cô lập phenylethanoid từ cây xuân hoa đỏ, pseuderanthemum carruthersii (seem ) guill var atropurpureum (bull ) fosb , họ ô rô (acanthaceae)

 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư vú và ung thư cổ tử cung trên các hợp chất cô lập được.. Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại như HR–ESI–MS, 1D và 2

Trang 1

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG

CÔ LẬP PHENYLETHANOID TỪ CÂY XUÂN HOA ĐỎ, PSEUDERANTHEMUM CARRUTHERSII (SEEM.) GUILLVAR ATROPURPUREUM (BULL.) FOSB.,

HỌ Ô RÔ (ACANTHACEAE)

MÃ SỐ: T2011 - 20 TĐ

S 0 9

S KC 0 0 3 3 0 4

Trang 2

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM

CÔ LẬP PHENYLETHANOID TỪ CÂY XUÂN HOA ĐỎ,

PSEUDERANTHEMUM CARRUTHERSII (SEEM.) GUILL

VAR ATROPURPUREUM (BULL.) FOSB.,

Mã số: T2011-20TĐ

Chủ nhiệm đề tài: ThS VÕ THỊ NGÀ

TP Hồ Chí Minh, Tháng 12/2011

Trang 3

CN Tưởng Lâm Trường

TP Hồ Chí Minh, Tháng 12/2011

CÔ LẬP PHENYLETHANOID TỪ CÂY XUÂN HOA ĐỎ,

PSEUDERANTHEMUM CARRUTHERSII (SEEM.) GUILL

VAR ATROPURPUREUM (BULL.) FOSB.,

Trang 4

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Tp Hồ Chí Minh, Ngày 25 tháng 11 năm 2011

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Cô lập phenylethanoid từ cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., họ Ô rô (Acanthaceae)

- Mã số: T2011-20TĐ

- Chủ nhiệm: ThS VÕ THỊ NGÀ

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp HCM

- Thời gian thực hiện: tháng 3/2011-12/2011

2 Mục tiêu:

 Cô lập các hợp chất phenylethanoid từ cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., họ Ô rô

(Acanthaceae)

 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phenylethanoid cô lập được

 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư vú và ung thư cổ tử cung trên các hợp chất cô lập được

3 Tính mới và sáng tạo:

Nhóm hợp chất phenylethanoid cô lập từ cây P carruthersii var

atropurpureum là lần đầu tiên được phát hiện có hiện diện trong chi Pseuderanthemum Kết quả nghiên cứu đã góp phần bổ sung thêm kiến thức về hóa

- thực vật của chi Pseuderanthemum, hiện có rất ít thông tin

Trang 5

Hai hợp chất verbascoside (38) và isoverbascoside (39) lần đầu tiên được biết

có khả năng gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 100

g/ml

4 Kết quả nghiên cứu:

Từ lá cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var

atropurpureum (Bull.) Fosb., sử dụng phương pháp trích ly ngâm dầm ở nhiệt độ

phòng, cùng các phương pháp sắc ký cột pha thường hoặc pha đảo, sắc ký lớp mỏng điều chế, chúng tôi đã cô lập được 4 hợp chất tinh khiết Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại như HR–ESI–MS, 1D và 2D–NMR và so sánh với các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã xác định được cấu trúc hóa học của 4 hợp chất phenylethanoid,

bao gồm salidroside (36), darendoside B (37), verbascoside (38) và isoverbascoside

(39)

Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư vú MCF–7

và ung thư cổ tử cung HeLa được thực hiện theo phương pháp SRB, trên 4 hợp chất phenylethanoid tinh khiết cô lập Hai hợp chất có khả năng gây độc tế bào trên dòng

tế bào ung thư vú MCF–7 ở nồng độ 100 g/ml, đó là verbascoside (38) và isoverbascoside (39) Riêng hợp chất isoverbascoside (39) đã được xác định chỉ số

IC50 = 90,25 g/ml trên dòng tế bào cung thư vú MCF–7

5 Sản phẩm:

Kết quả nghiên cứu đã được công bố trên một bài báo thuộc Tạp chí Hóa học :

Võ Thị Ngà, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương (2010), “Four

phenylethanoids from leaves of Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var

atropurpureum (Bull.) Fosb.”, Tạp chí Hóa học, 48 (5), tr 539545

Trang 6

6 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp

dụng:

Kết quả nghiên cứu đã được công bố trên Tạp chí Hóa học, một tạp chí chuyên

ngành, nhằm cung cấp những thông tin về thành phần hóa học của chi

Pseuderanthemum giúp những nhà nghiên cứu trên cùng lĩnh vực có định hướng

trong việc nghiên cứu về hóa học trên những cây cùng chi

Trang 7

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1 General information:

Project title: Isolation of phenylethanoid glycosides from Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., Acanthaceae

 Extraction and isolation phenylethanoid glycosides from Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb., Acanthaceae

 Elucidation the chemical structure of isolated phenylethanoid glycosides

 Evaluation on cytotoxic activities against HeLa and MCF–7 cancer cell lines

on isolated compounds at the concentration of 100 g/mL

3 Creativeness and innovativeness:

It was the first time, phenylethanoid glycosides were isolated from P

carruthersii var atropurpureum as well as from Pseuderanthemum genus The

result of this research contributed to supply the knowledge of Pseuderanthemum, which has rare information

Two phenylethanoid glycosides, verbascoside (38) and isoverbascoside (39),

showed relatively good activity against MCF–7 cancer cell line at the concentration

of 100 g/mL

4 Research results:

From the leaves of Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var

atropurpureum (Bull.) Fosb., applying extraction with ethanol by maceration at

Trang 8

room temperature, along with chromatographic methods, four pure compounds were

isolated Their chemical structures were elucidated as salidroside (36), darendoside

B (37), verbascoside (38) and isoverbascoside (39), by HR–ESI–MS, 1D và 2D–

The research result was published on Journal of Chemistry:

Võ Thị Ngà, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương (2010), “Four

phenylethanoids from leaves of Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var

atropurpureum (Bull.) Fosb.”, Tạp chí Hóa học, 48 (5), tr 539545

6 Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:

The result of this research was published on Journal of Chemistry to share

knowledge of Pseuderanthemum genus for the researcher, who are studying on the

same field

Trang 9

MỤC LỤC

Trang

Danh mục chữ viết tắt 1

Danh mục ký hiệu hợp chất cô lập 1

Danh mục sơ đồ 2

Danh mục hình ảnh 2

Danh mục bảng biểu 2

Danh mục phụ lục 3

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT 6

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC HỌC 7

1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng cây P palatiferum 7

1.2.2 Nghiên cứu in vitro về dược tính 9

1.2.3 Nghiên cứu in vivo về dược tính 10

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 12

1.3.1 Loài Eranthemum pulchellum 12

1.3.2 Loài Pseuderanthemum latifolium 12

1.3.3 Loài Pseuderanthemum palatiferum 12

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 16

2.1 TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT 16

2.1.1 Hóa chất và thiết bị 16

2.1.2 Nguyên liệu 17

2.1.3 Điều chế các loại cao 17

2.1.4 Cô lập các hợp chất hữu cơ từ cao methanol-nước (ĐL-MN, 30g) 20

2.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 23

2.2.1 Nguyên tắc 23

Trang 10

2.2.2 Hóa chất và dụng cụ 24

2.2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB 24

2.2.4 Nơi thực hiện thử nghiệm 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP 27

3.1.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất XHĐ-L-MN4 27

3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 37

KẾT LUẬN 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 45

Trang 11

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

COSY COrrelation SpectroscopY

CTPT Công Thức Phân Tử

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO DiMethyl SulfOxide

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HR–ESI–MS High Resolution ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

HSQC Heteronuclear Singlet Quantum Correlation

J Hằng số ghép cặp

M Khối lượng phân tử

DANH MỤC KÝ HIỆU HỢP CHẤT CÔ LẬP

STT Ký hiệu trong báo cáo Ký hiệu trong phần phụ lục Tên hợp chất

Trang 12

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các loại cao và cô lập hợp chất từ lá cây Xuân hoa đỏ .19

Sơ đồ 2.5 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB 26

DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Cây Xuân hoa đỏ 6

Hình 1.2 Cấu trúc hợp chất béo và các dẫn xuất có trong chi Pseuderanthemum 13

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất steroid có trong chi Pseuderanthemum 14

Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất terpenoid có trong chi Pseuderanthemum 14

Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất lignan có trong chi Pseuderanthemum 15

Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất flavonoid có trong chi Pseuderanthemum 15

Hình 1.7 Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen có trong chi Pseuderanthemum 15

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của hợp chất isoverbascoside (39) 38

DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1 Khối lượng và thu suất của các loại cao của các bộ phận cây Xuân hoa đỏ 18

Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g) 22

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột phân đoạn ĐL.MN.4 (5,33 g) 22

Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột phân đoạn ĐL.MN.6.2 (3,75 g) 23

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN4 so sánh với salidroside 28

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN6 so sánh với darendoside B 30

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN7 so sánh với verbascoside 33

Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất XHĐ–L.MN8 so sánh với isoverbascoside 36

Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên dòng MCF–7 và HeLa 38

Bảng 3.6 Kết quả xác định giá trị IC50 trên dòng tế bào ung thư vú MCF–7 của hợp chất isoverbascoside (39) 38

Trang 13

DANH MỤC PHỤ LỤC

Trang

Phụ lục 1a Phổ 1H–NMR của XHĐ–L.MN4 45

Phụ lục 1b và 1c Phổ 13C kết hợp phổ DEPT–NMR của XHĐ–L.MN4 45

Phụ lục 1d Phổ HSQC–NMR của XHĐ–L.MN4 46

Phụ lục 1e Phổ HMBC–NMR của XHĐ–L.MN4 46

Phụ lục 1f Phổ 1H–1H COSY–NMR của XHĐ–L.MN4 47

Phụ lục 1g Phổ HR–ESI–MS của XHĐ–L.MN4 47

Phụ lục 4e* Phổ giãn HMBC–NMR của XHĐ–L.MN8 56

Phụ lục 5 Kết quả xác định độc tính tế bào 58-61

Trang 14

Việt Nam có vị trí địa lý thuộc vùng nhiệt đới nóng ẩm, là điều kiện phát triển

hệ thực vật phong phú và đa dạng Đây cũng chính là lý do nền y học cổ truyền của nước ta phát triển mạnh Với vai trò nhà nghiên cứu về hóa học các hợp chất thiên nhiên, chúng tôi mong muốn được đóng góp vào sự phát triển chung này

Từ những năm 1980, người dân truyền miệng nhau rằng “cây Hoàn ngọc hay

còn gọi là cây Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk., trị bách

bệnh” Những tác dụng về dược lý của cây Xuân hoa trên các bệnh về gan, hệ tiêu hóa, tim mạch, ung thư, viêm loét, …[10] với những bài thuốc đơn giản mà hiệu

nghiệm đã cuốn hút chúng tôi tìm hiểu về chi Pseuderanthemum

Sau khi tham khảo các tài liệu liên quan đến các loài cây thuộc chi

Pseuderanthemum, chúng tôi nhận thấy rằng, trong số 10 loài cây thuộc chi Pseuderathemum hiện diện ở Việt Nam, chỉ có cây Xuân hoa, Pseuderathemum palatiferum, đang được quan tâm nghiên cứu sâu rộng về cả lĩnh vực hóa học lẫn

lĩnh vực dược học, còn các cây khác chưa có tài liệu nào đề cập Chúng tôi chọn cây

Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum

(Bull.) Fosb., để khảo sát vì cây được sử dụng trong dân gian với đặc tính chữa lành vết thương, trị thương đòn tổn, [4] nhưng chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học

Bước đầu nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của cây Xuân hoa đỏ, chúng tôi đã cô lập được các nhóm hợp chất steroid, hợp chất chứa nitrogen và hợp chất iridoid (đã được báo cáo trong các đề tài Nghiên cứu Khoa học cấp Trường trong những năm 2008, 2009 và 2010) Trong quá trình nghiên cứu trích ly và cô

Trang 15

lập hợp chất, chúng tôi đã nhận thấy có sự hiện diện của nhóm hợp chất phenylethanoid từ lá cây Xuân hoa đỏ

Các hợp chất phenylethanoid được biết đến nhiều với tác dụng kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng vi khuẩn và virus, tác dụng bảo vệ tế bào gan Những thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư vú và ung thư cổ tử cung của các hợp chất phenylethanoid chưa được quan tâm nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này được đưa ra là trích ly và cô lập các hợp chất phenylethanoid từ cây Xuân hoa đỏ Từ đó thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư cổ tử cung HeLa trên những hợp chất tinh khiết cô lập được, nhằm tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính Điều này

có ý nghĩa khoa học chứng minh cho việc sử dụng cây Xuân hoa, Pseuderathemum

palatiferum, một cây cùng chi Pseuderanthemum, thường được sử dụng trong dân

gian để chữa các bệnh ung thư Từ đó, mở ra những ý tưởng tổng hợp hoặc bán tổng hợp các hợp chất khung phenylethanoid góp phần phục vụ y học hiện đại

Trang 16

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT

Họ Ô rô (Acanthaceae) là một họ thực vật hai lá mầm trong thực vật có hoa, chứa khoảng 250 chi và khoảng 2.700 loài

Theo Phạm Hoàng Hộ, [4] chi Pseuderanthemum có khoảng 196 loài Ngoài tên Pseuderanthemum còn có tên Eranthemum Ở Việt Nam, chi Pseuderanthemum

có 9 loài và 2 thứ

Đề tài này khảo sát thành phần hóa học của cây Xuân hoa đỏ, nên chúng tôi chỉ trình bày mô tả thực vật của loài này [1],[4]

Tên khoa học: Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var

atropurpureum (Bull.) Fosb

Họ Ô rô (Acanthaceae)

Tên thông thường : Xuân hoa đỏ, Ô rô đỏ, Nhớt tím

Tiểu–mộc cao 1–2 m, phân nhánh nhiều, không lông Lá có phiến xoan bầu dục, mỏng, không lông, dài 7–10 cm, đỏ bầm có bớt đậm, đôi khi cũng thấy có màu vàng với bớt vàng đậm; cuống ngắn Chùm ở ngọn; hoa trắng tâm hường, tai có đốm đỏ; tiểu–nhụy 2, thò

Cây ưa ẩm, đòi hỏi đất nhiều phân Nhân giống bằng các chồi gốc vào mùa xuân Ra hoa tháng 4–5, có quả tháng 6–7

Cây Xuân hoa đỏ hiện đang được trồng làm cảnh ở nhiều nơi trong Thành phố

Hồ Chí Minh

Hình 1.1 Cây Xuân hoa đỏ

Trang 17

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC HỌC

Có rất ít thông tin về dược tính trên các loài thuộc chi Pseuderanthemum Chỉ

có ba loài có thông tin liên quan đến dược tính, đó là P carruthersii var

atropurpureum, P latifolium và P palatiferum Trong đó chỉ có P palatiferum đã

được khảo sát dược tính bằng các phương pháp khoa học hiện đại

P carruthersii var atropurpureum: các bộ phận lá, rễ và hoa được sử dụng

trong dân gian để trị lở miệng và làm lành vết thương [1],[4]

P latifolium: được người dân ở Vân Nam, Trung Quốc sử dụng như thảo dược

và là một loài có tiềm năng trong nhóm thực vật đang được một nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc nghiên cứu sàng lọc khả năng chữa HIV [26]

P palatiferum: cây được phát hiện tại Việt Nam từ những năm 1980, đã được

sử dụng theo truyền miệng trong dân gian và đang được nghiên cứu Sau đây là

những thông tin chi tiết về dược tính của loài P palatiferum

1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng cây P palatiferum

Cây Xuân hoa, P palatiferum được trồng nhiều nơi như một cây thuốc gia

đình Theo Trần Công Khánh, [6] lá cây được dùng trong dân gian với các công dụng sau đây:

 Khôi phục sức khỏe cho người ốm yếu, suy nhược thần kinh, làm việc quá sức

 Chữa rối loạn tiêu hóa, tiêu lỏng, lỵ, trị táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân

 Chữa đau dạ dày, loét hành tá tràng, chảy máu đường ruột, viêm loét đại tràng, trĩ nội

 Chữa viêm thận cấp và mạn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái dắt

 Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, làm giảm đau khi bị ung thư gan

ở thời kỳ phát bệnh

 Điều chỉnh huyết áp cho người bị huyết áp cao hoặc thấp

 Chữa chấn thương, chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thương sọ não

Trang 18

Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục [10] đưa ra một số bài thuốc từ cây P palatiferum

như sau:

 Chữa các bệnh về đường tiêu hóa (đi lỏng, lỵ, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7–9 lá, khoảng 2–3 lần/ngày cho đến khi khỏi, có thể nấu canh nhạt để ăn

 Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dạ dày, đường ruột, đái ra máu, phân ra máu kể cả đái buốt, đái rắt,…): ăn lá khi đói hoặc sắc nước lá đặc để uống, có thể nấu canh độ một bát nhỏ Ăn 1–5 lần, máu sẽ cầm; nên ăn ngày 2 lần

 Các bệnh ung thư thời kỳ phát bệnh: ăn lá xong, cơn đau giảm dần, người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác như khỏi bệnh Thử nghiệm qua một số bệnh ung thư dạ dày, gan, phổi,… đều thấy có diễn biến tốt Lượng lá dùng thường xuyên theo mức độ đau, thông thường ngày 2 lần, mỗi lần 3–7 lá, tùy theo hiệu quả giảm đau

 Các bệnh u ở phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng như trên, sau 1 tuần, các triệu chứng giảm hẳn, bệnh nhân ăn ngủ tốt Riêng u xơ tiền liệt tuyến, ăn vào cuối tháng, khoảng 3 tháng liên tục

 Các bệnh về gan (xơ gan cổ trướng, viêm gan,…): ăn lá tươi như trên ngày 2 lần khi đói Bột lá khô cùng với bột Tam thất theo tỉ lệ 1:1 là thuốc trị xơ gan

cổ trướng đặc hiệu

 Bệnh về thận (viêm thận cấp hoặc mãn, suy thận, các hiện tượng nước đái đục, đái ra máu): điều trị như trên sau 1 tuần Ăn 1 lần/ngày, nhưng nếu nước giải chỉ trong được nửa ngày thì tăng lên 2 lần/ngày Trong thời gian nửa tháng, các triệu chứng bệnh giảm rõ rệt

 Chữa viêm loét (loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, trĩ nội ngoại, trực tràng,…): ăn lá tươi khi đói (tốt nhất là vào buổi sáng) Với các vết thương thuộc phạm vi dạ dày, chỉ cần ăn trong 1 tuần, tránh uống rượu mạnh Khi chữa vết loét thuộc phần ruột, liều lượng cần nhiều hơn tùy theo nặng, nhẹ

 Điều chỉnh huyết áp, ổn định thần kinh: khi biến đổi huyết áp (cao hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợp mắt nghỉ trong thời gian ngắn, huyết áp sẽ

Trang 19

trở lại bình thường; khi lên cơn rối loạn thần kinh thực vật, tùy theo mức độ để định liều lượng, có thể ăn vào buổi sáng giúp cơ thể ổn định trong ngày và đề phòng khi thời tiết thay đổi đột ngột

 Chữa về chấn thương (các loại chấn thương, đặc biệt chấn thương sọ não, va đập, gãy dập xương hay bắp thịt): lá thuốc có tác dụng cầm máu, khôi phục các mô cơ bị dập, kháng viêm nhiễm, lá làm cả thuốc đắp và thuốc uống Với vết thương kín, có thể nhai để đắp; vết thương hở, nên giã để đắp

1.2.2 Nghiên cứu in vitro về dược tính

1.2.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Năm 1998, Trần Công Khánh và cộng sự [7] đã thử tác dụng kháng vi sinh vật

kiểm định (trong ống nghiệm) của cao đặc chiết từ lá cây P palatiferum, kết quả cho thấy cao đặc có tác dụng kháng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa), kháng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes), nấm mốc (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Pyricularia oryzae, Rhezoctonia solanii), nấm men

(Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans)

Năm 2005, Phan Minh Giang và cộng sự [3] đã khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng

khuẩn và kháng nấm của cao ethyl acetate và n–butanol (ở nồng độ 10 mg/ml) từ lá cây P palatiferum, các kết quả cho thấy cả hai loại cao trích đều thể hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), Gram âm (Escherichia coli) và vi nấm (Candida albicans, Candida stellatoides), trong đó cao trích ethyl acetate có hoạt tính tốt hơn cao trích n–butanol Kết quả cũng cho thấy cao trích ethyl acetate kháng tốt các chủng Salmonella typhi 158 (đường kính vòng vô khuẩn là 21,0 mm), Shigella flexneri (21,5 mm) và

Escherichia coli (21,0 mm), đây là những vi khuẩn gây bệnh về đường ruột, tiêu

chảy, viêm ruột, lỵ

Năm 2007, Trần Công Khánh và cộng sự [8] đã công bố dịch chiết

n–hexane của rễ cây P palatiferum có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với

chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus với giá trị IC50 là 174,9 mg/ml

Trang 20

1.2.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa

Năm 2005, Phan Minh Giang và cộng sự [3] đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy

hóa của các loại cao ethyl acetate và n–butanol từ lá cây P palatiferum bằng

phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cao này lên độ hoạt động của

enzyme peroxydase trong máu Kết quả cho thấy cả hai loại cao ethyl acetate và n–

butanol từ lá cây đều có tác dụng kháng oxy hóa

1.2.3 Nghiên cứu in vivo về dược tính

1.2.3.1 Thử độc tính trên động vật thử nghiệm

Năm 1999, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự [11] đã khảo sát độ độc của dịch chiết

lá P palatiferum trên cá chọi Kết quả cho thấy dịch chiết lá không độc với cá chọi

vì với nồng độ 50% cá vẫn không chết sau 5 ngày

Kết quả kiểm nghiệm độc tính của lá khô cây P palatiferum cũng đã được

thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, áp dụng trên thỏ và chuột thí nghiệm, cho thấy không có độc tính.[11]

Năm 1999, Nguyễn Thị Minh Thu và các cộng sự [12] đã thử độc tính cấp diễn

của cây P palatiferum theo phương pháp của Behrens trên chuột nhắt trắng

Phương pháp được tiến hành với các nồng độ thuốc khác nhau, liên tục theo dõi diễn tiến hành vi của chuột từ khi đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày Kết quả cao đặc toàn phần lá cây không gây độc tính cấp diễn trên chuột, không có giá trị LD50, chuột sống hoàn toàn khỏe mạnh qua 48 giờ

Năm 2009, Peerawit Padee và cộng sự [21] đã thử nghiệm độc tính của cao trích

ethanol 80% lá cây P palatiferum cả in vitro lẫn in vivo Kết quả thử nghiệm in

vitro trên tế bào thận khỉ xanh châu Phi bằng phương pháp GFP (green fluorescent

protein) cho thấy mẫu thử không độc ở nồng độ 50 g/ml, liều cao nhất có thể pha

được Với thử nghiệm in vivo, thử nghiệm với cao trích ethanol 80% được thực hiện

trên chuột trưởng thành qua đường uống, với một liều duy nhất ở các nồng độ khác nhau, 500, 1.000, 1.500, và 2.000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột Kết quả cho thấy chuột không có dấu hiệu ngộ độc trong 24 giờ đầu và không chết qua 14 ngày thử nghiệm; không có sự khác biệt về thể trọng giữa nhóm chuột thử nghiệm

Trang 21

và nhóm chuột đối chứng Với thử nghiệm in vivo trên chuột qua đường uống, mỗi

ngày, trong 14 ngày, ở các nồng độ khác nhau, 250, 500, 1.000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột, không có liều nào gây độc cho chuột Các trị số hóa lý như creatinine, triglyceride, cholesterol tổng, protein tổng và albumin không có sự khác biệt giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng

1.2.3.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan

Năm 1999, Nguyễn Thị Minh Thu [12] đã thử tác dụng bảo vệ tế bào gan của

cao đặc toàn phần lá cây P palatiferum trên chuột nhắt trắng Mô hình gây ngộ độc

gan bằng tetrachlorometane Kết quả như sau: ở liều gây độc gan 1,0 ml CCl4/kg thể trọng, chưa thấy có dấu hiệu bình phục của tế bào gan Ở liều gây độc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng, hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể, có dấu hiệu bình phục của tế bào gan

1.2.3.3 Tác dụng trị tiêu chảy

Năm 2006, Dieu HK và cộng sự [15] đã xác định hiệu quả của bột lá P

palatiferum trong trị bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ, so sánh với hai loại kháng

sinh Coli–norgen và Cotrimxazol Kết quả sau 3 ngày điều trị cho thấy bột lá khô (tỉ

lệ khỏi bệnh / tỉ lệ tái phát: 92,86% / 7,14%) có tỉ lệ khỏi bệnh cao hơn và tỉ lệ tái

phát thấp hơn so với kháng sinh Coli–norgen (90,48% / 9,52%) và Cotrimxazol

(83,33% / 14,29%)

1.2.3.4 Hiệu quả ức chế enzyme acetylcholinesterase

Năm 2010, Wararut Buncharoen và cộng sự [25] đã xác định hiệu quả ức chế

enzyme acetylcholinesterase của dịch trích nước lá cây P palatiferum trên chuột

bạch Chuột bạch đực được cho uống dịch trích nước lá cây ở các liều 0,3; 0,7 và 1,0 g/kg thể trọng trong 30 ngày Hiệu quả ức chế enzyme acetylcholinesterase được đánh giá dựa trên tế bào máu đỏ, huyết thanh và não chuột Kết quả cho thấy dịch trích có thể làm giảm sự tổng hợp enzyme acetylcholinesterase trong não

chuột Hiệu quả ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch trích nước lá cây P

palatiferum đã cho thấy tiềm năng chữa bệnh Alzheimer của cây thuốc này

Trang 22

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC

Về những nghiên cứu hóa học trên chi Pseuderanthemum, chỉ mới có những tài liệu nghiên cứu công bố trên ba loài Eranthemum pulchellum, P latifolium và P

palatiferum

1.3.1 Loài Eranthemum pulchellum

Năm 1987, Henrik Fischer W Jensen và cộng sự [16] đã cô lập được từ cuống

hoa của cây Eranthemum pulchellum một hợp chất iridoid glucoside là

eranthemoside (15) và một amine bậc bốn là betaine (33)

1.3.2 Loài Pseuderanthemum latifolium

Năm 2006, Zhu Xiang–dong và cộng sự [26] đã cô lập từ phần trên mặt đất của

cây P latifolium một số hợp chất steroid bao gồm stigmasterol (9), stigmasterol 3–

O––D–glucopyranoside (10), sitoindoside I (12); một hợp chất iridoid glucoside

là antirrhinoside (14); ba hợp chất flavonoid là 7,4’–dihydroxyflavone (28), 5,4’–

dihydroxy–7–methoxyflavone (29) và 5,6–dihydroxy–7,8,3’,4’–

tetramethoxyflavone (30); một hợp chất chứa nitrogen là allantoin (34)

1.3.3 Loài Pseuderanthemum palatiferum

Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sự [13] đã cô lập được các hợp chất

phytol (16), –sitosterol (7), hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol (9) và

poriferasterol (11) và –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) từ lá cây

P palatiferum

Năm 2003, Phan Minh Giang và cộng sự [2] đã cô lập từ lá khô cây

P palatiferum hợp chất 1–pentacosanol (2), acid palmitic (4), –sitosterol (7),

stigmasterol (9), hỗn hợp –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) và stigmasterol 3–O––D–glucopyranoside (10), hỗn hợp kaempferol 3–methoxy–7–

O––D–glucopyranoside (31) và apigenin 7–O––D–glucopyranoside (32)

Năm 2004, Nguyễn Văn Hùng và cộng sự [5] đã cô lập từ lá cây P palatiferum

các hợp chất 1–triacontanol (3), hexadecanoate glycerol (5), acid salicylic (6) và acid palmitic (4)

Trang 23

Năm 2005, Mai Đình Trị và các cộng sự [14] đã cô lập được các hợp chất từ lá

cây P palatiferum bao gồm: –amyrin (18), acid oleanolic (19), –sitosterol (7), stigmasterol (9), hỗn hợp –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) và stigmasterol 3–O––D–glucopyranoside (10)

Năm 2007, Trần Kim Thu Liễu [9] đã cô lập từ lá cây P palatiferum các hợp

chất squalene (17), dotriacontane (1), phytol (16), acid palmitic (4), –sitosterol (7),

stigmasterol (9), hỗn hợp –sitosterol 3–O––D–glucopyranoside (8) và stigmasterol 3–O––D–glucopyranoside (10), 24–methylencycloartanol (25) và

loliolide (13)

Năm 2007, Trần Công Khánh và cộng sự [8] đã cô lập từ rễ cây P palatiferum

được bốn hợp chất triterpenoid là lupeol (22), lupenone (24), betulin (23), acid pomolic (21); một acid béo là acid palmitic (4) và một dipeptide là asperglaucide (35)

Năm 2011, Mai HD và các cộng sự [19] đã cô lập từ rễ cây P palatiferum hai

hợp chất lignan là palatiferin A (26) và palatiferin B (27) Ngoài ra, còn có năm triterpene, bao gồm epifriedelanol (20), lupeol (22), betulin (23), lupenone (24) và acid pomolic (21); và một dipeptide là asperglaucide (35)

Qua việc phân tích các tài liệu tham khảo về thành phần hóa học của các cây

thuộc chi Pseuderanthemum, chúng tôi nhận thấy rằng chi này có chứa những nhóm

hợp chất như chất béo (Hình 1.2), steroid (Hình 1.3), terpenoid (Hình 1.4), lignan (Hình 1.5), flavonoid (Hình 1.6) và một vài hợp chất có chứa nitrogen (Hình 1.7)

Hình 1.2 Cấu trúc hợp chất béo và các dẫn xuất có trong chi Pseuderanthemum

Trang 24

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất steroid có trong chi Pseuderanthemum

OH O HO

Antirrhinoside (14)

O OGlc

Eranthemoside (15)

HO HO

Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất terpenoid có trong chi Pseuderanthemum

Trang 25

Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất lignan có trong chi Pseuderanthemum

Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất flavonoid có trong chi Pseuderanthemum

Hình 1.7 Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen có trong chi Pseuderanthemum

Trang 26

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT

 Thuốc thử hiện hình vết trên sắc ký lớp mỏng : H2SO4 30%, sấy nóng bảng;

 Sắc ký lớp mỏng pha thường: TLC Silica gel 60 F254 (250 m, MERCK);

 Sắc ký lớp mỏng pha đảo: TLC Silica gel 60 RP18 F254 S (200 m, MERCK);

 Sắc ký cột pha thường: Silica gel 60 (0,0400,063 mm, HIMEDIA);

 Sắc ký cột pha đảo: Li Chroprep RP18 (0,0400,063 mm, MERCK);

 Sắc ký trao đổi ion: Diaion HP20 (MITSUBISHI);

Trang 27

 Máy cộng hưởng từ hạt nhân (BRUKER AVANCE) với tần số 500 MHz cho phổ 1HNMR và 125 MHz cho phổ 13CNMR (a);

 Máy đo khối phổ HRESIMS (microOTOF–Q 10187) (b);

(a) Thực hiện tại Phòng Phân tích Cấu trúc Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội

(b) Thực hiện tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Nguyên liệu

2.1.2.1 Nhận danh

Cây Xuân hoa đỏ được nhận danh bởi nhà Thực vật học TS Võ Văn Chi và

TS Hoàng Việt, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ

Chí Minh, có tên khoa học là Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var

atropurpureum (Bull.) Fosb., họ Ô rô (Acanthaceae)

Mẫu khô của cây được lưu giữ trong quyển lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu USA007, đặt tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2.2 Thu hái mẫu

Lá cây Xuân hoa đỏ được thu hái tại xã Tân Phước, huyện Đồng Phú, tỉnh Bình Phước, vào tháng 6 năm 2008 Cây được trồng tại vườn nhà

Lá cây sau khi thu hái được loại bỏ lá sâu bệnh, rửa sạch, phơi ráo, sấy ở 6080 oC cho đến khô, xay nhuyễn thành bột để làm nguyên liệu cho nghiên cứu

2.1.2.3 Xác định độ ẩm nguyên liệu

Độ ẩm của nguyên liệu được xác định trực tiếp bằng máy phân tích độ ẩm với nguồn nhiệt là đèn halogen Mẫu nguyên liệu tươi được cắt nhỏ Lượng mẫu cho mỗi thí nghiệm là 5g Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả xác định độ ẩm của lá cây Xuân hoa đỏ là 85,36%

2.1.3 Điều chế các loại cao

Bột khô lá cây Xuân hoa đỏ (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với methanol ở nhiệt độ phòng (2 ngày/lần x 10 lần) Dịch trích được thu hồi

Trang 28

dung môi ở áp suất kém để thu được cao trích thô methanol (ĐL, 800 g) Phần cao thô methanol được hòa tan với một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt Phần dịch sệt này khi để qua đêm trong tủ lạnh có kết tủa lắng xuống Phần kết tủa được lọc và rửa bằng methanol, thu được muối vô cơ có dạng tinh thể hình phiến (50 g) Phần dịch lọc được loại béo bằng cách trích với ether dầu hỏa rồi đến ethyl acetate bằng phương pháp trích lỏnglỏng Các phần dịch trích này được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng, cao ether dầu hỏa (ĐL.P, 170 g) và cao ethyl acetate (ĐL.E, 17 g) Dịch nước được tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng cách cho qua cột Diaion HP20, với các dung môi giải ly lần lượt là nước, hỗn hợp methanol : nước (1:1) và methanol Các phân đoạn này được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng, cao nước (ĐL.N,

350 g), cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g) và cao methanol (ĐL.M, 6 g)

Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong Sơ đồ 2.1 Khối lượng và thu suất các loại cao tính trên khối lượng nguyên liệu khô ban đầu được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Khối lượng và thu suất của các loại cao của các bộ phận cây Xuân hoa đỏ

(g)

Thu suất (%)

Trang 29

Cao ether dầu hỏa (ĐL.P, 170 g)

Cao nước (ĐL.N, 350 g)

Muối vô cơ (50 g)

Cao methanol (ĐL.M, 6 g)

Pđ ĐL.MN.4 (5,33 g)

Pđ ĐL.MN.6 (6,75 g)

XHĐ-L.MN4 (51 mg) (0,00102%)

XHĐ-L.MN8 (38 mg) (0,00076%)

XHĐ-L.MN7 (42 mg) (0,00084%)

Pđ ĐL.MN.6.2 (3,75 g)

SKC, EA:M:N (30:1:1)

SKC RP-18, M:N

SKC, EA:M:N (8:1:1)

SKC, C:M:N (20:6:1)

SKC, EA:M:N (8:1:1)

Pđ ĐL.MN.5 (3,35 g)

XHĐ-L.MN6 (35 mg) (0,00070%)

Kết tủa

Qua cột Diaion HP20

Ghi chú: C: chloroform, EA: ethyl acetate, M: methanol, N: nước

(…%): thu suất so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu

M (100%)

Trang 30

2.1.4 Cô lập các hợp chất hữu cơ từ cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g)

Áp dụng phương pháp sắc ký cột pha đảo trên cao methanolnước (ĐL.MN,

30 g) để tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau

Khối lượng cao methanol-nước nạp đầu cột : 30 g

Đường kính cột : 40 mm

Chiều cao cột silica gel : 20 cm

Khối lượng silica gel pha đảo RP-18: 100 g

Hệ môi giải ly : methanol: nước với độ phân cực giảm dần (từ 1 : 8 đến 1 : 2) Theo dõi sắc ký cột bằng:

 Sắc ký lớp mỏng pha thường, hệ dung ly chloroform : methanol : nước (6 : 4 : 1 đến 20 : 6 : 1);

 Sắc ký lớp mỏng pha đảo RP-18, hệ dung ly methanol : nước (1 : 1)

 Hiện hình bằng dung dịch H2SO4 30%, hơ nóng, kết hợp soi đèn UV Hứng mỗi phân đoạn 100 ml Những phân đoạn nhỏ có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành phân đoạn lớn

Kết quả tách được 7 phân đoạn, trong đó có 3 phân đoạn ĐL.MN.4, ĐL.MN.5

và ĐL.MN.6 có vết rõ và có sự hiện diện của các hợp chất phenylethanoid (theo kinh nghiệm nghiên cứu, sắc ký lớp mỏng của các hợp chất phenylethanoid hiện hình dưới đèn UV và đặc biệt, cho vết màu hồng khi hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 30% kèm sấy nóng bảng) Kết quả được trình bày Bảng 2.2

2.1.4.1 Cô lập hợp chất từ phân đoạn ĐL.MN.4

Sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thường trên phân đoạn ĐL.MN.4 (5,33 g) thu được từ sắc ký cột cao methanol-nước (Bảng 2.2) Hệ dung môi giải ly được

sử dụng là ethyl acetate : methanol : nước (8:1:1)

Kết quả thu được 5 phân đoạn (Bảng 2.3) Trong đó phân đoạn ĐL.MN.4.4 có sắc ký lớp mỏng với vết màu hồng và được dự đoán có hiện diện phenylethanoid Sau khi tinh chế nhiều lần bằng các phương pháp sắc ký cột với các hệ dung môi giải ly ethyl acetate : methanol : nước (8:1:1) hoặc chloroform : methanol : nước (20:6:1) thu được một hợp chất vô định hình (51 mg) Hợp chất này đã được kiểm

Trang 31

tra bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung ly đều cho một vết duy nhất Hợp chất được đặt ký hiệu là XHĐL.MN4

Kết quả thu được 4 phân đoạn (Bảng 2.4) Trong đó phân đoạn ĐL.MN.5.3 có sắc ký lớp mỏng với vết màu hồng và được dự đoán có hiện diện phenylethanoid Sau khi tinh chế nhiều lần bằng các phương pháp sắc ký cột với các hệ dung môi giải ly ethyl acetate : methanol : nước (8:1:1) hoặc chloroform : methanol : nước (20:6:1) thu được một hợp chất vô định hình (35 mg) Hợp chất này đã được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung ly đều cho một vết duy nhất Hợp chất được đặt ký hiệu là XHĐL.MN6

Kết quả thu được 5 phân đoạn (Bảng 2.5) Trong đó phân đoạn ĐL.MN.6.2 có sắc ký lớp mỏng với vết màu hồng và được dự đoán có hiện diện phenylethanoid nên được tiếp tục khảo sát

Phân đoạn ĐL.MN.6.2 được áp dụng phương pháp sắc ký cột với hệ dung ly chloroform : methanol : nước (20:6:1) thì tách được hai phân đoạn có chứa phenylethanoid Kết quả được trình bày trong Bảng 2.6

Hai phân đoạn ĐL.MN.6.2.2 và ĐL.MN.6.2.3 được tinh chế nhiều lần bằng các phương pháp sắc ký cột với các hệ dung môi giải ly ethyl acetate : methanol : nước (8:1:1) hoặc chloroform : methanol : nước (20:6:1) thu được hai hợp chất vô định hình Hai hợp chất này đã được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung ly đều cho một vết duy nhất Chúng được đặt ký hiệu là XHĐL.MN7 (42 mg) và XHĐL.MN8 (38 mg)

Trang 32

Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g)

Phân đoạn Dung môi giải ly Khối

M

Ghi chú: M: methanol, N: nước

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột phân đoạn ĐL.MN.4 (5,33 g)

lượng

Kết quả

ĐL.MN.4.4 EA:M:N (8:1:1) 98 mg Vết rõ Khảo sát, thu được

XHĐL.MN4 (51 mg; 0,00102%)

Ghi chú: EA: ethyl acetate, M: methanol, N: nước

lượng

Kết quả

ĐL.MN.5.3 EA:M:N (8:1:1) 74 mg Vết rõ Khảo sát, thu được

XHĐL.MN6 (35 mg; 0,00070%)

Trang 33

lượng

Kết quả

ĐL.MN.6.2 EA:M:N (30:1:1) 3,75 g Vết rõ Tiếp tục khảo sát

Bảng 2.6 Kết quả sắc ký cột phân đoạn ĐL.MN.6.2 (3,75 g)

lượng

Kết quả

ĐL.MN.6.2.2 C:M:N (20:6:1) 94 g Vết rõ Khảo sát, thu được

XHĐL.MN7 (42 mg; 0,00084%) ĐL.MN.6.2.3 C:M:N (20:6:1) 88 mg Nhiều vết Khảo sát, thu được

XHĐL.MN8 (38 mg; 0,00076%)

Ghi chú: C: chloroform, M: methanol, N: nước

2.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

Hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư vú MCF–7 và ung thư

cổ tử cung HeLa được thử nghiệm trên các hợp chất tinh khiết cô lập được, với phương pháp Sulforhodamine B (SRB).[23]

2.2.1 Nguyên tắc

Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm, tích điện âm, sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt, có màu hồng Mật

Trang 34

độ quang đo được của dung dịch tương ứng với protein tổng hay số lượng tế bào

Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu

 Các dụng cụ thông thường khác như: pippetman, ependorf, đầu tip, falcol

2.2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB

Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB được trình bày trong Sơ đồ 2.2

2.2.3.1 Thiết kế khảo sát

Một mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin ở nồng độ 0,01 g/ml

Một mẫu chứng âm: tế bào với dung môi hòa tan chất thử (DMSO 0,25%) Các mẫu cần thử nghiệm hoạt tính gây độc

Thiết kế thử nghiệm của một mẫu bao gồm hai giếng tế bào có môi trường nuôi cấy chất thử ở nồng độ khảo sát và hai giếng không có tế bào có môi trường nuôi cấy chất thử ở nồng độ khảo sát (hai giếng blank)

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình

2.2.3.2 Xử lý kết quả

Sau khi có giá trị mật độ quang ở các bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu OD492 và OD620), tính toán các giá trị như sau:

Trang 35

Tính giá trị OD492 (hoặc OD620) = ODtb – ODblank (1)

Tính giá trị OD = OD492 – OD620 (2)

Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức

TN C

OD

%I (1 ) 100%

OD

Với: ODtb : giá trị OD của giếng có chứa tế bào

ODblank : giá trị OD của giếng blank

ODTN : giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)

ODC : giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) và (2)

 Giá trị IC 50 được xác định như sau:

Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ cho tỷ

lệ gây độc tế bào 50% bằng cách:

 Tính phương trình đường thẳng qua 2 điểm có tỷ lệ gây độc tế bào gần 50% nhất (1 điểm có tỷ lệ gây độc tế bào nhỏ hơn 50%, điểm còn lại có tỷ lệ gây độc tế bào lớn hơn 50%)

 Từ phương trình trên (có dạng y=ax+b), thế y=50 vào, ta suy ra được giá trị nồng độ x chính là IC50

2.2.4 Nơi thực hiện thử nghiệm

Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

Trang 36

Sơ đồ 2.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB[23]

 Giải đông nguồn tế bào ung thư bảo quản trong nitrogen lỏng

 Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70-80%

 Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào là 104 tế bào/giếng

 Ủ ở 37 oC, 5% CO2, 24 giờ

 Bổ sung môi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử

(không loại bỏ môi trường cũ đã có ở trong giếng)

 Ủ ở 37 oC, 5% CO2, 48 giờ

Cố định tế bào trong giếng với acid trichloroacetic 50%:

 Đặt đĩa trên vào tủ lạnh (4 oC), 1-3 giờ

 Loại bỏ chất lỏng trong mỗi giếng

 Rửa nhẹ nhàng với nước (200 l/giếng), 5 lần

 Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ

Nhuộm SRB:

 Cho dung dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng

 Ủ ở nhiệt độ phòng, 5-20 phút

 Loại bỏ dung dịch SRB

 Rửa nhẹ nhàng bằng dung dịch acid acetic 1% (5 lần)

 Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ

Đọc kết quả:

 Cho 200 ml Tris-base 10 mM vào mỗi giếng

 Lắc trên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hoàn toàn

 Đo mật độ quang ở các bước sóng 492 nm và 620 nm

 Ghi nhận số liệu

Định dạng
Số trang	72
Dung lượng	18,09 MB