Nội dung bài viết trình bày về nghiên cứu về thành phần alkaloid trong rễ cây trinh nữ hoàng cung tiến hành nghiên cứu trên cao toàn phần rễ trinh nữ hoàng cung ở Bình Định được chiết xuất bằng ethanol 70% tại bộ môn hóa phân tích kiểm nghiệm, khoa dược Thành phố Hồ Chí Minh năm 2014.
Trang 1NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT ALKALOID
TỪ RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG
CRINUM LATIFOLIUM L., AMARYLLIDACEAE
Lê Ngọc Tú*, Khổng Minh Thương*, Võ Thị Bạch Huệ*, Nguyễn Hồng Thiên Thanh*;
Nguyễn Hữu Lạc Thủy*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Cao chiết từ rễ của Crinum latifolium L Amaryllidaceae được sử dụng làm thuốc phổ
biến trong điều trị các bệnh như u xơ cổ tử cung, u phì đại lành tính tuyến tiền liệt (1) Y học hiện đại đã chứng minh tính kháng khối u của nhiều hợp chất có nguồn gốc từ c}y n|y, như lycorin, 1,2 - β epoxy Ambellin, Undulatin, 6-Hydroxy Crinamidin Trong nghiên cứu này, hai hợp chất alcaloid tinh khiết Crinamidin (200 mg), Lycorine (2000 mg) được phân lập từ 20 g cao alkaloid toàn phần của rễ cây Trinh
Nữ Hoàng cung Các cấu trúc hóa học của chúng được làm sáng tỏ bằng cách sử dụng c{c phương ph{p phân tích quang phổ (IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR) Bằng c{ch n|y, Crinamidin, Lycorin đã được xác định Đ}y l| thông b{o đầu tiên về việc phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký v| định danh Lycorin, Crinamidin từ rễ cây TNHC Crinum latifolium thu hái tại Việt Nam
Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu về thành phần alkaloid trong rễ cây TNHC
Đối tượng: Cao toàn phần rễ TNHC ở Bình Định được chiết xuất bằng ethanol 70% tại bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Khoa Dược TP.HCM năm 2014
Phương pháp nghiên cứu: 1 Rễ TNHC được rửa sạch, phơi khô, xay nhuyễn, ngấm kiệt với cồn 70%,
cô thu hồi cồn thu được cao cồn toàn phần của rễ 2 Xây dựng quy trình chiết alkaloid toàn phần từ cao cồn
rễ TNHC 3 Phân lập c{c ph}n đoạn alkaloid từ cao cồn rễ TNHC bằng phương ph{p sắc ký cột nhanh thu
được 10 ph}n đoạn C{c ph}n đoạn chọn lọc có khối lượng cao hoặc có nhiều alkaloid được tiến hành sắc ký cột cổ điển thu được các hợp chất alkaloid Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất phân lập được bằng SKLM v| HPLC 4 X{c định cấu trúc của các hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập được bằng c{c phương
pháp phổ nghiệm như UV, IR, MS, NMR
Kết quả: Từ 900 g cao cồn rễ TNHC toàn phần, thu được 20 g cao alkaloid (hiệu suất 2,22%) Bằng
các kỹ thuật sắc ký, đã ph}n lập được 6 alkaloid (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A, F8.A) Trong số này, 2 hợp chất alkaloid F5.A, F6.A.1 được tiếp tục khảo sát cấu trúc bằng c{c phương ph{p phổ nghiệm Kết quả các hợp chất F5.A (200 mg) v| F6.A (2000 mg) được x{c định trình tự là crinamidin, lycorin với độ tinh khiết (HPLC) lần lượt là 99,95% và 100%
Kết luận: Từ cao alkaloid toàn phần rễ TNHC bằng kỹ thuật sắc ký đã ph}n lập được hai thành phần
alkaloid (crinamidin, 200 mg và lycorin 2000 mg) Hai thành phần này có thể làm chất đ{nh dấu trong tiêu
chuẩn hóa nguyên liệu và các sản phẩm thuốc từ dược liệu
Từ khóa: Crinum latifolium L., Amaryllidaceae, alkaloid, sắc ký cột, crinamidin, lycorin
*Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS Lê Ngọc Tú ĐT: 0903 741 927 Email: truongtyca@yahoo.com
Trang 2ABSTRACT
ISOLATION OF ALKALOIDS FROM THE ROOTS OF CRINUM LATIFOLIUM L
Le Ngoc Tu, Khong Minh Thuong, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Hong Thien Thanh, Nguyen Huu Lac Thuy * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:162 – 168
Introduction: Extracts from roots of Crinum latifolium L Amaryllidaceae are used as popular
medicine in the treatment of of diseases such as cervical fibroma, prostate enlargement (1) Modern medicine has demonstrated the anticancer properties of many compounds derived from this plant, such as lycorine, 1,2 β epoxy Ambelline, Undulatine, 6-Hydroxy Crinamidine In this study, two alcaloid compounds
Crinamidine (200 mg), Lycorine (2000 mg) were isolated from alkaloid total extract (20 g) of the roots Their chemical structures were elucidated using spectroscopic analyses (IR, UV, 1 H-NMR, 13 C-NMR) By this means, Crinamidine, Lycorine were identified This is the first announcement on the isolation of Lycorine and Crinamidine using chromatographic techniques and also this is the first time Lycorine and Crinamidine were isolated and identified from the roots of Crinum latifolium L.collected at Vietnam country
Objectives: Chemical components of alkaloids in roots of Crinum latifolium were studied
Materials: Total extract of Crinum latifolium roots in Binh Dinh province was extracted with 70%
ethanol at the department of Analytical Chemistry and Drug Quality Control, Faculty of Pharmacy, HCMC in 2014
Methods: 1 Roots from Crinum latifolium were washed, dried, milled, percolated with 70% ethanol,
then recovered solvent to get total alcohol roots extract 2 Extraction process of total alkaloid from alcohol roots extract was built 3 Isolation of alkaloids from alcohol roots extract by flash column chromatography
to collect ten fractions From selected fractions, pure compounds were isolated by column chromatography The purity of these compounds was tested by TLC and HPLC 4 The structure of these compounds was determined by spectroscopic methods such as UV, IR, MS, NMR
Results and discussions: From 900 g of total roots extract, 20 g total alkaloid extract was collected
(yield point : 2.22%.) By chromatography methods, 6 alkaloids (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A, F8.A) were isolated In which 2 alkaloids F5.A and F6.A were determined the struture by spectroscopic methods The compound F5.A (200 mg) and F6.A (2000 mg) were crinamidine and lycorine respectively with the purity were 99,95% and 100% by HPLC
Conclusions: From the total alkaloid extract of the roots of Crinum latifolium L., by means of
chromatographic techniques, two pure alkaloids (crinamidine, 200 mg and lycorine, 2000 mg) were isolated They can be used as chemical markers for standardization of raw materials as well as products contained this medicinal plant as a component
crinamidine, lycorine
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ lâu, Trinh nữ ho|ng cung (TNHC) đã
đƣợc biết đến là một cây thuốc có t{c dụng
trong điều trị một số bệnh nhƣ phì đại tuyến
tiền liệt; u xơ tử cung< Th|nh phần hoạt chất
chính của dƣợc liệu n|y l| c{c alkaloid Đã có
kh{ nhiều nghiên cứu về th|nh phần hóa học của th}n h|nh, l{ v| hoa TNHC; nhƣng c{c nghiên cứu về th|nh phần hóa học - đặc biệt l| nhóm alkaloid - trong rễ TNHC hiện vẫn còn rất ít Do vậy, đề t|i “Nghiên cứu phân lập hợp chất alkaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung
Trang 3Crinum latifolium L Amaryllidaceae” được x}y
dựng nhằm chiết xuất alkaloid toàn phần,
phân lập các hợp chất alkaloid tinh khiết, x{c
định cấu trúc c{c alkaloid ph}n lập được nhờ
v|o c{c phương ph{p phổ nghiệm
NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Rễ TNHC thu h{i tại tỉnh Bình Định (tháng
3 năm 2014 v| th{ng 3 năm 2016)
Phương pháp nghiên cứu
- Rễ TNHC được rửa sạch, phơi khô, xay
và rây qua rây 500, ngấm kiệt với cồn 70%, cô
thu hồi cồn thu được cao cồn toàn phần của rễ
- Xây dựng quy trình t{ch nhóm alkaloid
toàn phần từ cao cồn rễ TNHC
- Bằng phương ph{p sắc ký cột ch}n không
(VLC), cao alkaloid toàn phần được t{ch th|nh
c{c ph}n đoạn C{c ph}n đoạn chọn lọc được
tiếp tục sắc ký cột cổ điển và tinh chế để thu
được các hợp chất alkaloid Kiểm tra độ tinh
khiết của các hợp chất phân lập được bằng
SKLM và HPLC
- X{c định cấu trúc của các alkaloid tinh
khiết phân lập được bằng c{c phương ph{p
phổ nghiệm như UV, IR, MS, NMR
KẾT QUẢ
Chiết xuất các alkaloid từ cao cồn rễ TNHC
- Nguyên liệu rễ TNHC (thu hái tại Bình
Định, th{ng 3/2014) được rửa sạch, phơi khô,
chiết ngấm kiệt với cồn 70% Cô thu hồi dung
môi thu được 900 g cao cồn rễ TNHC Cao này
được đóng gói trong bao PE kín, cho bao v|o
hộp thủy tinh và bảo quản trong tủ lạnh ở
nhiệt độ 5 oC Đến th{ng 12 năm 2015, từ 900 g
cao cồn rễ TNHC n|y, tiến h|nh chiết theo sơ
đồ 1 thu được 20 g cao alkaloid to|n phần (gọi
là cao I, hiệu suất 2,2%)
- Song song, từ 10 g rễ TNHC (thu h{i tại Bình
Định, th{ng 3/2016) được chiết bằng cồn 70% thu
được cao cồn rễ TNHC Sau đó, chiết tiếp theo sơ
đồ 1 để thu được 270 mg cao alkaloid toàn phần
(gọi là cao II, hiệu suất 2,7%)
Sơ bộ so s{nh th|nh phần alkaloid có trong cao I (chiết từ cao cồn rễ, 2014, được bảo quản trong c{c điều kiện đã ghi) v| trong cao II (chiết từ rễ vừa thu hái, 2016)
Qui trình t{ch cao alkaloid từ cao cồn của
rễ TNHC
Cao c n
Cao khô
ch acid
ch acid
Cao alkaloid toàn phần
Cô thu h i c n
+ HCl 1%; c
o i ch EtOAc
L c v i EtOAc
Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết cao alkaloid toàn phần từ cao
cồn của rễ TNHC
- So s{nh sơ bộ th|nh phần hóa học của cao I v| cao II bằng kỹ thuật SKLM
Nhận xét: Th|nh phần c{c vết của cao I v| cao II có Rf tương đương nhau Th|nh phần alkaloid của cao I v| cao II thì tương đương nhau Do vậy, cao I được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu hóa học (Hình 1)
Tách các phân đoạn alkaloid bằng phương pháp VLC
Tách cao alkaloid toàn phần I bằng sắc ký cột ch}n không (VLC), thu được 10 ph}n đoạn
có độ phân cực tăng dần (gọi tên lần lượt là F1, F2 F10) C{c ph}n đoạn n|y được kiểm tra bằng SKLM Ph}n đoạn F2, F4, F5, F6, F7, F8
Trang 4được chọn để tách tiếp vì có khối lượng đủ lớn v| tương đối ít tạp (hình 2)
Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff
Hệ dung môi khai triển CHCl 3 – MeOH – NH 4 OH (5 : 1 : 0,05)
Hình 1: Sắc ký đồ so sánh các alkaloid từ cao I (vết 1) và cao II (vết 2)
Hệ dung môi khai triển CHCl 3 – MeOH – NH 4 OH (5 : 1 : 0,05)
Hình 2: Sắc ký đồ kiểm tra c{c ph}n đoạn qua cột VLC T: Vết chấm cao alkaloid toàn phần (cao I) F1 ® F10: vết chấm của c{c ph}n đoạn F1 ® F10
Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff
Hệ dung môi khai triển CHCl 3 – MeOH – NH 4 OH (5 : 1 : 0,05)
Hình 3: Sắc ký đồ các hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập được từ cao I T: vết chấm cao alkaloid toàn phần
(cao I) F2A ® F8A: vết chấm của các alkaloid tinh khiết ph}n lập được
Trang 5Phân lập và tinh chế các hợp chất alkaloid
Ph}n đoạn F5 v| F6 có nhiều tủa Lọc riêng
biệt c{c tủa n|y, sau đó kết tinh lại nhiều lần
bằng cách hòa tan ấm trong dung môi thích
hợp; lọc loại tạp và kết tinh ở nhiệt độ phòng
Từ ph}n đoạn F5 đã thu được 200 mg
alkaloid (gọi tên là F5.A; kiểm tra độ tinh khiết
bằng HPLC: 99,95%)
Từ ph}n đoạn F6 đã thu được 2000 mg
alkaloid (gọi tên là F6.A; kiểm tra độ tinh khiết
bằng HPLC: 99,99%)
Hai alkaloid n|y được tiếp tục khảo s{t để
x{c định cấu trúc
Các alkaloid tinh khiết từ c{c ph}n đoạn
khác có khối lượng ít được lưu dưới tên F2.A,
F4.A, F7.A, F8.A (Hình 3)
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Hợp chất F5.A
- SKLM: với hệ dung môi CHCl3 – MeOH –
NH4OH (5 : 1 : 0,05); trên bản mỏng silica gel
F254 (Merck), hợp chất F5.A cho một vết có
hình dạng, m|u sắc v| gi{ trị Rf tương đương
với chất đối chiếu crinamidin
- Phổ UV/MeOH: có 3 đỉnh hấp thu cực đại
ở bước sóng 210, 281 và 373 nm
- Phổ MS: Phổ khối của F5.A cho mảnh tín
hiệu có m/z = 318,1235 [M+H]+ phù hợp với
phân tử khối của crinamidin (C17H19NO5= 317)
- Phổ NMR: Hợp chất F5.A được đo phổ
NMR (CDCl3, m{y 500 MHz) v| so s{nh với
c{c dữ liệu phổ tương ứng của Crinamidin
(CDCl3, m{y 500 MHz) trong TLTK(2) Kết quả
cho thấy c{c dữ liệu phổ NMR của F5.A thì
ho|n to|n phù hợp với Crinamidin (xem
Bảng 1)
Bảng 1: So s{nh dữ liệu phổ NMR (CDCl 3 , 125/500 MHz) của F5.A v| Crinamidin (2)
ị tr phân p được Crinamidin(2)
C, ppm H, ppm,
mult., (J, Hz) C, ppm H, ppm, mult
-CH 2 O- 100,7 5,87 dd (6,5;
Nhận xét: Hợp chất alkaloid F5.A phân lập được từ rễ TNHC chính l| Crinamidin
14
12
11 10b
10a
10 9
8
7 6a 6 5
4a
4 3
2 1
N O
O
O
OMe
OH
13
(F5.A) = Crinamidin
Trang 6N O
O
OH
3 4 4a
5 6
6a 7 8
9 10
10a
10b
11 12 13
(F6.A) = Lycorin
Hợp chất F6.A
- SKLM: với hệ dung môi CHCl3 – MeOH –
NH4OH (5 : 1 : 0,05); trên bản mỏng silica gel
F254 (Merck), hợp chất F6.A cho một vết có
hình dạng, m|u sắc v| gi{ trị Rf tương đương
với chất đối chiếu lycorin
- Phổ UV/MeOH: F6.A cho 3 đỉnh hấp thu
cực đại ở bước sóng 203, 238 và 288 nm
- Phổ IR/KBr, ν (cm-1): 3333 (-OH);
3100-3000 (CHarom); 1500 (C=Carom); 1037 (-OCH2O)
- Phổ MS: Phổ khối của F5.A cho mảnh tín
hiệu có m/z = 288,1246 [M+H]+ phù hợp với
công thức của lycorin (C16H17NO4= 287)
- Phổ NMR: Hợp chất F6.A được đo phổ
NMR (DMSO-d6, m{y 500 MHz) v| so s{nh với
c{c dữ liệu phổ tương ứng của Lycorin
(DMSO-d6, m{y 500 MHz) trong TLTK(4) Kết quả cho
thấy c{c dữ liệu phổ NMR của F5.A thì ho|n
to|n phù hợp với Lycorin (xem Bảng 2)
Bảng 2: So s{nh dữ liệu phổ NMR (DMSO-d 6 , 125/500 MHz) của F6.A v| Lycorin (4)
ị tr
C, mult H, ppm, mult.,
(J, Hz) C, ppm H, ppm, mult
6 56,7 t 4,01 d (14,0);
3,32 d (14,0) 56,65 t 4,02 d; 3,34 d
12 53,3 t 3,21 t (7,5);
2,22 q (8,5) 53,24 t 3,21 t; 2,22 q
13 100,5 t 5,95 d (1,0);
5,94 d (1,0) 100,07 t 5,96 s; 5,95 s
Nhận xét: hợp chất alkaloid F6.A phân lập được từ rễ TNHC chính l| Lycorin
BÀN LUẬN
Các phương pháp s c ký đã sử dụng như
s c ký l p m ng (TLC), s c ký cột nhanh (VLC)
k t hợp v i các phương pháp phổ nghiệm đã dẫn đ n k t quả đ t yêu cầu là phân lập và
đ nh danh được một số alcaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung
Sự lựa ch n phương pháp s c ký sẽ tùy vào mục tiêu của giai đo n là đ nh tính, kiểm tra tinh khi t hay thi t lập số lượng l n để xác
đ nh cấu trúc
KẾT LUẬN
Từ 900 g cao cồn toàn phần của rễ TNHC thu h{i tại Bình Định, đã t{ch riêng v| thu được 20 g cao alkaloid (hiệu suất 2,22%) Bằng các kỹ thuật sắc ký, đã ph}n lập được 6 hợp chất alkaloid (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A v| F8.A) Trong số này, 2 alkaloid F5.A (200 mg) v| F6.A (2000 mg) được tiếp tục khảo sát cấu trúc bằng c{c phương ph{p phổ nghiệm
Trang 7Kết quả cho thấy F5.A v| F6.A tuần tự l|
crinamidin v| lycorin với độ tinh khiết
(HPLC) lần lƣợt là 99,95% và 100%
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Eman S et al (2015), "HPTLC and GC/MS study of
Amaryllidaceae alkaloids of two Narcissus species",
Chemistry & Biodiversity, 12, pp 1184-1199.
2 Kobayashi S, Tokumoro T, Taisa Z, Kihara M, Imakura Y,
Shingu T (1984) Alkaloid constituents of Crinum latifolium
and C bulbispermum, Chem Pharm Bull., 32(8), pp
3015-3022
3 Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014), "Nghiên cứu thành phần hóa
học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm
thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.)", Luận án Tiến sĩ Dƣợc học, Đại học Y
Dƣợc Tp HCM
(2011), Nghiên cứu ph}n lập lycorin từ N{ng hoa trắng
(Crinum asiaticum Roxb.) l|m chất chuẩn đối chiếu trong
kiểm nghiệm Y Học Tp Hồ Chí Minh, 15, Phụ bản của Số 1,
tr 602-605
Agnes C (2013), "Extracts of Crinum latifolium inhibit the cell
viability of mouse lymphoma cell line EL4 and induce
activation of anti-tumour activity of macrophages in vitro",
Journal of Ethnopharmacology, 149, pp 75-83
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018
Trang 8ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT PHENOL TRONG RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP FOLIN CIOCALTEU
Lê Ngọc Tú*, Hồ Lê Trúc Linh*, Võ Thị Bạch Huệ*, Nguyễn Hồng Thiên Thanh*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) từ l}u đã được sử dụng trong y học dân gian Việt
Nam Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài cây này tập trung chủ yếu vào nhóm alkaloid
Từ những năm 2000, đã có nhiều nghiên cứu về thành phần các hợp chất phenol Tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu hướng tới các bộ phận như l{, củ, hoa mà rất ít nghiên cứu trên rễ của loài cây này
Mục tiêu nghiên cứu: Định lượng hợp chất phenol trong rễ Trinh nữ hoàng cung bằng phương ph{p
Folin Ciocalteu
Đối tượng: Rễ TNHC thu hoạch vào tháng 3/2016 tại Bình Định và tp Hồ Chí Minh Cao cồn (Cao E)
rễ TNHC được chiết từ năm 2014, tại Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược
tp Hồ Chí Minh Chất chuẩn: acid gallic (98%) được cung cấp bởi Sigma Aldrich
Phương pháp nghiên cứu: Chiết cao phenol toàn phần từ cao cồn rễ TNHC bằng phương ph{p chiết
phân bố lỏng – lỏng, lắc phân bố với dung môi ethyl acetat Phân tách cao phenol toàn phần bằng sắc kí cột chân không với c{c dung môi có độ phân cực tăng dần để thu được c{c ph}n đoạn có thành phần đơn giản hơn Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng hợp chất phenol trong dịch chiết nước từ rễ TNHC bằng phương ph{p Folin Ciocalteu với chuẩn acid gallic
Kết quả: Từ 900 gam cao cồn rễ TNHC, bằng phương ph{p chiết phân bố lỏng – lỏng, thu được 20 g
cao phenol toàn phần Sau đó ph}n t{ch bằng sắc kí cột ch}n không, thu được 10 ph}n đoạn (F1 → 10) Qui trình định lượng hợp chất phenol bằng phương ph{p Folin Ciocalteu với máy quang phổ UV-vis tại bước sóng 760 nm (tiến hành song song với mẫu trắng) Lượng hợp chất phenol toàn phần/1 g khối lượng mẫu khô theo chuẩn acid gallic Qui trình đã được thẩm định: độ đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 12,774x + 0,0937,
R 2 = 0,9968, khoảng tuyến tính 0,01 – 0,08 mg/ml), độ lặp lại (RSD = 2,87%) v| độ đúng (RSD = 2,10%) Kết quả áp dụng qui trình định lượng đã x}y dựng và thẩm định v|o x{c định h|m lượng hợp chất phenol của một số mẫu thử (% hợp chất phenol toàn phần/1 g khối lượng mẫu khô theo chuẩn acid gallic): rễ TNHC thu hoạch tại Bình Định và tại tp Hồ Chí Minh lần lượt l| 2,45; 2,96; c{c ph}n đoạn F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 lần lượt là 13,41; 29,66; 17,90; 211,83; 177,15; 69,07; 80,54; 55,90; 38,39; 20,12 Ph}n đoạn F4và F5 chứa h|m lượng hợp chất phenol toàn phần cao
Kết luận: • X}y dựng và thẩm định qui trình định lượng hợp chất phenol bằng phương ph{p Folin
Ciocalteu • X{c định qui trình chiết hợp chất phenol từ cao cồn rễ TNHC v| cũng ph}n lập được một hợp chất tinh khiết L-1 • Áp dụng qui trình định lượng đã x}y dựng và thẩm định v|o định lượng hợp chất phenol trong rễ TNHC thu hoạch tại Bình Định và tp Hồ Chí Minh cũng như trong c{c ph}n đoạn (F1 → 10) từ cao cồn rễ TNHC
Từ khóa: Trinh nữ hoàng cung, Folin Ciocalteu, Crinum latifolium
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS Lê Ngọc Tú ĐT: 0903 741 927 Email: truongtyca@yahoo.com
Trang 9ABSTRACT
QUANTITATIVE DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS
IN THE CRINUM LATIFOLIUM L AMARYLLIDACEAE ROOTS
BY FOLIN CIOCALTEU METHOD
Ho Le Truc Linh, Le Ngoc Tu, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Hong Thien Thanh
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:169 - 175
Background: Crinum latifolium L Amaryllidaceae has been used in Vietnamese folk medicine Most
studies have referred to alkaloids Since the 2000s there have been many studies on phenolic compounds in this plant species However, these studies have focused on leaves, bulbs, flowers, while a few studies have researched on the roots
Objectives: To contribute to study more completely, we carried out “Quantitative determination of
phenolic compounds in the Crinum latifolium L Amaryllidaceae roots by Folin Ciocalteu method"
Materials: The Crinum latifolium L roots were collected in March, 2016 in Binh Dinh province and
in Ho Chi Minh City Ethanolic extract (extract E) from the Crinum latifolium L roots was extracted in
2014 at Department of analytical chemistry and drug quality control, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City Reference standard: acid gallic (purity 98%) provided by Sigma Aldrich
Methods: Use the liquid-liquid extraction method with ethyl acetate to obtain extracts of total phenolic
compounds from the ethanolic extract of Crinum latifolium L roots Then vacuum liquid chromatography
to separate the extract of total phenolic into the simple fractions that contain less compositions Folin Ciocalteu method with gallic acid standard was used to build and validate the procedure to determine phenolic compounds in aqueous extract of dry C latifolium roots
Results: The procedure for determination of phenolics by Folin Ciocalteu method is carried out with the
UV-Vis spectrophotometer at 760 nm (in parallel with the blank) The total phenolic content is expressed as gallic acid equivalent (GAE) This procedure has been validated: specificity, linearity (ŷ = 12.774x + 0.0937,
R 2 = 0.9968, the range of linearity is 0.01 - 0.08 mg/ml), repeatability (RSD = 2.87%) and accuracy (RSD = 2.10%) From 900 g of the extract E by liquid-liquid extraction, we had 20 g of condensed extract of total phenolic After the fractionation by vacuum liquid chromatography, it gave 10 fractions (F1 → 10) The results of application of validated procedure to determine total phenolic content (% g gallic acid equivalent/
g dry weight of sample): C latifolium roots collected in Binh Dinh province and in Ho Chi Minh City: 2.45; 2.96; F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 respectively: 13.41; 29.66; 17.90; 211.83; 177.15; 69.07; 80.54; 55.90; 38.39; 20.12 F4 and F5 have the highest content of phenolic compounds
Conclusion: The procedure to extract the phenolics from ethanolic extract of C latifolium roots was
determined and a pure compound L-1 was also isolated The procedure for quantitative determination of phenolics by Folin Ciocalteu method was built and validated The total phenolic content in C latifolium roots in Binh Dinh province, in Ho Chi Minh City and in fractions (F1 → 10) from the extract of total phenolics of C latifolium roots were determined
Keywords: Crinum latifolium L Amaryllidaceae, Folin Ciocalteu, Crinum latifolium
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ l}u con người đã biết sử dụng những
cây cỏ trong thiên nhiên để chữa bệnh và
truyền thống đó đã được duy trì trong thời gian d|i, đặc biệt khi nước ta sở hữu một hệ động - thực vật phong phú, đa dạng Trong đó
Trang 10cây Trinh nữ hoàng cung- Crinum latifolium L
Amaryllidaceae, được sử dụng từ lâu trong
điều trị các bệnh như u xơ buồng trứng, u
nang cổ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt,< t{c
dụng kháng khối u luôn được chú ý nhiều
nhất Phần lớn các công trình nghiên cứu về
thành phần hóa học của Trinh nữ hoàng cung
đều đề cập đến thành phần alcaloid
Từ những năm 2000 mới có nhiều nghiên
cứu về thành phần hợp chất phenol của loài
c}y n|y, tuy nhiên, đa phần đều tập trung vào
các bộ phận lá, thân củ và hoa, rất ít nghiên
cứu trên rễ Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài
“Định lượng hợp chất phenol trong rễ Trinh
nữ hoàng cung bằng phương pháp Folin
Ciocalteu” với những mục tiêu cụ thể như
sau: xây dựng và thẩm định qui trình định
lượng hợp chất phenol toàn phần trong rễ
TNHC bằng phương ph{p Folin Ciocalteu; {p
dụng qui trình đã thẩm định v|o định lượng
một số mẫu rễ TNHC; x{c định qui trình chiết
xuất hợp chất phenol từ rễ TNHC
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Rễ TNHC thu hoạch vào tháng 3/2016 tại
Bình Định và TP Hồ Chí Minh
Cao cồn (Cao E) rễ TNHC được chiết từ
năm 2014, tại Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm
nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược tp Hồ
Chí Minh
Hóa chất và thuốc thử
Chuẩn acid gallic, độ tinh khiết 98% cung
cấp bởi Sigma Aldrich
Thuốc thử Folin Ciocalteu (Merck)
Natri bicarbonat (Trung Quốc)
Các dung môi: methanol, ethyl acetat (Việt
Nam), cloroform, n-hexan, ethanol, aceton
(Trung Quốc)
Trang thiết bị
Máy quang phổ UV-vis Shimadzu UV 2550
(Nhật)
Bản mỏng Silicagel G (Merck) C}n ph}n tích Sartorius (Đức)
Bể siêu }m Elma (Đức)
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Xây dựng qui trình định lượng hợp chất phenol toàn phần từ rễ Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp Folin Ciocalteu
Nguyên tắc
Sự khử tungstat/molybdat (thành phần TT FC) bởi hợp chất phenol trong môi trường kiềm, tạo sản phẩm có màu, đo độ hấp thu ở bước sóng cực đại của sản phẩm thu được, mật độ quang tỉ lệ với lượng hợp chất phenol (phương ph{p quang phổ)
Nguyên liệu rễ TNHC thu hoạch tại tp Hồ Chí Minh (3/2016)
Dung dịch chuẩn acid gallic (dung dịch A)
Cân chính xác 20 mg acid gallic vào một bình định mức 20 mL, hòa tan v| điền đủ thể tích bằng nước cất 2 lần Pha loãng 10 lần để được dung dịch acid gallic 0,1 mg/mL
Dung dịch mẫu thử (dung dịch T) chiết từ rễ TNHC
Cân chính xác khoảng 1 g bột rễ khô của TNHC vào một bình nón 100 mL, thêm 25
mL nước cất 2 lần, siêu âm 15 phút ở nhiệt
độ 40 ± 5 ºC Lọc qua bông, thu lấy dịch lọc vào một bình định mức 100 mL Lặp lại 3 lần c{c bước trên Rửa bã với 15 mL nước cất 2 lần, bổ sung nước cất 2 lần vừa đủ 100 mL Lọc qua giấy lọc, bỏ 10-20 mL dịch lọc đầu Phần dịch còn lại được sử dụng để định lượng (dung dịch T)
Xây dựng qui trình
Tìm bước sóng hấp thu cực đại của phức tạo bởi hợp chất phenol và TT FC Khảo sát các