Nghiên cứu phân lập các hợp chất alkaloid từ rễ trinh nữ hoàng cung crinum latifolium L., amaryllidaceae

Nội dung bài viết trình bày về nghiên cứu về thành phần alkaloid trong rễ cây trinh nữ hoàng cung tiến hành nghiên cứu trên cao toàn phần rễ trinh nữ hoàng cung ở Bình Định được chiết xuất bằng ethanol 70% tại bộ môn hóa phân tích kiểm nghiệm, khoa dược Thành phố Hồ Chí Minh năm 2014.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TỪ RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG CRINUM LATIFOLIUM L., AMARYLLIDACEAE Lê Ngọc Tú*, Khổng Minh Thương*, Võ Thị Bạch Huệ*, Nguyễn Hồng Thiên Thanh*; Nguyễn Hữu Lạc Thủy* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cao chiết từ rễ Crinum latifolium L Amaryllidaceae sử dụng làm thuốc phổ biến điều trị bệnh u xơ cổ tử cung, u phì đại lành tính tuyến tiền liệt (1) Y học đại chứng minh tính kháng khối u nhiều hợp chất có nguồn gốc từ c}y n|y, lycorin, 1,2 - β epoxy Ambellin, Undulatin, 6-Hydroxy Crinamidin Trong nghiên cứu này, hai hợp chất alcaloid tinh khiết Crinamidin (200 mg), Lycorine (2000 mg) phân lập từ 20 g cao alkaloid toàn phần rễ Trinh Nữ Hoàng cung Các cấu trúc hóa học chúng làm sáng tỏ cách sử dụng c{c phương ph{p phân tích quang phổ (IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR) Bằng c{ch n|y, Crinamidin, Lycorin xác định Đ}y l| thông b{o việc phân lập kỹ thuật sắc ký v| định danh Lycorin, Crinamidin từ rễ TNHC Crinum latifolium thu hái Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thành phần alkaloid rễ TNHC Đối tượng: Cao toàn phần rễ TNHC Bình Định chiết xuất ethanol 70% mơn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Khoa Dược TP.HCM năm 2014 Phương pháp nghiên cứu: Rễ TNHC rửa sạch, phơi khô, xay nhuyễn, ngấm kiệt với cồn 70%, cô thu hồi cồn thu cao cồn toàn phần rễ Xây dựng quy trình chiết alkaloid tồn phần từ cao cồn rễ TNHC Phân lập c{c ph}n đoạn alkaloid từ cao cồn rễ TNHC phương ph{p sắc ký cột nhanh thu 10 ph}n đoạn C{c ph}n đoạn chọn lọc có khối lượng cao có nhiều alkaloid tiến hành sắc ký cột cổ điển thu hợp chất alkaloid Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập SKLM v| HPLC X{c định cấu trúc hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập c{c phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR Kết quả: Từ 900 g cao cồn rễ TNHC toàn phần, thu 20 g cao alkaloid (hiệu suất 2,22%) Bằng kỹ thuật sắc ký, ph}n lập alkaloid (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A, F8.A) Trong số này, hợp chất alkaloid F5.A, F6.A.1 tiếp tục khảo sát cấu trúc c{c phương ph{p phổ nghiệm Kết hợp chất F5.A (200 mg) v| F6.A (2000 mg) x{c định trình tự crinamidin, lycorin với độ tinh khiết (HPLC) 99,95% 100% Kết luận: Từ cao alkaloid toàn phần rễ TNHC kỹ thuật sắc ký ph}n lập hai thành phần alkaloid (crinamidin, 200 mg lycorin 2000 mg) Hai thành phần làm chất đ{nh dấu tiêu chuẩn hóa nguyên liệu sản phẩm thuốc từ dược liệu Từ khóa: Crinum latifolium L., Amaryllidaceae, alkaloid, sắc ký cột, crinamidin, lycorin *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Lê Ngọc Tú ĐT: 0903 741 927 162 Email: truongtyca@yahoo.com Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ABSTRACT ISOLATION OF ALKALOIDS FROM THE ROOTS OF CRINUM LATIFOLIUM L Le Ngoc Tu, Khong Minh Thuong, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Hong Thien Thanh, Nguyen Huu Lac Thuy * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:162 – 168 Introduction: Extracts from roots of Crinum latifolium L Amaryllidaceae are used as popular medicine in the treatment of of diseases such as cervical fibroma, prostate enlargement (1) Modern medicine has demonstrated the anticancer properties of many compounds derived from this plant, such as lycorine, 1,2 β epoxy Ambelline, Undulatine, 6-Hydroxy Crinamidine In this study, two alcaloid compounds Crinamidine (200 mg), Lycorine (2000 mg) were isolated from alkaloid total extract (20 g) of the roots Their chemical structures were elucidated using spectroscopic analyses (IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR) By this means, Crinamidine, Lycorine were identified This is the first announcement on the isolation of Lycorine and Crinamidine using chromatographic techniques and also this is the first time Lycorine and Crinamidine were isolated and identified from the roots of Crinum latifolium L.collected at Vietnam country Objectives: Chemical components of alkaloids in roots of Crinum latifolium were studied Materials: Total extract of Crinum latifolium roots in Binh Dinh province was extracted with 70% ethanol at the department of Analytical Chemistry and Drug Quality Control, Faculty of Pharmacy, HCMC in 2014 Methods: Roots from Crinum latifolium were washed, dried, milled, percolated with 70% ethanol, then recovered solvent to get total alcohol roots extract Extraction process of total alkaloid from alcohol roots extract was built Isolation of alkaloids from alcohol roots extract by flash column chromatography to collect ten fractions From selected fractions, pure compounds were isolated by column chromatography The purity of these compounds was tested by TLC and HPLC The structure of these compounds was determined by spectroscopic methods such as UV, IR, MS, NMR Results and discussions: From 900 g of total roots extract, 20 g total alkaloid extract was collected (yield point : 2.22%.) By chromatography methods, alkaloids (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A, F8.A) were isolated In which alkaloids F5.A and F6.A were determined the struture by spectroscopic methods The compound F5.A (200 mg) and F6.A (2000 mg) were crinamidine and lycorine respectively with the purity were 99,95% and 100% by HPLC Conclusions: From the total alkaloid extract of the roots of Crinum latifolium L., by means of chromatographic techniques, two pure alkaloids (crinamidine, 200 mg and lycorine, 2000 mg) were isolated They can be used as chemical markers for standardization of raw materials as well as products contained this medicinal plant as a component Keywords: Crinum crinamidine, lycorine latifolium L Amaryllidaceae, ĐẶT VẤN ĐỀ Từ lâu, Trinh nữ ho|ng cung (TNHC) đƣợc biết đến thuốc có t{c dụng điều trị số bệnh nhƣ phì đại tuyến tiền liệt; u xơ tử cung< Th|nh phần hoạt chất dƣợc liệu n|y l| c{c alkaloid Đã có Chuyên Đề Dƣợc alkaloid, flash chromatography, kh{ nhiều nghiên cứu th|nh phần hóa học th}n h|nh, l{ v| hoa TNHC; nhƣng c{c nghiên cứu th|nh phần hóa học - đặc biệt l| nhóm alkaloid - rễ TNHC Do vậy, đề t|i “Nghiên cứu phân lập hợp chất alkaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung 163 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Crinum latifolium L Amaryllidaceae” đƣợc x}y dựng nhằm chiết xuất alkaloid toàn phần, phân lập hợp chất alkaloid tinh khiết, x{c định cấu trúc c{c alkaloid ph}n lập đƣợc nhờ v|o c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm (gọi cao II, hiệu suất 2,7%) NGUYÊNLIỆU -PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Qui trình t{ch cao alkaloid từ cao cồn rễ TNHC Nguyên liệu Rễ TNHC thu h{i tỉnh Bình Định (tháng năm 2014 v| th{ng năm 2016) Sơ so s{nh th|nh phần alkaloid có cao I (chiết từ cao cồn rễ, 2014, đƣợc bảo quản c{c điều kiện ghi) v| cao II (chiết từ rễ vừa thu hái, 2016) Cao c n Cô thu h i c n Phƣơng pháp nghiên cứu - Rễ TNHC đƣợc rửa sạch, phơi khô, xay rây qua rây 500, ngấm kiệt với cồn 70%, cô thu hồi cồn thu đƣợc cao cồn toàn phần rễ - Xây dựng quy trình t{ch nhóm alkaloid tồn phần từ cao cồn rễ TNHC - Bằng phƣơng ph{p sắc ký cột ch}n khơng (VLC), cao alkaloid tồn phần đƣợc t{ch th|nh c{c ph}n đoạn C{c ph}n đoạn chọn lọc đƣợc tiếp tục sắc ký cột cổ điển tinh chế để thu đƣợc hợp chất alkaloid Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập đƣợc SKLM HPLC - X{c định cấu trúc alkaloid tinh khiết phân lập đƣợc c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm nhƣ UV, IR, MS, NMR KẾT QUẢ Chiết xuất alkaloid từ cao cồn rễ TNHC - Nguyên liệu rễ TNHC (thu hái Bình Định, th{ng 3/2014) đƣợc rửa sạch, phơi khô, chiết ngấm kiệt với cồn 70% Cô thu hồi dung môi thu đƣợc 900 g cao cồn rễ TNHC Cao đƣợc đóng gói bao PE kín, cho bao v|o hộp thủy tinh bảo quản tủ lạnh nhiệt độ oC Đến th{ng 12 năm 2015, từ 900 g cao cồn rễ TNHC n|y, tiến h|nh chiết theo sơ đồ thu đƣợc 20 g cao alkaloid to|n phần (gọi cao I, hiệu suất 2,2%) - Song song, từ 10 g rễ TNHC (thu h{i Bình Định, th{ng 3/2016) đƣợc chiết cồn 70% thu đƣợc cao cồn rễ TNHC Sau đó, chiết sơ đồ để thu đƣợc 270 mg cao alkaloid tồn phần 164 Cao khơ + HCl 1%; c ch acid L c v i EtOAc o i ch EtOAc ch acid Ki m h a ® pH 9-10 Chi t v i CHCl3 L p CHCl3 Cơ thu h i CHCl3 Cao alkaloid tồn phần Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết cao alkaloid toàn phần từ cao cồn rễ TNHC - So s{nh sơ th|nh phần hóa học cao I v| cao II kỹ thuật SKLM Nhận xét: Th|nh phần c{c vết cao I v| cao II có Rf tƣơng đƣơng Th|nh phần alkaloid cao I v| cao II tƣơng đƣơng Do vậy, cao I đƣợc sử dụng để tiếp tục nghiên cứu hóa học (Hình 1) Tách phân đoạn alkaloid phƣơng pháp VLC Tách cao alkaloid toàn phần I sắc ký cột ch}n khơng (VLC), thu đƣợc 10 ph}n đoạn có độ phân cực tăng dần (gọi tên lần lƣợt F1, F2 F10) C{c ph}n đoạn n|y đƣợc kiểm tra SKLM Ph}n đoạn F2, F4, F5, F6, F7, F8 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 đƣợc chọn để tách tiếp có khối lƣợng đủ lớn Soi UV 254 nm Nghiên cứu Y học v| tƣơng đối tạp (hình 2) Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff Hệ dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : : 0,05) Hình 1: Sắc ký đồ so sánh alkaloid từ cao I (vết 1) cao II (vết 2) Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff Hệ dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : : 0,05) Hình 2: Sắc ký đồ kiểm tra c{c ph}n đoạn qua cột VLC T: Vết chấm cao alkaloid tồn phần (cao I) F1 ® F10: vết chấm c{c ph}n đoạn F1 ® F10 Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff Hệ dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : : 0,05) Hình 3: Sắc ký đồ hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập từ cao I T: vết chấm cao alkaloid toàn phần (cao I) F2A ® F8A: vết chấm alkaloid tinh khiết ph}n lập Chuyên Đề Dƣợc 165 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Phân lập tinh chế hợp chất alkaloid Ph}n đoạn F5 v| F6 có nhiều tủa Lọc riêng biệt c{c tủa n|y, sau kết tinh lại nhiều lần cách hòa tan ấm dung mơi thích hợp; lọc loại tạp kết tinh nhiệt độ phòng Từ ph}n đoạn F5 thu đƣợc 200 mg alkaloid (gọi tên F5.A; kiểm tra độ tinh khiết HPLC: 99,95%) Từ ph}n đoạn F6 thu đƣợc 2000 mg alkaloid (gọi tên F6.A; kiểm tra độ tinh khiết HPLC: 99,99%) Hai alkaloid n|y đƣợc tiếp tục khảo s{t để x{c định cấu trúc Các alkaloid tinh khiết từ c{c ph}n đoạn khác có khối lƣợng đƣợc lƣu dƣới tên F2.A, F4.A, F7.A, F8.A (Hình 3) Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc Hợp chất F5.A - SKLM: với hệ dung môi CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : : 0,05); mỏng silica gel F254 (Merck), hợp chất F5.A cho vết có hình dạng, m|u sắc v| gi{ trị Rf tƣơng đƣơng với chất đối chiếu crinamidin - Phổ UV/MeOH: có đỉnh hấp thu cực đại bƣớc sóng 210, 281 373 nm - Phổ MS: Phổ khối F5.A cho mảnh tín hiệu có m/z = 318,1235 [M+H]+ phù hợp với phân tử khối crinamidin (C17H19NO5= 317) ho|n to|n phù hợp với Crinamidin (xem Bảng 1) Bảng 1: So s{nh liệu phổ NMR (CDCl3, 125/500 MHz) F5.A v| Crinamidin(2) phân ị tr C, ppm 53,8 p Crinamidin H, ppm, C, ppm H, ppm, mult mult., (J, Hz) 3,76 d (3,0) 53,8 3,76 d 56,5 3,27 t (2,5) 56,4 3,27 m 65,2 4,47 d (2,5) 65,5 4,46 m 29,7 1,59 m (2H) 29,7 1,59 m (2H) 4a 61,0 3,17 m 61 3,24 m 58,5 4,18 d (17,5); 3,70 d (17,5) 58,6 3,71 d; 4,24 d 6a 117,5  117,6  141,1  141,1  133,4  133,4  148,2  148,1  10 96,5 6,63 s 96,4 6,62 s 10a 138,7  138,7  10b 41,7  41,6  11 39,1 2,02 m; 2,39 dt (11,5; 6,0) 39,2 không rõ 12 52,6 2,79 m; 3,17 m 52,5 không rõ -CH2O- 100,7 5,87 dd (6,5; 1,5; 2H) 100,7 5,87 s 3,97 s 59,1 3,97 s OCH3 59,1 Nhận xét: Hợp chất alkaloid F5.A phân lập đƣợc từ rễ TNHC l| Crinamidin O 10 O O 166 11 4a 6a 14 OH 10a 10b 13 - Phổ NMR: Hợp chất F5.A đƣợc đo phổ NMR (CDCl3, m{y 500 MHz) v| so s{nh với c{c liệu phổ tƣơng ứng Crinamidin (CDCl3, m{y 500 MHz) TLTK (2) Kết cho thấy c{c liệu phổ NMR F5.A (2) 12 N OMe (F5.A) = Crinamidin Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Bảng 2: So s{nh liệu phổ NMR (DMSO-d6, 125/500 MHz) F6.A v| Lycorin(4) OH HO Nghiên cứu Y học phân ị tr C, mult 4a 70,2 d 71,7 d 118,4 d 141,7 s 60,7 d 56,7 t F254 (Merck), hợp chất F6.A cho vết có 6a 10 10a 10b 11 129,6 s 107,0 d 145,2 s 145,6 s 105,0 d 129,7 s 40,2 d 28,1 t hình dạng, m|u sắc v| gi{ trị Rf tƣơng đƣơng 12 53,3 t 13 100,5 t 10 O 11 4a 10a 13 O 10b 6a N 12 (F6.A) = Lycorin Hợp chất F6.A - SKLM: với hệ dung môi CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : : 0,05); mỏng silica gel với chất đối chiếu lycorin - Phổ UV/MeOH: F6.A cho đỉnh hấp thu cực đại bƣớc sóng 203, 238 288 nm - Phổ IR/KBr, ν (cm-1): 3333 (-OH); 31003000 (CHarom); 1500 (C=Carom); 1037 (-OCH2O) - Phổ MS: Phổ khối F5.A cho mảnh tín hiệu có m/z = 288,1246 [M+H]+ phù hợp với công thức lycorin (C16H17NO4= 287) p H, ppm, mult., (J, Hz) 4,27 br s 3,97 br s 5,36 br s  2,60 d (10,5) 4,01 d (14,0); 3,32 d (14,0)  6,67 s   6,80 s  2,49 m 2,46 m (2H) 3,21 t (7,5); 2,22 q (8,5) 5,95 d (1,0); 5,94 d (1,0) Lycorin (4) C, ppm H, ppm, mult 70,16 d 71,68 d 118,41 d 141,68 s 60,74 d 4,29 s 3,99 s 5,38 s  2,63 d 56,65 t 4,02 d; 3,34 d 129,70 s 106,94 d 145,48 s 145,59 s 104,99 d 129,60 s 40,15 d 28,07 t  6,69 s   6,82 s  2,52 m 2,46 m (2H) 53,24 t 3,21 t; 2,22 q 100,07 t 5,96 s; 5,95 s Nhận xét: hợp chất alkaloid F6.A phân lập đƣợc từ rễ TNHC l| Lycorin BÀN LUẬN Các phương pháp s c ký sử dụng s c ký l p m ng (TLC), s c ký cột nhanh (VLC) k t hợp v i phương pháp phổ nghiệm dẫn đ n k t đ t yêu cầu phân lập đ nh danh số alcaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung Sự lựa ch n phương pháp s c ký tùy vào mục tiêu giai đo n đ nh tính, kiểm tra tinh t hay thi t lập số lượng l n để xác đ nh cấu trúc KẾT LUẬN - Phổ NMR: Hợp chất F6.A đƣợc đo phổ NMR (DMSO-d6, m{y 500 MHz) v| so s{nh với c{c liệu phổ tƣơng ứng Lycorin (DMSOd6, m{y 500 MHz) TLTK(4) Kết cho thấy c{c liệu phổ NMR F5.A ho|n to|n phù hợp với Lycorin (xem Bảng 2) Chuyên Đề Dƣợc Từ 900 g cao cồn toàn phần rễ TNHC thu h{i Bình Định, t{ch riêng v| thu đƣợc 20 g cao alkaloid (hiệu suất 2,22%) Bằng kỹ thuật sắc ký, ph}n lập đƣợc hợp chất alkaloid (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A v| F8.A) Trong số này, alkaloid F5.A (200 mg) v| F6.A (2000 mg) đƣợc tiếp tục khảo sát cấu trúc c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm 167 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Kết cho thấy F5.A v| F6.A l| crinamidin v| lycorin với độ tinh khiết (HPLC) lần lƣợt 99,95% 100% TÀI LIỆU THAM KHẢO Eman S et al (2015), "HPTLC and GC/MS study of Amaryllidaceae alkaloids of two Narcissus species", Chemistry & Biodiversity, 12, pp 1184-1199 Kobayashi S, Tokumoro T, Taisa Z, Kihara M, Imakura Y, Shingu T (1984) Alkaloid constituents of Crinum latifolium and C bulbispermum, Chem Pharm Bull., 32(8), pp 30153022 Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014), "Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid flavonoid cho Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)", Luận án Tiến sĩ Dƣợc học, Đại học Y Dƣợc Tp HCM 168 Nguyễn Ngọc Quỳnh, Nguyễn Hữu Phúc, Trần Hùng (2011), Nghiên cứu ph}n lập lycorin từ N{ng hoa trắng (Crinum asiaticum Roxb.) l|m chất chuẩn đối chiếu kiểm nghiệm Y Học Tp Hồ Chí Minh, 15, Phụ Số 1, tr 602-605 Nguyen THY, Vo TBH, Jose B, Nguyen HLT, Mohamad A, Agnes C (2013), "Extracts of Crinum latifolium inhibit the cell viability of mouse lymphoma cell line EL4 and induce activation of anti-tumour activity of macrophages in vitro", Journal of Ethnopharmacology, 149, pp 75-83 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ĐỊNH LƢỢNG HỢP CHẤT PHENOL TRONG RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP FOLIN CIOCALTEU Lê Ngọc Tú*, Hồ Lê Trúc Linh*, Võ Thị Bạch Huệ*, Nguyễn Hồng Thiên Thanh* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) từ l}u sử dụng y học dân gian Việt Nam Hầu hết nghiên cứu thành phần hóa học lồi tập trung chủ yếu vào nhóm alkaloid Từ năm 2000, có nhiều nghiên cứu thành phần hợp chất phenol Tuy nhiên nghiên cứu chủ yếu hướng tới phận l{, củ, hoa mà nghiên cứu rễ loài Mục tiêu nghiên cứu: Định lượng hợp chất phenol rễ Trinh nữ hoàng cung phương ph{p Folin Ciocalteu Đối tượng: Rễ TNHC thu hoạch vào tháng 3/2016 Bình Định Hồ Chí Minh Cao cồn (Cao E) rễ TNHC chiết từ năm 2014, Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược Hồ Chí Minh Chất chuẩn: acid gallic (98%) cung cấp Sigma Aldrich Phương pháp nghiên cứu: Chiết cao phenol toàn phần từ cao cồn rễ TNHC phương ph{p chiết phân bố lỏng – lỏng, lắc phân bố với dung mơi ethyl acetat Phân tách cao phenol tồn phần sắc kí cột chân khơng với c{c dung mơi có độ phân cực tăng dần để thu c{c ph}n đoạn có thành phần đơn giản Xây dựng thẩm định qui trình định lượng hợp chất phenol dịch chiết nước từ rễ TNHC phương ph{p Folin Ciocalteu với chuẩn acid gallic Kết quả: Từ 900 gam cao cồn rễ TNHC, phương ph{p chiết phân bố lỏng – lỏng, thu 20 g cao phenol toàn phần Sau ph}n t{ch sắc kí cột ch}n không, thu 10 ph}n đoạn (F1 → 10) Qui trình định lượng hợp chất phenol phương ph{p Folin Ciocalteu với máy quang phổ UV-vis bước sóng 760 nm (tiến hành song song với mẫu trắng) Lượng hợp chất phenol tồn phần/1 g khối lượng mẫu khơ theo chuẩn acid gallic Qui trình thẩm định: độ đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 12,774x + 0,0937, R2 = 0,9968, khoảng tuyến tính 0,01 – 0,08 mg/ml), độ lặp lại (RSD = 2,87%) v| độ (RSD = 2,10%) Kết áp dụng qui trình định lượng x}y dựng thẩm định v|o x{c định h|m lượng hợp chất phenol số mẫu thử (% hợp chất phenol tồn phần/1 g khối lượng mẫu khơ theo chuẩn acid gallic): rễ TNHC thu hoạch Bình Định Hồ Chí Minh l| 2,45; 2,96; c{c ph}n đoạn F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 13,41; 29,66; 17,90; 211,83; 177,15; 69,07; 80,54; 55,90; 38,39; 20,12 Ph}n đoạn F4và F5 chứa h|m lượng hợp chất phenol toàn phần cao Kết luận: • X}y dựng thẩm định qui trình định lượng hợp chất phenol phương ph{p Folin Ciocalteu • X{c định qui trình chiết hợp chất phenol từ cao cồn rễ TNHC v| ph}n lập hợp chất tinh khiết L-1 • Áp dụng qui trình định lượng x}y dựng thẩm định v|o định lượng hợp chất phenol rễ TNHC thu hoạch Bình Định Hồ Chí Minh c{c ph}n đoạn (F1 → 10) từ cao cồn rễ TNHC Từ khóa: Trinh nữ hồng cung, Folin Ciocalteu, Crinum latifolium *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Lê Ngọc Tú ĐT: 0903 741 927 Chuyên Đề Dƣợc Email: truongtyca@yahoo.com 169 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS IN THE CRINUM LATIFOLIUM L AMARYLLIDACEAE ROOTS BY FOLIN CIOCALTEU METHOD Ho Le Truc Linh, Le Ngoc Tu, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Hong Thien Thanh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:169 - 175 Background: Crinum latifolium L Amaryllidaceae has been used in Vietnamese folk medicine Most studies have referred to alkaloids Since the 2000s there have been many studies on phenolic compounds in this plant species However, these studies have focused on leaves, bulbs, flowers, while a few studies have researched on the roots Objectives: To contribute to study more completely, we carried out “Quantitative determination of phenolic compounds in the Crinum latifolium L Amaryllidaceae roots by Folin Ciocalteu method" Materials: The Crinum latifolium L roots were collected in March, 2016 in Binh Dinh province and in Ho Chi Minh City Ethanolic extract (extract E) from the Crinum latifolium L roots was extracted in 2014 at Department of analytical chemistry and drug quality control, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City Reference standard: acid gallic (purity 98%) provided by Sigma Aldrich Methods: Use the liquid-liquid extraction method with ethyl acetate to obtain extracts of total phenolic compounds from the ethanolic extract of Crinum latifolium L roots Then vacuum liquid chromatography to separate the extract of total phenolic into the simple fractions that contain less compositions Folin Ciocalteu method with gallic acid standard was used to build and validate the procedure to determine phenolic compounds in aqueous extract of dry C latifolium roots Results: The procedure for determination of phenolics by Folin Ciocalteu method is carried out with the UV-Vis spectrophotometer at 760 nm (in parallel with the blank) The total phenolic content is expressed as gallic acid equivalent (GAE) This procedure has been validated: specificity, linearity (ŷ = 12.774x + 0.0937, R2 = 0.9968, the range of linearity is 0.01 - 0.08 mg/ml), repeatability (RSD = 2.87%) and accuracy (RSD = 2.10%) From 900 g of the extract E by liquid-liquid extraction, we had 20 g of condensed extract of total phenolic After the fractionation by vacuum liquid chromatography, it gave 10 fractions (F1 → 10) The results of application of validated procedure to determine total phenolic content (% g gallic acid equivalent/ g dry weight of sample): C latifolium roots collected in Binh Dinh province and in Ho Chi Minh City: 2.45; 2.96; F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 respectively: 13.41; 29.66; 17.90; 211.83; 177.15; 69.07; 80.54; 55.90; 38.39; 20.12 F4 and F5 have the highest content of phenolic compounds Conclusion: The procedure to extract the phenolics from ethanolic extract of C latifolium roots was determined and a pure compound L-1 was also isolated The procedure for quantitative determination of phenolics by Folin Ciocalteu method was built and validated The total phenolic content in C latifolium roots in Binh Dinh province, in Ho Chi Minh City and in fractions (F1 → 10) from the extract of total phenolics of C latifolium roots were determined Keywords: Crinum latifolium L Amaryllidaceae, Folin Ciocalteu, Crinum latifolium truyền thống đƣợc trì thời ĐẶT VẤN ĐỀ gian d|i, đặc biệt nƣớc ta sở hữu hệ Từ l}u ngƣời biết sử dụng động - thực vật phong phú, đa dạng Trong cỏ thiên nhiên để chữa bệnh 170 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Trinh nữ hoàng cung- Crinum latifolium L Amaryllidaceae, đƣợc sử dụng từ lâu điều trị bệnh nhƣ u xơ buồng trứng, u nang cổ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt,< t{c dụng kháng khối u đƣợc ý nhiều Phần lớn công trình nghiên cứu thành phần hóa học Trinh nữ hoàng cung đề cập đến thành phần alcaloid Từ năm 2000 có nhiều nghiên cứu thành phần hợp chất phenol loài c}y n|y, nhiên, đa phần tập trung vào phận lá, thân củ hoa, nghiên cứu rễ Vì chúng tơi thực đề tài “Định lƣợng hợp chất phenol rễ Trinh nữ hoàng cung phƣơng pháp Folin Ciocalteu” với mục tiêu cụ thể nhƣ sau: xây dựng thẩm định qui trình định lƣợng hợp chất phenol toàn phần rễ TNHC phƣơng ph{p Folin Ciocalteu; {p dụng qui trình thẩm định v|o định lƣợng số mẫu rễ TNHC; x{c định qui trình chiết xuất hợp chất phenol từ rễ TNHC ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Rễ TNHC thu hoạch vào tháng 3/2016 Bình Định TP Hồ Chí Minh Cao cồn (Cao E) rễ TNHC đƣợc chiết từ năm 2014, Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Hồ Chí Minh Hóa chất thuốc thử Chuẩn acid gallic, độ tinh khiết 98% cung cấp Sigma Aldrich Thuốc thử Folin Ciocalteu (Merck) Natri bicarbonat (Trung Quốc) Các dung môi: methanol, ethyl acetat (Việt Nam), cloroform, n-hexan, ethanol, aceton (Trung Quốc) Trang thiết bị Máy quang phổ UV-vis Shimadzu UV 2550 (Nhật) Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học Bản mỏng Silicagel G (Merck) C}n ph}n tích Sartorius (Đức) Bể siêu }m Elma (Đức) PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xây dựng qui trình định lƣợng hợp chất phenol tồn phần từ rễ Trinh nữ hoàng cung phƣơng pháp Folin Ciocalteu Nguyên tắc Sự khử tungstat/molybdat (thành phần TT FC) hợp chất phenol môi trƣờng kiềm, tạo sản phẩm có màu, đo độ hấp thu bƣớc sóng cực đại sản phẩm thu đƣợc, mật độ quang tỉ lệ với lƣợng hợp chất phenol (phƣơng ph{p quang phổ) Nguyên liệu rễ TNHC thu hoạch Hồ Chí Minh (3/2016) Dung dịch chuẩn acid gallic (dung dịch A) Cân xác 20 mg acid gallic vào bình định mức 20 mL, hòa tan v| điền đủ thể tích nƣớc cất lần Pha lỗng 10 lần để đƣợc dung dịch acid gallic 0,1 mg/mL Dung dịch mẫu thử (dung dịch T) chiết từ rễ TNHC Cân xác khoảng g bột rễ khơ TNHC vào bình nón 100 mL, thêm 25 mL nƣớc cất lần, siêu âm 15 phút nhiệt độ 40 ± ºC Lọc qua bông, thu lấy dịch lọc vào bình định mức 100 mL Lặp lại lần c{c bƣớc Rửa bã với 15 mL nƣớc cất lần, bổ sung nƣớc cất lần vừa đủ 100 mL Lọc qua giấy lọc, bỏ 10-20 mL dịch lọc đầu Phần dịch lại đƣợc sử dụng để định lƣợng (dung dịch T) Thể tích thêm vào (mL) Dung dịch A Dung dịch T TT FC Dung dịch Na2CO3 20% Nước cất lần vđ Chuẩn x Thử Trắng 0 y 1 4 10 Xây dựng qui trình Tìm bƣớc sóng hấp thu cực đại phức tạo hợp chất phenol TT FC Khảo sát 171 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 yếu tố ảnh hƣởng kết định lƣợng: tỉ lệ TT FC, dung dịch Na2CO3 20%, dung dịch thử, độ bền phức theo thời gian Thẩm định qui trình phân tích Độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ Áp dụng qui trình định lƣợng hợp chất phenol từ rễ TNHC Bột dƣợc liệu đƣợc làm ẩm với ethanol 96% 12 chiết ngấm kiệt với ethanol 96% 24 giờ, rút dịch chiết cồn cô thu hồi dung môi để đƣợc cao đặc Hòa tan cao đặc với HCl 1%, siêu âm 15 phút, lọc (lặp lại lần) Dịch nƣớc acid đƣợc lắc nhiều lần với ethyl acetat Dịch chiết ethyl acetat đƣợc cô thu hồi dung môi để đƣợc cao đặc-cao hợp chất phenol toàn phần Dung dịch T với TT FC có cực đại hấp thu λmax = 760 nm dung dịch chuẩn A với TT FC có cực đại hấp thu λmax = 761 nm Nhƣ vậy, sử dụng bƣớc sóng 760 nm để tiến h|nh định lƣợng hợp chất phenol toàn phần rễ TNHC Khảo sát ổn định độ hấp thu dd chuẩn A với thuốc thử FC RSD = 0,69%