Chiết xuất, phân lập, xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis). Đối tượng và phương pháp: Mẫu nghiên cứu thu hái tại Vườn Quốc gia Tam Đảo được chiết xuất và chiết phân đoạn với các dung môi khác nhau, trong đó có ethyl acetat. Xác định cấu trúc các chất bằng phương pháp phổ.
Tạp chí y - dợc học quân số 8-2019 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP HAI HỢP CHẤT TERPENOID TỪ PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT ETHYL ACETAT CỦA CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) Lê Đình Mạnh1; Nguyễn Văn Thư2; Trịnh Nam Trung2 Nguyễn Duy Bắc2; Phạm Đức Thịnh2 TÓM TẮT Mục tiêu: chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc số hợp chất từ Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) Đối tượng phương pháp: mẫu nghiên cứu thu hái Vườn Quốc gia Tam Đảo chiết xuất chiết phân đoạn với dung mơi khác nhau, có ethyl acetat Xác định cấu trúc chất phương pháp phổ Kết kết luận: từ phân đoạn ethyl acetat phân lập 02 hợp chất thuộc nhóm terpenoid là: 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat); 16-oxo-3α-hydroxyserrat14-en-21β-ol; chất khẳng định cấu trúc NMR, MS, HMBC, HSQC * Từ khóa: Terpenoid; 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat); 16-oxo-3α-hydroxyserrat-14-en-21β-ol; Thạch tùng cưa ĐẶT VẤN ĐỀ Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) loài thuộc họ Thông đất (Lycopodiaceae), theo kinh nghiệm dân gian dùng để điều trị bệnh bị tổn thương, nôn máu, đái máu, trĩ máu… [1, 2] Cuối kỷ 20, Thạch tùng cưa nghiên cứu phân lập huperzin A, alcaloid có tác dụng ức chế acetylcholinesterase mạnh, thuận nghịch, có chọn lọc hứa hẹn loại thuốc đầy tiềm cho điều trị triệu chứng bệnh Alzheimer [3] Tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc) phát có số lồi thuộc chi Huperzia Bernh., có lồi Thạch tùng cưa Ngồi ra, lồi phân bố rải rác tỉnh trung du vùng núi cao Tây Bắc, miền Trung Tây Nguyên [2] Nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: Nghiên cứu phân lập hai hợp chất terpenoid từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat góp phần cung cấp thêm thơng tin thành phần hóa học loài Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) NGUYÊN LIỆU, DUNG MÔI, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Thu hái mẫu nghiên cứu Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc tháng 12 - 2018 TS Đỗ Văn Hài, Phòng Thực vật học, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học Tiêu mẫu (số hiệu tiêu bản: LDM10122018) lưu Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Trường Cao đẳng Quân y Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Đình Mạnh (mạnh.le40@gmail.com) Ngày nhận bài: 08/09/2019; Ngày phản biện đánh giá báo: 08/10/2019 Ngày báo ng: 10/10/2019 Tạp chí y - dợc học quân sù sè 8-2019 Dung môi, thiết bị - Dung môi: ethanol 96%, nước cất, n-hexan, methanol (MeOH), dichloromethan (CH2Cl2), ethyl acetat (EtOAc): đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích; aceton, methanol: đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng phân tích NMR - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance A 500 (Đức), máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) Máy cất quay Rotavapor R-200 (BUCHI), máy hứng mẫu tự động Eyela DC-1200 (Nhật) (Học viện Quân y) Phương pháp chiết xuất phân lập Chiết hồi lưu 300 g bột mẫu nghiên cứu với 500 ml ethanol 96% thời gian (chiết lặp lại lần) Dịch chiết thu cất thu hồi dung môi thu cắn, phân tán cắn thu trọng lượng tối thiểu nước cất nóng 700C (150 ml) Tiến hành chiết lỏng-lỏng với n-hexan, ethyl acetat Phân đoạn dịch ethyl acetat cất thu hồi dung môi, sấy tới khối lượng không đổi (ký hiệu HSE) thu g Lấy 10 mg cắn HSE hòa tan với 05 ml methanol để khảo sát sắc ký lớp mỏng (SKLM) Hệ dung môi n-hexan/EtOAc (3/1) cho kết tách tốt Lựa chọn hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỷ lệ từ 15/1 đến 5/1 để làm hệ dung môi rửa giải sắc ký cột Phân đoạn cắn ethyl acetat (HSE) chạy sắc ký cột theo phương pháp nạp cột ướt Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi n-hexan/EtOAc (thay đổi từ tỷ lệ 15/1 đến 1/1, v/v) Kiểm tra SKLM, gom bình có sắc ký đồ giống nhau, sau cất thu hồi dung môi thu phân đoạn, phân đoạn HSEII thu 3,6 g Tách hợp chất phân đoạn HSEII (3,6 g) dùng phương pháp sắc ký cột silica gel pha thuận, sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan/aceton với độ phân cực dung môi tăng dần (từ tỷ lệ 25/1 đến 0/1, v/v) Kiểm tra SKLM, gom ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau, sau cất thu hồi dung môi thu phân đoạn HSEII-1 (320 mg), HSEII-2 (1,2 g) HSEII-3 (528 mg) Tiếp tục sắc ký phân đoạn HSEII-2 (1,2 g) cột silica gel, rửa giải hỗn hợp CH2Cl2/EtOAc (20/1, v/v) thu hợp chất HSE-1 (11,2 mg) Tiến hành sắc ký phân đoạn HSEII-3 (528 mg) cột MCI gel, rửa giải hệ dung môi MeOH/H2O (9/1, 10/0), thu hai phân đoạn HSEII-3-1 HSEII-3-2 Tiến hành tinh chế phân đoạn HSEII-3-1 cột silica gel pha thuận, rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (75/1, v/v) thu hợp chất HSE-2 (9,8 mg) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết phân lập hai hợp chất * Hợp chất HSE-1: Hợp chất HSE-1 phân lập thu dạng bột màu trắng Công thức phân tử: C39H54O7 Khối lượng phân tử: 634,2 Số liệu phổ NMR hợp chất HSE-1 trình bày bảng Tạp chí y - dợc học quân số 8-2019 Bảng 1: Số liệu phổ NMR hợp chất HSE-1 hợp chất tham chiếu a δC δH (độ bội, J = Hz) C δC 39,4 39,31 1,11, m; 1,92, m 21 27,1 27,00 1,99, m; 2,20, m 80,1 80,01 5,11, dd (12,0, 4,0) 49,0 48,86 57,1 57,01 21,6 a δC δH (độ bội, J = Hz) 70,2 70,11 4,61, br s 22 44,0 43,89 23 23,5 23,39 24 177,5 178,0 1,20, m 25 14,6 14,47 1,15, s 21,51 1,99, m; 2,15, m 26 20,3 20,18 0,91, s 45,9 45,81 1,25, m; 1,45, m 27 57,1 57,01 1,87, m; 2,33, m 37,8 37,69 28 14,6 14,47 0,87, s 63,1 62,99 29 65,6 65,41 3,99, d (10,8) 10 39,6 39,51 11 27,1 27,00 1,15, m; 1,85, m 30 23,5 23,39 12 28,2 28,07 1,94, m; 2,01, m 1’ 168,2 168,1 13 58,0 57,87 2,10, m 2’ 116,4 116,28 6,77, d (16,0) 14 139,3 139,22 3’ 145,7 145,6 8,12, d (16,0) 15 124,5 124,12 5,51, br s 4’ 126,7 126,6 16 28,5 28,07 2,14, m; 2,25, m 5’ 131,2 131,05 7,56, d (8,4) 17 45,3 45,12 2,40, m 6’ 117,3 117,15 7,16, d (8,4) 18 36,9 36,74 1,85, m; 2,11, m 7’ 161,9 161,76 19 32,3 32,20 1,70, m; 2,05, m 8’ 117,3 117,15 7,16, d (8,4) 20 25,0 24,84 1,85, m; 2,11, m 9’ 131,2 131,05 7,56, d (8,4) b,≠ C δC b 0,85, m b,≠ b 1,61, s 4,22, d (10,8) 1,60, s (a: 1H NMR đo pyridine-d5; b: 13C NMR đo pyridine-d5; ±: Chất tham chiếu) * Hợp chất HSE-2: Phân lập hợp chất HSE-2 thu dạng bột màu trắng Công thức phân tử: C30H48O3 Khối lượng phân tử: 457,2 Số liệu phổ NMR hợp chất HSE-2 trình bày bảng Bảng 2: Số liệu phổ NMR hợp chất HSE-2 hợp chất tham chiếu b,≠ b C δC δC 33,8 a δH (độ bội, J = Hz) b,≠ b C δC 33,8 16 201,3 201,85 26,7 26,5 17 59,0 58,7 75,9 76,3 18 44,7 44,3 38,6 36,7 19 32,0 31,4 δC a δH (độ bội, J = Hz) 3,05 (1H, s) T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2019 49,4 50,4 20 25,9 22,9 19,1 18,5 21 75,0 78,3 45,3 44,7 22 37,6 36,8 38,2 38,2 23 29,3 27,9 62,5 62,4 24 22,6 21,7 10 38,2 38,0 25 16,0 14,8 0,83 (3H, s) 11 25,2 24,9 26 20,1 20,0 0,91 (3H, s) 12 26,7 26,4 27 56,1 55,8 13 59,5 58,5 28 15,2 15,3 1,06 (3H, s) 14 163,6 164,05 29 22,2 22,4 1,39 (3H, s) 15 128,9 129,48 30 29,1 28,0 1,72 (3H, s) 5,97 (1H, s) (a: 1H NMR đo pyridine-d5; b: C NMR đo pyridine-d5; ±: Chất tham chiếu) 13 Kết nhận dạng hai hợp chất * Hợp chất HSE-1: Công thức phân tử hợp chất HSE-1 xác định C39H54O7 Dựa phổ khối lượng ESI-MS xuất píc ion giả phân tử m/z 635,1 [M+H]+ Trên phổ 1H NMR HSE-1 xuất tín hiệu proton gốc methyl δH 0,87 (3H, s), 0,91 (3H, s), 1,15 (3H, s), 1,60 (3H, s) 1,61 (3H, s); gốc methin oxy hóa δH 4,61 (s) 5,11 (dd, J = 12,0 4,0 Hz); olefinic proton δH 8,11 (1H, d, J = 16 Hz), 6,77 (1H, d, J = 16 Hz) 5,51 (1H, brs); proton thơm vị trí para δH 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,15 (2H, d, J = 8,4 Hz, H-6' H-8') Trên phổ 13C NMR HSE-1 cho thấy tín hiệu 39 carbon xuất hiện, tín hiệu carbon nhóm methyl; 10 tín hiệu carbon gốc methylen; tín hiệu carbon gốc methin; tín hiệu carbon bậc bốn; tín hiệu nhóm -CH-O-; tín hiệu carbon nhóm CH2OH; tín hiệu carbon nhóm carbonyl; với tín hiệu carbon gốc para-hydroxycinnamoyl δC C-1’ 1,24 (3H, s) (δ 168,2), C-2’ (δ 116,4), C-3’ (δ 145,7), C-4’ (δ 131,6), C-5’ (δ 126,7), C-6’ (δ 117,3), C-7’ (δ 161,9, s), C-8’ (δ 117,3) C-9’ (δ 126,7) So sánh liệu phổ NMR hợp chất HSE-1 với hợp chất axít lycernuic A [4, 5] thấy có tương đồng, ngoại trừ khác vị trí C-3 Hợp chất axít lycernuic A vị trí C-3 nhóm -OH, hợp chất HSE-1 gốc para-hydroxycinnamat Để khẳng định xác cấu trúc hóa học hợp chất HSE-1, tiến hành phân tích phổ 2D-NMR (HSQC HMBC) Kết phân tích phổ chiều HSQC cho phép gắn tín hiệu proton với tín hiệu carbon tương ứng Vị trí gốc para-hydroxycinnamat C-3 khẳng định dựa vào tương tác proton δH 5,11 (H-3α) với tín hiệu carbon δC 168,2 (C-1’) phổ HMBC Ngoài ra, quan sát thấy tương tác HMBC δH [3,99, d (10,8) 4,22, d (10,8); H-29] với δC 70,2 (C-21) cho phép khẳng định nhóm -CH2OH nối với vị trí C-22 T¹p chí y - dợc học quân số 8-2019 So sánh liệu phổ hợp chất HSE-1 với 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) [6] thấy hồn tồn phù hợp vị trí tương ứng Từ khẳng định HSE-1 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat), có cơng thức phân tử C39H54O7 (khối lượng phân tử = 634,2) có cấu trúc hình Từ liệu thu hợp chất HSE-1, kết hợp với đối chiếu tài liệu tham khảo, xác định hợp chất phân lập từ Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pie.-Serm) [6] * Hợp chất HSE-2: Công thức phân tử hợp chất HSE-2 xác định C30H48O3 Dựa phổ khối lượng ESI-MS xuất píc ion phân tử m/z 457,2 [M]+ Trên phổ 1H NMR hợp chất HSE-2 xuất tín hiệu olefinic proton δH 5,97 (1H, s, H-15); tín hiệu proton δH 3,05 (1H, s, H-17); tín hiệu proton gốc methyl δH 0,74 (3H, s), 0,83 (3H, s), 0,91 (3H, s), 1,06 (3H,s), 1,24 (3H, s), 1,39 (3H, s), 1,72 (3H, s) 21 12 O 3' 1' 4' 7' HO 2' 14 24 HOOC H So sánh liệu phổ NMR hợp chất HSE-2 với hợp chất 16-oxo-3αhydroxyserrat-14-en-21β-ol [7] cho thấy có tương tự vị trí tương ứng (bảng 2) Cấu trúc hóa học hợp chất HSE-2 khẳng định dựa kết phân tích phổ hai chiều HMBC Trên phổ HMBC quan sát thấy tương tác proton δH 3,05 (H-17) với tín hiệu carbon δC 201,85 (C-16) Do đó, HSE-2 xác định có cơng thức phân tử C30H48O3, với tên 16-oxo-3αhydroxyserrat-14-en-21β-ol (khối lượng phân tử = 457,2) có cấu trúc hình Từ liệu thu hợp chất HSE-2, kết hợp với đối chiếu tài liệu tham khảo, Hui Zhou CS xác định hợp chất phân lập từ loài Thạch tùng cưa [7] OH CH2OH 30 28 16 15 H O H 26 25 H Phổ 13C NMR HSE-2 cho thấy 30 carbon xuất hiện, tín hiệu keton carbon δC 201,9 (C-16); tín hiệu olefinic carbon δC 164,1 (C-14) 129,5 (C-15); tín hiệu oxy methyl carbon δC 76,3 (C-3) 78,3 (C-21) (a) (b) 23 Hình 1: Cấu trúc hóa học hai hợp chất HSE-1 (a) v HSE-2 (b) Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 8-2019 KẾT LUẬN Nghiên cứu phân lập hai hợp chất terpenoid từ phân đoạn chiết EtOAc Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) dựa vào phương pháp sắc ký cột, SKLM Nhận dạng cấu trúc hóa học hai hợp chất phân lập dựa vào kết đo loại phổ: MS, 1H NMR, 13C NMR, HMBC HSQC, kết hợp so sánh với liệu công bố phổ hai hợp chất Hai hợp chất phân lập có tên 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axit-3β-yl(7’-hydroxycinnamat) 16-oxo-3αhydroxyserrat-14-en-21β-ol Trong đó, hợp chất 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) lần phân lập từ Thạch tùng cưa Phạm Hoàng Hộ Cây cỏ Việt Nam Nhà Xuất Trẻ 1999, tập I, tr.22-26 Ma X, Tan C, Zhu D et al Huperzine A from Huperzia species - An ethnopharmacology review J Ethnopharmacol 2007, 113, pp.15-34 Zhang Z, Elsohly H.N, Jacob M.R et al Natural products inhibiting Candida albicans secreted aspartic proteases from Lycopodium cernuum J Nat Prod 2002, 65, p.979 Tsuda Y, Isobe K, Sano T Triterpenoid chemistry IX Lycopodium triterpenoid (6) The structures of three new tetra-ols, lycocryptol, 21-epilycocryptol, and diepilycocryptol, and two tew acids, lycernuic acid-A and -B Chem Pharm Bull 1975, 23, pp.264-271 Nguyen V.T, To D.C, Tran M.H et al Isolation of cholinesterase and β-secretase inhibiting compounds from Lycopodiella cernua, Bioorg Med Chem 2015, 23, pp.3126-3134 TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Văn Chi Từ điển thuốc Việt Nam Nhà Xuất Y học Hà Nội 1997, tr.1119 Zhou H, Tan C.H, Jiang S et al Serratene-type triterpenoids from Huperzia serrata J Nat Prod 2003, 66 (10), pp.1328-1332 ... NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết phân lập hai hợp chất * Hợp chất HSE-1: Hợp chất HSE-1 phân lập thu dạng bột màu trắng Công thức phân tử: C39H54O7 Khối lượng phân tử: 634,2 Số liệu phổ NMR hợp chất. .. hợp chất terpenoid từ phân đoạn chiết EtOAc Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) dựa vào phương pháp sắc ký cột, SKLM Nhận dạng cấu trúc hóa học hai hợp chất phân lập dựa vào kết đo... oxy methyl carbon δC 76,3 (C-3) 78,3 (C-21) (a) (b) 23 Hình 1: Cấu trúc hóa học hai hợp chất HSE-1 (a) HSE-2 (b) Tạp chí y - dợc học quân số 8-2019 KẾT LUẬN Nghiên cứu phân lập hai hợp chất terpenoid