nghiên cứu cô lập các hợp chất họ ô rô ( acanthaceae) của cây xuân hoa đỏ, pseuderanthemum carruthersii (seem ) guill var atropurpureum (bull ) fosb

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỌ Ô RÔ ACANTHACEAE CỦ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỌ Ô RÔ ( ACANTHACEAE) CỦA CÂY XUÂN HOA ĐỎ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill

var.atropurpureum (Bull.) Fosb

MÃ SỐ: T2010 - 70

S 0 9

S KC 0 0 2 9 2 6

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-  -

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỌ Ô RÔ

(ACANTHACEAE) CỦA CÂY XUÂN HOA ĐỎ,

Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum

(Bull.) Fosb

MÃ SỐ: T2010-70

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : VÕ THỊ NGÀ

TP HỒ CHÍ MINH – 2/2011

Mục lục

Tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài KH&CN cấp trường

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về chi Pseuderanthemum 2

1.2 Những nghiên cứu về hóa học 2

1.2.1 Loài Eranthemum pulchellum 2

1.2.2 Loài Pseuderanthemum carruthersii atropurpureum 3

1.2.3 Loài Pseuderanthemum latifolim 3

1.2.4 Loài Pseuderanthemum palatiferum 3

1.3 Hóa học họ Ô rô (Acanthaceae) 4

1.4 Đặc điểm của nhóm hợp chất iridoid 4

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Hóa chất và dụng cụ 9

2.2 Thu hái và xử lý nguyên liệu 9

2.3 Tách chiết cao metanol-nước 9

2.4 Tách phân đoạn và cô lập hợp chất 10

2.4.1 Tách phân đoạn cao metanol-nước 10

2.4.2 Cô lập hợp chất XHD20 và XHD21 10

2.4.3 Cô lập hợp chất XHD14 10

2.5 Xác định cấu trúc hợp chất 12

2.5.1 Hợp chất XHD20 12

2.5.2 Hợp chất XHD21 13

2.5.3 Hợp chất XHD14 15

PHẦN 3: KẾT LUẬN 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỌ Ô RÔ

(ACANTHACEAE) CỦA CÂY XUÂN HOA ĐỎ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., HỌ Ô RÔ (ACANTHACEAE)

 Mã số: T2010-70

 Chủ nhiệm đề tài: Võ Thị Ngà Tel.: 0903335351

 E-mail: vtnga1975@yahoo.com.vn

 Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp HCM

 Thời gian thực hiện: tháng 6/2010- tháng 2/2011

1 Mục tiêu:

 Nghiên cứu cô lập các hợp chất iridoid từ cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., Họ Ô Rô

(Acanthaceae)

Cụ thể là :

 Trích ly và cô lập các hợp chất iridoid

 Sử dụng các phương pháp hóa lý như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, 13C, DEPT, COSY, HMBC, HSQC, khối phổ và một số phương pháp hóa lý khác

để xác định cấu trúc các hợp chất trích ly và cô lập được

2 Nội dung chính:

 Tách chiết cao metanol-nước

 Tách phân đoạn cao metanol-nước

 Cơ lập các hợp chất

 Đo các phổ nghiệm trên các hợp chất cơ lập được

 Giải đốn cấu trúc các hợp chất cơ lập được

3 Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội, v.v…)

 Cơ lập được ba hợp chất tinh khiết

 Thu được dữ liệu phổ nghiệm cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều; và khối phổ của các hợp chất này

 Hợp chất 5,6–dihydroxyantirrhide lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên

Hợp chất linarioside được cô lập lần đầu tiên trong chi Pseuderanthemum

 Góp phần khẳng định sự hiện diện của các hợp chất iridoid là điểm đặc trưng cho các cây thuộc họ Ô rô (Acanthaceae)

 Chứng minh sự hiện diện của nhóm hợp chất iridoid trong chi Pseuderanthemum

mọc ở Việt Nam

5 Địa chỉ ứng dụng:

 Kết quả nghiên cứu được chuyển tải trong bài báo chuyên ngành nhằm cung cấp

những thông tin về thành phần hóa học của chi Pseuderanthemum giúp những

nhà nghiên cứu trên cùng lĩnh vực có những định hướng trong việc nghiên cứu

về hóa học trên những cây cùng chi

Gần đây, người dân truyền miệng nhau rằng “cây Hoàn ngọc hay còn gọi là cây

Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum Nees Radlk., trị bách bệnh” Những tác dụng

về dược lý của cây Xuân hoa trên các bệnh về gan, ung thư, viêm loét, … với những bài thuốc đơn giản mà hiệu nghiệm đã cuốn hút chúng tôi tìm hiểu về chi

Pseuderanthemum Sau khi tham khảo các tài liệu liên quan đến các cây thuộc chi Pseuderanthemum chúng tôi nhận thấy chỉ có cây Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk., đang được quan tâm nghiên cứu sâu rộng về cả lĩnh vực hóa

học lẫn lĩnh vực dược học, còn các cây khác chưa có tài liệu nào đề cập Chúng tôi chọn

cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum

(Bull.) Fosb để khảo sát vì cây được sử dụng trong dân gian với đặc tính chữa lành vết thương, trị thương đòn tổn, nhưng chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học

Năm 1988, Henrik Fischer W Jensen [12] đã dựa trên những nghiên cứu về hóa học của 40 loài thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) để phân loại hóa học họ này và nhận thấy điểm

đặc trưng của Acanthaceae là có chứa các hợp chất iridoid glucosid

Những nghiên cứu ở nước ngoài trên chi Pseuderanthemum thuộc họ Ô rô

(Acanthaceae) đã được nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc thực hiện trên cây

Pseuderanthemum latifolim [15] và ở Đan Mạch trên cây Eranthemum pulchellum [12] đã

cô lập được hai hợp chất iridoid, lần lượt là antirrhinoside và eranthemoside Tuy nhiên,

những nghiên cứu trong nước trên chi Pseuderanthemum đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện trên cây P palatiferum nhưng chưa có công bố nào cho thấy sự hiện diện

của nhóm hợp chất iridoid Chúng tôi mong muốn được nghiên cứu cô lập các hợp chất

iridoid để chứng minh sự hiện diện của nhóm hợp chất này trong chi Pseuderanthemum

mọc ở Việt Nam

PHẦN 1

TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI PSEUDERANTHEMUM

Trên thế giới chi Pseuderanthemum cĩ khoảng 60 lồi, cĩ nhiều loại cây từ lâu

niên đến cây bụi Điểm đặc biệt ở các cây thuộc chi này là lá và hoa cĩ nhiều màu sắc đẹp Cây cần độ ẩm cao Ra hoa vào mùa xuân và hè

Ở Việt Nam, chi Pseuderanthemum cĩ 9 lồi và 2 thứ [2]:

 Pseuderanthemum acuminatissimum (Miq.) Kuntze – Xuân hoa nhọn

 Pseuderanthemum bracteatum Imlay – Xuân hoa lá-hoa

 Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb –

Xuân hoa đỏ, Ơ rơ đỏ, Nhớt tím

 Pseuderanthemum carruthersii var ovatifolium (Brem.) Brem – Nấp vũm

 Pseuderanthemum crenulatum (Lindl.) R Ben

 Pseuderanthemum eberhardtii R Ben

 Pseuderanthemum poilanei R Ben

 Pseuderanthemum reticulatum Radlk

 Pseuderanthemum tonkinense R Ben

 Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.- Xuân hoa, Hồn ngọc, Nhật

nguyệt, Tu lình, cây Con khỉ, Trạc mã, Thần tượng linh, cây Mặt quỷ, La điển, cây Nội đồng

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HĨA HỌC

Đến thời điểm này chỉ cĩ những nghiên cứu về hĩa học trên 4 lồi Eranthemum

pulchellum, P carruthersii atropurpureum, P latifolim và P palatiferum

1.2.1 Loài Eranthemum pulchellum

Năm 1987, Henrik Fischer W Jensen và các cộng sự [12] đã cơ lập được từ cuống

hoa của cây Eranthemum pulchellum một hợp chất iridoid glucosid được đặt tên là

eranthemoside (48) và betaine (29)

1.2.2 Lồi P carruthersii atropurpureum

Năm 2007, Võ Thị Ngà và cộng sự [6] đã cơ lập từ lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh các

hợp chất 1-triacontanol (3), hỗn hợp -sitosterol (7) và stigmasterol (8), hỗn hợp

-sitosterol 3-O--glucopyranosid (10) và stigmasterol 3-O--glucopyranosid (11),

hỗn hợp acid oleanolic (17) và acid ursolic (18), và các hợp chất cĩ chứa nitrogen là indole-3-carboxaldehyd (31), uracil (32), adenine (34) và betaine (29)

1.2.3 Loài Pseuderanthemum latifolim

Năm 2006, Zhu Xiang-dong và các cộng sự [15] đã cơ lập từ phần trên mặt đất của

cây P latifolim (Vahl) B Hansen một số hợp chất sterol bao gồm stigmasterol (8),

stigmasterol 3-O- glucopyranosid (11), sitoindoside I (12) là một dẫn xuất ester của

-sitosterol 3-O- -glucopyranosid (10), một hợp chất iridoid là antirrhinoside (47),

ba flavonoid là 7,4’-dihydroxyflavon (24), 5,4’-dihydroxy-7-metoxyflavon (25) và dihydroxy-3’,4’,7,8-tetrametoxy flavon (26), một hợp chất purin là allantoin (33)

5,6-1.2.4 Loài Pseuderanthemum palatiferum

Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sự [7] đã cơ lập được các hợp chất

phytol (14), -sitosterol (7), hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol (8) và poriferasterol (9)

và -sitosterol 3-O--glucopyranosid (10) từ lá cây P palatiferum

Năm 2003, Phan Minh Giang và cộng sự [1] đã cơ lập từ lá khơ cây P palatiferum

hợp chất 1-pentacosanol (2), acid palmitic (5), -sitosterol (7) và stigmasterol (8), hỗn

hợp -sitosterol 3-O--glucopyranosid (10) và stigmasterol 3-O--glucopyranosid

(11), hỗn hợp kaempferol 3-metoxy-7-O- -glucopyranosid (27) và apigenin

7-O--glucopyranosid (28)

Năm 2004, Nguyễn Văn Hùng và cộng sự [3] đã cơ lập từ lá cây P palatiferum các

hợp chất 1-triacontanol (3), hexadecanoat glycerol (4), acid salicylic (6), acid palmitic (5)

Năm 2005, Mai Đình Trị và các cộng sự [8] đã cơ lập được các hợp chất từ lá cây

P palatiferum bao gồm: -amyrin (16) và acid oleanolic (17), -sitosterol (7) và

stigmasterol (8), hỗn hợp -sitosterol -glucopyranosid (10) và stigmasterol

3-O--glucopyranosid (11)

Năm 2007, Trần Kim Thu Liễu [5] đã cơ lập từ lá cây P palatiferum các chất béo

như squalen (15), dotriacontan (1) và phytol (14), acid palmitic (5), -sitosterol (7) và

stigmasterol (8), hỗn hợp -sitosterol glucopyranosid (10) và stigmasterol

3-O--glucopyranosid (11), 24-metylen-cycloartanol (23) và loliolide (13)

Năm 2007, Trần Cơng Khánh và cộng sự [4] đã cơ lập từ rễ cây P palatiferum

được các hợp chất triterpenoid là lupeol (20), lupenone (21), betulin (22) và acid pomolic (19); acid palmitic (5) và một dipeptid là asperglaucide (30)

1.3 HÓA HỌC HỌ ACANTHACEAE

Năm 1988, Henrik Fischer W Jensen [13] đã dựa trên những nghiên cứu về hóa học của 40 loài thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) để phân loại hóa học họ này Kết quả nghiên cứu đã đưa ra hai điểm đặc trưng của họ Ô rô (Acanthaceae) như sau:

Có chứa các hợp chất iridoid glucosid Trong số 40 loài được khảo sát thì 14 loài

có chứa iridoid glucosid Trong số 20 iridoid được đánh số từ (35) đến (54) đã được cô

lập từ họ này, có 7 iridoid chỉ hiện diện trong họ này mà chưa từng thấy trong các họ

khác, bao gồm 6-O-acetylshanzhiside metyl ester (40), 6,8-di-O-acetylshanzhiside metyl ester (42), 8(S)-7,8-hydroaucubin (44), eranthemoside (48), hygrophiloside (50), 6-epi-stilbericoside (53) và thunbergioside (54)

Có chứa các hợp chất amin tứ cấp Trong đó betaine (29) là hợp chất tiêu biểu đã

được tìm thấy trong 31/32 loài thuộc họ Acanthaceae khảo sát Kế đến là trigonelline

(55) cũng được tìm thấy trong 14 loài Các acid amin tứ cấp thuộc loại metyl amonium

cũng được tìm thấy trong hầu hết các loài được khảo sát

Tổng kết, những nghiên cứu về thành phần hóa học trên 4 cây cùng chi

Pseuderanthemum ở Việt Nam, Trung Quốc và Đan Mạch sơ bộ cho thấy các hợp chất

có trong các cây này cũng hiện diện trong nhiều cây cỏ khác như squalen (15), phytol (14), 1-triacontanol (3), stigmasterol (8), -sitosterol (7), -amyrin (16), acid oleanolic

(17), acid ursolic (18), -sitosterol glucopyranosid (10), stigmasterol

3-O--glucopyranosid (11),

Đã có hai hợp chất iridoid glucosid là eranthemoside (48) và antirrhinoside (47)

được tìm thấy ở 2 loài Eranthemum pulchellum và P latifolim thuộc chi

Pseuderanthemum Điều này phù hợp với nhận định nhóm iridoid glucosid là điểm đặc

trưng trong sự phân loại hóa học Acanthaceae

Sự có mặt các hợp chất dị nguyên tố nitrogen trong các cây thuộc chi

Pseuderanthemum đặc biệt là các amin tứ cấp như betaine (29), tuy ít thấy trong thực

vật nhưng đã được tìm thấy trong rất nhiều cây thuộc họ Ô rô (Acanthaceae)

Tuy nhiên, những nghiên cứu trong nước trên chi Pseuderanthemum đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện trên cây P palatiferum nhưng chưa có công bố nào cho thấy

sự hiện diện của nhóm hợp chất iridoid Chúng tôi mong muốn được nghiên cứu cô lập các hợp chất iridoid để chứng minh sự hiện diện của nhóm hợp chất này trong chi

Pseuderanthemum mọc ở Việt Nam

1.4 ĐẶC ĐIỂM CỦA NHÓM HỢP CHẤT IRIDOID

Iridoid là chất chuyển hóa thứ cấp trong nhiều loài động vật và thực vật, chúng được tìm thấy trong nhiều họ thực vật khác nhau phổ biến dưới dạng glycosid Cấu trúc của iridoid là một monoterpenoid dạng cyclopentano [c] pyran, có nguồn gốc từ quá

trình sinh tổng hợp trong cơ thể động thực vật và là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp thành alkaloid [9]

Cấu trúc với hệ thống vòng cyclopentanopyran với hai vòng có cấu hình cis

(H-5/H-9 ) (1a) là cấu trúc phổ biến nhất, tuy nhiên một vài cấu trúc đối phân cũng tồn tại

trong tự nhiên Cấu trúc mở vòng cyclopentan sẽ tạo thành seco-iridoid (1b), và cấu trúc

mở vòng pyran sẽ tạo thành dẫn xuất của iridoid (1c)

Phân loại hóa-thực vật dựa trên các iridoid cũng rất hữu ích trong việc phân chia

nhiều chi trong nhiều họ thực vật khác nhau như: aucubin (2a) của chi Mã đề (họ Mã

đề - Plantaginaceae), asperulosid (2b) trong chi Sữa đông (Họ Cà phê - Rubiaceae), aucubin và harpagid (2c) trong chi Huyền sâm (Họ Huyền sâm - Scrophulariaceae)

Cấu trúc các khung iridoid cơ bản Các hợp chất iridoid glycosid với khung sườn cyclopentanopyran mang nhiều nhóm hydroxyl và phần đường glucopyranosyl nên rất phân cực Các hợp chất này thường hiện diện trong những phân đoạn có độ phân cực cao như cao metanol, cao metanol-nước hoặc cao nước Các dung môi sử dụng trong sắc ký cột pha thường để tách các hợp chất iridoid thường sử dụng các hệ ba dung môi như cloroform, metanol và nước hoặc etyl acetat, metanol và nước Thuốc thử thường dùng để hiện hình các hợp chất iridoid trong sắc ký lớp mỏng là dung dịch acid sulfuric 30%, hơ nóng bảng sắc ký

ở khoảng 100 oC Với thuốc thử này, các hợp chất iridoid thường cho vết có màu đen như than, hiện rất nhanh khi vừa hơ nóng khoảng 10 giây

Từ những đặc điểm này chúng tôi chọn khảo sát trên cao metanol-nước Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với thuốc hiện hình là dung dịch acid sulfuric 30% để định hướng tìm các hợp chất iridoid Do khảo sát trên các hợp chất rất phân cực nên sử dụng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha đảo RP-18 với các dung môi metanol:nước, kết hợp phương pháp sắc ký cột pha thường với hệ dung môi giải ly gồm ba dung môi trong đó có nước Từ đó tìm cách cô lập các hợp chất iridoid

O H

H OGlc

1 3 4 5 6 7

8 910

HO

HO

O H

H OGlc O

AcO

O

O HO

OH

H

OGlc

1 3 4 5 6 7

8 910

H O

C

1 3 4 5 6 7

8 910

11

OH H

H C

C

1 3 4 5 6 7

8 910 11

(1a) (1b) (1c) (2a) (2b) (2c)

H N

OCOCH3O

O

Asperglaucide (30)

O

N H

O

N H

H N

NH2

Adenine (34)

N COO

OH OH OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 5,6-Dihydroxy-3',4',7,8-tetrametoxyflavon (26)

OCH3 OH GlcO OH Kaempferol 3-metoxy-7-O--glucopyranosid (27)

H GlcO OH Apigenin 7-O--glucopyranosid (28)

O OGlc

R 1 O

R 1 =R 2=H :Shanzhiside metyl ester (39)

R1=H, R2=Ac : 6-O-Acetylshanzhiside metyl ester (40)

R 1 =Ac, R 2=H : 8-O-Acetylshanzhiside metyl ester (41)

R 1 =R 2=Ac : 6,8-di-O-Acetylshanzhiside metyl ester (42)

O OGlc

R=H : Acid mussaenosidic (35)

R=Me : Mussaenosidic (36)

O OGlc

8-Epiloganin (37)

O OGlc

Gardoside metyl ester (38)

HO

O OGlc

OH

O

O OGlc

COOMe OH

O OGlc

Catalpol (45)

O OH

Eranthemoside (48)

HO HO

O OGlc

R=CH2OH : Isoaucubin (49) R=CHO : Hygrophiloside (50)

OH

R

O OGlc

OH

O

Ipolamiidoside (43)

Teuhircoside (51)

PHẦN 2

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

2.1.1 Hóa chất và nguyên liệu

- Bột khô lá cây Xuân hoa đỏ;

- Eter dầu hỏa (60 - 90 oC), cloroform, etyl acetat, metanol;

- Silica gel 60 F254 và RP-18 F254 S dùng cho sắc ký bản mỏng;

- Silica gel 60 pha thường (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm, Merck);

- Silica gel pha đảo RP-18

- Máy đo khối phổ HR-ESI-MS hiệu microOTOF–Q 10187

- Máy đo năng lực triền quang hiệu KRUSS.

2.2 THU HÁI VÀ XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU

Lá cây Xuân hoa đỏ được thu hái tại xã Tân Phước, huyện Đồng Phú, tỉnh Bình Phước Cây được Tiến sĩ Hoàng Việt, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên Tp Hồ Chí Minh xác nhận có tên khoa học là Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb

Lá cây Xuân hoa đỏ sau khi thu hái về được làm sạch khỏi các lá sâu bệnh, rửa sạch, sấy khô ở 60 - 80 oC

2.3 TÁCH CHIẾT CAO METANOL-NƯỚC

Bột khô lá cây Xuân hoa đỏ (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với metanol ở nhiệt độ phòng Dịch trích được cô quay thu hồi dung môi thu được cao trích thô metanol (800 g) Phần cao thô metanol được hòa tan với một lượng nhỏ nước

để tạo dịch sệt, sau đó được loại béo bằng cách trích với eter dầu hỏa rồi đến etyl acetat

bằng cách trính lỏng - lỏng Lớp nước được tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng cách cho qua cột Diaion HP-20, các dung môi giải ly lần lượt là nước, hỗn hợp metanol:nước (1:1) và metanol Phân đoạn metanol:nước (1:1) được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao metanol – nước (30 g) Phần cao này tiếp tục được tách phân đoạn và cô lập chất tinh khiết Quy trình tách chiết cao thô được trình bày trong sơ đồ 1

2.4 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT

2.4.1 Tách phân đoạn cao metanol-nước

Cao metanol-nước được tách thành nhiều phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha đảo RP-18, dung môi giải ly là hỗn hợp metanol : nước với độ phân cực giảm dần (từ 8 : 1 đến 2 : 1)

Khối lượng cao metanol-nước nạp đầu cột : 30 g

Đường kính cột : 40 mm

Chiều cao cột silica gel : 20 cm

Khối lượng silica gel pha đảo RP-18: 100 g

Hệ môi giải ly : metanol: nước với độ phân cực giảm dần (từ 1 : 8 đến 1 : 2) Theo dõi cột bằng sắc ký bản mỏng pha thường, hệ dung ly cloroform : metanol : nước (6 : 4 : 1 đến 20 : 6 : 1); sắc ký bản mỏng pha đảo RP-18, hệ dung ly metanol : nước (1 : 1) Hiện hình bằng dung dịch H2SO4 30%, hơ nóng

Hứng mỗi phân đoạn 100 ml Những phân đoạn nhỏ có kết quả sắc ký bản mỏng giống nhau được gộp chung thành phân đoạn lớn Thu được 7 phân đoạn lớn Kết quả được trình bày chi tiết trong Bảng 1

2.4.2 Cô lập hợp chất XHD20 và XHD21

Phân đoạn MH2 (394 mg) được tiếp tục cho qua cột silica gel pha thường với hệ dung ly etyl acetat:metanol:nước (16 : 4 : 1) tách được hai phân đoạn có chứa hai chất chính, được đặt tên là MH2.1 (70 mg) và MH2.2 (56 mg)

Phân đoạn MH2.1 được qua sắc ký cột silica gel pha thường nhiều lần với hệ dung

ly cloroform : metanol : nước (20 : 6 : 1) thu được hợp chất XHD20 (21 mg)

Phân đoạn MH2.2 được tinh chế nhiều lần bằng sắc ký cột silica gel pha thường,

hệ dung ly etyl acetat : metanol : nước (20 : 4 : 1) thu được hợp chất XHD21 (10 mg)

2.4.3 Cô lập hợp chất XHD14

Phân đoạn MH3 (5,33 g) cũng được tiếp tục cho qua cột sắc ký silica gel với hệ dung ly cloroform : metanol : nước (20 : 6 : 1) Sau đó tiếp tục tinh chế nhiều lần bằng sắc ký cột silica gel, hệ dung ly etyl acetat : metanol : nước (24 : 4 : 1) thu được hợp chất XHD14 (327 mg)

Sơ đồ 1: Quy trình tách chiết cao thô

Bảng 1: Tổng kết tách phân đoạn cao metanol-nước bằng sắc ký cột silica gel

STT Phân

đoạn Dung ly

Khối lượng cao (mg)

Đặc điểm cao

Kết quả TLC Ghi chú

Cao eter dầu hỏa (160 g) Dịch nước

Cao etyl acetat (17 g) Dịch nước

Cao metanol Cao nước

Trích lỏng – lỏng với eter dầu hỏa

Trích lỏng – lỏng với etyl acetat

Cột Diaion HP-20

Cao metanol-nước (30 g)

2.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT

2.5.1 Hợp chất XHD20

Hợp chất XHD20 có dạng gum không màu [D – 62 (c 0,12, MeOH);

Phổ 1H-NMR (CD3OD) được trình bày trong Bảng 2, Phụ lục 1

Phổ 13C-NMR (CD3OD) được trình bày trong Bảng 2, Phụ lục 2

Phổ 13C-NMR kết hợp DEPT (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 3

PhổCOSY (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 4

PhổHSQC (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 5

PhổHMBC (CD3OD) được trình bày trong Bảng 2, Phụ lục 6

PhổNOESY (CD3OD) được trình bày trong Bảng 2, Phụ lục 7

Phổ HR-ESI-MS (+) m/z 385,1072 [M+Na]+ được trình bày trong Phụ lục 8

Phổ 1H-NMR (Bảng 2) có một mũi đôi H 4,70 (d, J=8,0 Hz, H–1’) có tương quan

HMBC với carbon acetal C–1’ tại C 99,7 Từ đó nhận định hợp chất XHD20 có mang phần đường Bằng phổ COSY, bắt đầu từ proton anomer trên lần lượt xác định được các proton còn lại của đường glucopyranoside Kết hợp phổ HSQC đã xác định được các carbon tương ứng với các proton của đường glucopyranoside Phổ HMBC giúp khẳng định phần đường này bằng các tương quan tương ứng phù hợp

Phổ 13C-NMR (Bảng 2) của hợp chất XHD20 cho thấy có 15 tín hiệu Do đó, ngoài 6 tín hiệu thuộc về phần đường –glucopyranosyl, phần aglycon có 9 carbon Với tín hiệu proton ở H 5,42(1H, d, 7,5) tương ứng với carbon acetal ở C 95,2 (C–1), dự đoán hợp chất có khung sườn cyclopentanopyran của một iridoid Sự xuất hiện của hai tín hiệu methine olefin ở C 143,0 (C–3) và C 107,7 (C–4) có thể đề nghị XHD20 có cấu trúc của một iridoid không mang nhóm thế tại C-4 Độ dịch chuyển hóa học của C–

5, C–6, C–7 và C–8 trong vùng C 64–78 đã chứng tỏ các carbon này phải gắn với các nhóm thế có độ âm điện mạnh Trên phổ HMBC cho thấy các tương quan từ H–10 (3H,

1,51, s) đến C–7 (C 66,3), C–8 (C 64,2) và C–9 (C 53,3) chứng tỏ nhóm methyl (C–10) gắn vào C–8

Phổ HR-ESI-MS cho thấy mảnh ion giả phân tử có m/z 385,1072 [M+Na]+

(C15H22O10Na; 385,1111) tương ứng với công thức phân tử của XHD20 là C15H22O10,khối lượng phân tử 362,1213

Dựa trên các kết quả phổ nghiệm cũng như so sánh với tài liệu tham khảo [10,15],

XHD20 được xác định cấu trúc là antirrhinoside Chất này đã từng được cô lập từ cây

Pseuderanthemum latifolim ở Trung Quốc, nhưng đây là lần đầu tiên được cô lập từ cây

Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum carruthersii atropurpureum, mọc ở Việt Nam

Bảng 2: Số liệu phổ nghiệm hợp chất XHD20 và so sánh với antirrhinoside

NOESY ( 1 H 1 H)

(*) mũi chồng chập

2.5.2 Hợp chất XHD21

Hợp chất XHD có dạng gum không màu [D – 93 (c 0.07, MeOH);

Phổ 1H-NMR (CD3OD) được trình bày trong Bảng 3, Phụ lục 9

Phổ 13C-NMR (CD3OD) được trình bày trong Bảng 3, Phụ lục 10

Phổ 13C-NMR kết hợp DEPT (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 11

PhổCOSY (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 12

PhổHSQC (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 13

PhổHMBC (CD3OD) được trình bày trong Bảng 3, Phụ lục 14

PhổNOESY được trình bày trong Bảng 3, Phụ lục 15

Phổ HR-ESI-MS (+) m/z 385,1134 [M+Na]+được trình bày trong Phụ lục 16

O

OH HO

H 3 C O

O HO

1 0

1 '

2 ' 3'

4'

5 '

6 '

1 7

6

8

Phổ 13C-NMR của hợp chất XHD21 cho thấy có 15 tín hiệu Trong đó có 6 tín hiệu thuộc về phần đường –glucopyranosyl Phần đường -glucopyranosyl được xác nhận với tín hiệu cộng hưởng của proton anomer tại H 4,59 (d, J=8,0 Hz, H–1’) tương

ứng với carbon acetal C–1’ tại C 99,6, ngoài ra hai mũi đôi đôi tại  3,93 (dd,

J=12,0/1,5Hz, H-6’a) và  3,70 (dd, J=12,0/5,5Hz, H-6’b) tương ứng với C-6’ C 62,8

Sự hiện diện của khung iridoid được xác nhận bằng sự xuất hiện của hai tín hiệu methine olefin ở C 143,8 (C–3) và C 106,8 (C–4) cùng với tín hiệu carbon acetal ở C

96,0 (C–1) Tất cả các tín hiệu proton và carbon được gán phù hợp bằng các phổ nghiệm COSY, HSQC và HMBC NMR Độ dịch chuyển hóa học của C–5, C–6 và C–7 lần lượt là C 69,9, 79,3 và 74,0 đã chứng tỏ các carbon này phải gắn với các nhóm thế

có độ âm điện mạnh Trên phổ HMBC cho thấy các tương quan từ proton metilen olefin

H–10 (1H, 5,37, dd, J=2,5/2,5Hz) và (1H, 5,29, dd, J=2,5/2,5Hz) đến C–8 (C 151,6), C–7 (C 74,0) và C–9 (C 50,6)) chứng tỏ nhóm metilen (C–10) gắn vào C–8

Phổ HR-ESI-MS cho thấy mảnh ion giả phân tử có m/z 385,1134 [M+Na]+

(C15H22O10Na; 385,1111) tương ứng với công thức phân tử của XHD21 là C15H22O10,khối lượng phân tử 362,1213

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của XHD21 tương tự hợp chất 6–hydroxyantirrhide[14] ngoại trừ sự hiện diện của nhóm OH tại vị trí C-5 Cấu hình tuyệt đối của hợp chất XHD21 được xác định dựa vào các tương quan trong phổ NOESY và được trình bày trong hình dưới đây XHD21được xác định là 5,6–dihydroxyantirrhide Đây là hợp chất lần đầu tiên được phát hiện trong tự nhiên

Bảng 3: Số liệu phổ nghiệm hợp chất XHD21 và so sánh với 6-hydroxyantirrhide

NOESY ( 1 H 1 H)

2.5.3 Hợp chất XHD14

Hợp chất XHD có dạng gum không màu [ D – 94 (c 0,225, MeOH);

Phổ 1H-NMR (CD3OD) được trình bày trong Bảng 4, Phụ lục 17

Phổ 13C-NMR (CD3OD) được trình bày trong Bảng 4, Phụ lục 18

Phổ 13C-NMR kết hợp DEPT (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 19

PhổCOSY (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 20

PhổHSQC (CD3OD) được trình bày trong Phụ lục 21

PhổHMBC (CD3OD) được trình bày trong Bảng 4, Phụ lục 22

PhổNOESY (CD3OD) được trình bày trong Bảng 4, Phụ lục 23

Phổ HR-ESI-MS (+) m/z 421,0884 [M+Na]+ được trình bày trong Phụ lục 24

Trong hợp chất XHD14 có sự hiện diện của nguyên tử Cl, điều này được chứng minh bằng phổ ESI-MS Phổ HR-ESI-MS cho thấy có hai mảnh ion giả phân tử [M(35Cl)+Na]+ với m/z 421,0884 và [M(37Cl)+Na]+ 423,0858 (mảnh đồng vị) với tỷ lệ 3:1 Từ đó xác định công thức phân tử của XHD14 là C15H23O10Cl

Phổ 1H và 13C NMR của XHD14 tương tự như hợp chất XHD20 ngoại trừ các giá trị độ dịch chuyển hóa học của C-7 và C-8 về vùng từ trường cao chứng tỏ có sự mở vòng epoxy tại C-7 và C-8

Theo Henrik Franzyk[11], người đã điều chế dẫn xuất clorin từ antirrhinoside, nếu nguyên tử Cl gắn vào C–8, thì tín hiệu metyl của C–10 sẽ có độ dịch chuyển hóa học là

H 1,75 nếu nguyên tử Cl gắn vào C–7, thì tín hiệu metyl của C–10 sẽ có độ dịch chuyển hóa học là H 1,20 Trong trường hợp của XHD14 thì thì tín hiệu metyl của C–

10 sẽ có độ dịch chuyển hóa học là 1,20, nên nguyên tử Cl gắn vào C–7

Dựa trên các kết quả phổ nghiệm cũng như so sánh với tài liệu tham khảo [14],

XHD14 được xác định cấu trúc là linarioside Chất này đã từng được cô lập từ cây

Linaria japonica, nhưng đây là lần đầu tiên được cô lập từ chi Pseuderanthemum

O

OH HO

HO

H 2 C

O HO

HO

OH

OH

O H

5,6-Dihydroxyantirrhide

(XHD21)

1 3 4 5 6 7

8 9

10

1' 2'