xuất tương Bảng Kết phổ NMR A so sánh với Cassythine Alkaloid A1 Vị trí 1a 1b H (a) - 13 C (a) 145,73 112,25 122,13 137,66 HMBC COSY Cassythine [3] 13 H (b) C (b) 143 111,1 128,8 135,1 195 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Alkaloid A1 Vị trí 3a 4A 4B 5A 5B 6a 7A 7B 7a 10 11 11a 3-OMe 10-OMe O-CH2-O A B 13 H (a) 2,96 m 2,98 m 3,73 dd 3,31 m 4,36 (dd) 3,02 m 2,84 t 6,75 7,63 4,06 3,87 6,12 6,01 C (a) 140,61 117,54 21,47 21,47 42,55 42,55 54,52 33,67 33,67 123,23 116,16 147,41 148,48 111,89 125,78 60,12 56,66 102,73 102,73 HMBC COSY C1b, C3, C3a, C5 H5 C3a, C4, C6a H4 C1b, C7, C7a H7 C1b, C6a, C7a, C8, C11a H6a C7, C7a, C9, C11a C1a, C7a, C9, C10, C11a C1, C2, C3 C9, C10 C1, C2 Cassythine [3] 13 H (b) C (b) 139,8 119,5 2,68-2,74 m 23,9 2,68-2,74 m 23,9 3,39 m 43,1 2,94 m 43,1 3,87 dd 53,8 2,78 36,5 2,65 m 36,5 128,5 6,79 s 114,2 144,6 145,4 7,59 s 109,7 123,3 4,01 s 59,4 3,92 s 56,2 6,1 100,5 5,9 100,5 (a) Phổ A đo MeOH, 1H-NMR 500 MHz 13C-NMR 125 MHz (b) Phổ Cassythine đo CDCl3, 1H-NMR 400,13 MHz 13C-NMR 100,62 MHz OMe chuẩn dược liệu này, đồng thời dùng O O 3a H 6a H 11a 11 7a 10 MeO TÀI LIỆU THAM KHẢO N 1b 1a Cassythine làm chất chuẩn đối chiếu đánh giá chất lượng hàm lượng dược liệu này, chống nhầm lẫn với Tơ hồng OH Hình Công thức cassythin KẾT LUẬN Nghiên cứu khảo sát đặc điểm vi học nhóm chất alkaloid Tơ xanh (Cassytha filiformis L.), phân lập xác định cấu trúc aporphine alkaloid cassythin Kết nghiên cứu góp phần xây dựng tiêu 196 Chang FR, Chao YC, Teng CM and Wu YC (1998) Chemical constituents from Cassytha filiformis L Journal of Natural products, 61(7), 863-866 Hoet S, Stevigny C, Block S, Opperdoes S, Colson P, Baldeyrou B, Lansiaux A, Bailly C and Quetin-Leclercq J (2004) Alkaloid from Cassytha filiformis and Related Aporphines: Antitrypanosomal Activity, Cytotocixicity, and Interaction with DNA and Topoisomerases Planta Med., 70, 407-413 Stevigny C, Block S, De Pauw-Gillet MC, De Hoffmann E, Liabres G, Adjakidje V and Quetin-Leclercq J(2002) Cytotoxic Aporphine Alkaloid from cassytha filiformis Planta Med., 68, 1042-1044 Viện dược liệu (2003) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (tập2) NXB Khoa học kĩ thuật, 978 Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học, 1236 Ngày nhận báo: 30/08/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/09/2016 Ngày báo đăng: 25/11/2016 ... vật học Mơ tả hình thái đặc điểm hoa, hạt mẫu tươi Khảo sát đặc điểm vi phẫu cắt ngang thân tươi với thuốc nhuộm kép đỏ carmin lục iod, khảo sát đặc điểm bột dược liệu Khảo sát thành phần alkaloid. ..Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 NGUYÊNLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nguyên liệu nghiên cứu Khảo sát đặc điểm thực vật học Cây Tơ xanh (thân bán ký... mầm to, màu xanh lục nhạt, có lớp vỏ, bao lớp vỏ cứng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 đen nâu Đặc điểm Tơ xanh qua khảo sát nhiều mẫu có đặc tính cấu tạo chung trên, phù hợp với tài