Nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng chống viêm của cây dóng xanh (justicia ventricosa wall họ ô rô acanthaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY DÓNG XANH (Justicia ventricosa Wall Họ Ơ rơ Acanthaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY DĨNG XANH (Justicia ventricosa Wall Họ Ơ rơ Acanthaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển PGS TS Nguyễn Duy Thuần HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Sau đại học Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển - Đại học Dược Hà Nội, người động viên, dành nhiều thời gian q báu hướng dẫn tơi trình nghiên cứu thực Luận văn PGS TS Nguyễn Duy Thuần – –Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam người bảo tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực nghiên cứu Luận văn Tôi xin cảm ơn DS Lưu Thị Quỳnh Trang giúp đỡ, động viên tơi để tơi hồn thành luận văn cách tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên môn Dược cổ truyền- Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn, anh chị em chuyên ngành Dược học cổ truyền, em sinh viên khóa 68 làm đề tài môn Dược cổ truyền- Trường Đại học Dược Hà Nội chia sẻ, động viên, giúp đỡ hồn thành q trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình, bạn đồng nghiệp, người thân bên cạnh, động viên, ủng hộ tơi suốt q trình học tập đạt kết ngày hôm Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học viên Lê Thị Thu Hà MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1 Họ Acanthaceae chi Justicia 1.1.1 Về thực vật 1.1.1.1 Họ Acanthaceae 1.1.1.2 Chi Justicia 1.1.2 Thành phần hóa học, tác dụng sinh học chi Justicia 1.1.2.1 Thành phần hóa học 1.1.2.2 Tác dụng sinh học 1.2 Cây Dóng xanh 12 1.2.1 Mô tả thực vật 12 1.2.2 Phân bố 13 1.2.3 Tác dụng sinh học 13 1.3 Đại cương viêm số loại thuốc chống viêm…………… 14 1.3.1 Khái niệm viêm nguyên nhân gây viêm…………………… 14 1.3.2 Các chất trung gian hoá học viêm………………………… 15 1.3.3 Các loại thuốc chống viêm ………………………………………… 16 1.3.3.1 Thuốc chống viêm không steroid…………………………… 16 1.3.3.2 Thuốc chống viêm steroid (glucocorticoid)………………… 17 1.3.3.3 Thuốc chống viêm theo y học cổ truyền…………………… 17 PHẦN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 20 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu thực vật học 20 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 21 2.2.3.1 Phương pháp định tính 22 2.2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập hợp chất 23 2.2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 23 2.2.4 Phương pháp thử tác dụng dược lý 24 2.2.4.1 Thử độc tính cấp 25 2.2.4.2 Thử tác dụng chống viêm in vitro……………………………… 27 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU… 31 3.1 Ngiên cứu thực vật ………………………… 31 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu 31 3.1.2 Xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu 33 3.1.3 Đặc điểm vi học………………………………………………… 36 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 39 3.2.1 Định tính phân đoạn phản ứng hóa học 39 3.2.2 Phân lập số chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat 40 3.3 Kết thử độc tính cấp tác dụng chống viêm 49 3.3.1 Kết thử độc tính cấp……………………………………….…… 49 3.3.2 Kết thử tác dụng chống viêm in vitro…………………………… 56 PHẦN BÀN LUẬN 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG TÊN BẢNG STT Bảng 1.1 Một số loài Justicia phân bố Việt Nam Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái mẫu nghiên Trang 34 cứu với đặc điểm mô tả thực vật chí Bảng 3.2 Kết định tính nhóm chất 39 Dóng xanh Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR hợp chất JV1 42 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR hợp chất JV2 45 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR hợp chất JV3 47 Bảng 3.6 Số chuột chết lơ vòng 72 50 Bảng 3.7 Mơ tả tình trạng chuột lô sau dùng 41 mẫu thử Bảng 3.8 Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng giá trị LD50 mẫu thử cao Dóng xanh 55 10 Bảng 3.9: Kết sàng lọc hoa ̣t tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) tế bào RAW264.7 mẫu 56 11 Bảng 3.10: Kết giá trị IC50 mẫu 57 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 21 Hình 2.2 Sơ đồ chiết phân đoạn 24 Hình 3.1 Hình ảnh Dóng xanh 32 Hình 3.2: Dược liệu Dóng xanh 32 Hình 3.3 Ảnh chụp đặc điểm hình thái 33 Dóng xanh Hình 3.4: Vi phẫu Dóng xanh 36 Hình 3.5.Vi phẫu thân Dóng xanh 37 Hình 3.6 Bột dược liệu Dóng xanh 38 Hình 3.7 Sơ đồ tách chiết phân lập chất từ 41 Dóng xanh 10 Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất JV1 44 11 Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất JV2 46 12 Hình 3.10: Cấu trúc hợp chất JV3 49 13 Hình 3.11 Phổ ESI-MS JV1 70 14 Hình 3.12 Phổ 1H-NMR JV1 71 15 Hình 3.13 Phổ 13C-NMR JV1 72 16 Hình 3.14 Phổ DEPT JV1 73 17 Hình 3.15 Phổ ESI-MS JV2 74 18 Hình 3.16 Phổ 1H-NMR JV2 75 19 Hình 3.17 Phổ 13C-NMR JV2 76 20 Hình 3.18 Phổ DEPT JV2 77 21 Hình 3.19 Phổ ESI-MS JV3 78 22 Hình 3.20 Phổ 1H-NMR JV3 79 23 Hình 3.21 Phổ 13C-NMR JV3 80 24 Hình 3.22 Phổ DEPT JV3 81 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT Nồng độ ức chế 50% IC50 H-1H Inhibitory concentration 50% (nồng độ ức chế trung bình) H-1H Correlation Spectroscopy Phổ 1H-1H Cosy COSY CC Column chromatography CD3OD Cloroform COX Cyclooxygenase Sắc ký cột Cloroform CVGĐ Chống viêm giảm đau CVKS Chống viêm không steroid DCM DEPT DMEM DMSO EtOAc EtOH Dicloromethan Distortion Enhancement by Dicloromethan Phổ Dept Polarization Transfer Dulbecco's Modified Eadge’s Medium Dimethyl sulfoxid Dimethyl sulfoxid Ethyl acetat Ethyl acetat Ethanol Ethanol Hình 3.12 Phổ 1H-NMR JV1 71 Hình 3.13 Phổ 13C-NMR JV1 72 Hình 3.14 Phổ DEPT JV1 73 HÌNH PHỔ HỢP CHẤT JV2 Hình 3.15 Phổ ESI-MS JV2 74 Hình 3.16 Phổ 1H-NMR JV2 75 Hình 3.17 Phổ 13C-NMR JV2 76 Hình 3.18 Phổ DEPT JV2 77 HÌNH PHỔ HỢP CHẤT JV3 Hình 3.19 Phổ ESI-MS JV3 78 Hình 3.20 Phổ 1H-NMR chất JV3 79 Hình 3.21 Phổ 13C-NMR chất JV3 80 Hình 3.22 Phổ DEPT chất JV3 81 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BẢN TRÍCH YẾU LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Thị Thu Hà Khóa 21 Chuyên ngành: Dược liệu- Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Tên đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng chống viêm Dóng xanh (Justicia ventricosa Wall Họ Ơ rơ (Acanthaceae) Tên sở đào tạo: Trường Đại học Dược Hà Nội Mục đích đối tượng nghiên cứu 1.1 Mục đích: Mơ tả đặc điểm thực vật giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Xác định thành phần hóa học, chiết xuất phân lập số chất phận mặt đất Dóng xanh Thử độc tính cấp cao chiết toàn phần phận mặt đất Dóng xanh 1.2 Đối tượng nghiên cứu: - Nguyên liệu nghiên cứu: Phần mặt đất Dóng xanh ( Justicia ventricosa Wall Acanthaceae) - Động vật thí nghiệm: + Chuột nhắt trắng, giống cái, chủng Swiss, trọng lượng 18 - 22g 2.Phương pháp nghiên cứu sử dụng: 2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu: Phần mặt đất Dóng xanh thái nhỏ, phơi khơ Chiết lạnh với ethanol, chiết phân đoạn ethylacetat để phân lập hợp chất Dược liệu khô, xay nhỏ, nấu cao tồn phần với nước để thử độc tính cấp 2.2 Mô tả đặc điểm thực vật giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Theo phương pháp mô tả phân tích, so sánh hình thái phân loại thực vật Việc xác định dựa theo khóa phân loại chi Justicia L A.L.Takhtajan (1996), thực vật chí Trung Quốc 2011 ❖Nghiên cứu đặc điểm vi học: Nghiên cứu đặc điểm vi học theo phương pháp thơng thường: Cắt, làm tiêu vi phẫu thân Dóng xanh, quan sát đặc điểm, mô tả chụp ảnh tiêu kính hiển vi • Soi bột: Sấy khô dược liệu tủ sấy nhiệt độ 700C, sau dùng thuyền tán nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính nhỏ sẵn giọt nước cất, đặt lamen lên quan sát kính hiển vi để xác định đặc điểm bột 2.3 Nghiên cứu thành phần hoá học Phân lập chất phân đoạn ethylacetat sắc ký cột pha thuận pha đảo Nhận dạng chất phân lập dựa thơng số lý hóa nhiệt độ chảy, số liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C- NMR, DEPT 2.4 Thử độc tính cấp tác dụng chống viêm invitro Phương pháp thử độc tính cấp theo hướng dẫn Bộ Y tế OECD (TG No 420) Phương pháp thử tác dụng chống viêm cấp invitro: Xác định hoa ̣t tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) tế bào RAW264.7 Phương pháp MTT (3(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) - phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả sống sót tế bào 3.Kết kết luận 3.1 Kết * Mơ tả đặc điểm thực vật giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Qua nghiên cứu mẫu thu thập được, mơ tả đặc điểm hình thái bên xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu thu hái xã Vân Tảo, Thường Tín, Hà Nội Dóng xanh Justicia ventricosa Wall Acanthaceae Mặt khác làm vi phẫu phân tích sơ đặc điểm cấu tạo phận thân, * Về thành phần hóa học - Từ phân đoạn ethyl acetat phân lập chất thuộc nhóm hợp chất lignan : + 7mg chất keo rắn không màu, ký hiệu JV1, xác định Pinoresinol-4-O-β-D-glucoside + 8,9 mg chất màu trắng, ký hiệu JV2, xác định Syringaresinol4'-O--D-glucopyranoside + 11mg chất rắn màu trắng, ký hiệu JV3, xác định Lyoniresinol 3a-O--D-glucoside * Độc tính cấp: xác định được: Liều cao cao tồn phần Dóng xanh chuột nhắt trắng dung nạp là: 90,1 g/kg chuột nhắt trắng Mức liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) cao Dóng xanh 183,2 (158,2 – 210,5) g/kg chuột nhắt trắng * Tác dụng chống viêm invitro: Xác định hoa ̣t tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) tế bào RAW264.7 Xác định được: IC50 = 208.93 ± 1.16 µg/mL 3.2 Kết luận: • Về Mô tả đặc điểm thực vật giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Xác định mẫu nghiên cứu Dóng xanh Justicia ventricosa Wall Acanthaceae • Về thành phần hóa học Phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat là: Pinoresinol4-O-β-D-glucoside, Syringaresinol-4'-O--D-glucopyranoside, Lyoniresinol 3a-O--D-glucoside • Về thử độc tính cấp Đã xác định độc tính cấp cao chiết toàn phần phận mặt đất LD50 183,2g/1kg chuột nhắt, liều an toàn LD0 = 90,1 g dược liệu/kg chuột • Về thử tác dụng chống viêm invitro Xác định giá trị IC50 = 208.93 ± 1.16 µg/mL ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY DÓNG XANH (Justicia ventricosa Wall Họ Ơ rơ Acanthaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC... có nghiên cứu Dóng xanh thực Để có sở khoa học cho việc sử dụng Dóng xanh làm thuốc chữa bệnh cộng đồng, tiến hành đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng chống viêm. .. chống viêm phần mặt đất Dóng xanh (Justicia ventricosa Wall họ Ơ rơ Acanthaceae)" với mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm thực vật giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Xác định thành phần hóa học, chiết