1. Đặt vấn đề GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Ở Việt Nam hiện nay có nhiều loài dược liệu thuộc chi Adenosma được sử dụng trong việc phòng và điều trị viêm gan như Nhân trần (Adenosma caeruleum R. Br.), Bồ bồ (Adenosma indianum (Lour.) Merr.), Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati). Cả ba loài dược liệu trên đều được đưa vào các chuyên luận Dược điển Việt Nam và các tài liệu chính thống về cây thuốc Việt Nam. Trong đó dược liệu Bồ bồ, được nghiên cứu khá nhiều về thành phần cũng như tác dụng sinh học của tinh dầu có trong dược liệu này và được sử dụng khá phổ biến ở miền Bắc. Tuy nhiên ở miền Nam, Nhân trần tía hay còn được gọi là Nhân trần Tây Ninh được sử dụng khá phổ biến. Trên lâm sàng cũng cho thấy có tác dụng trong điều trị viêm gan, bệnh viện Nhiệt Đới đã từng dùng dược liệu này chữa cho hơn 4.000 trường hợp viêm gan do virus và đạt kết quả tốt, bệnh viện Y học Dân tộc Tây Ninh đã dùng để chữa hơn 100 trường hợp xơ gan cổ trướng cho kết quả khỏi bệnh là 24% và tiến triển khá tốt là 46,6%. Thêm vào đó nhóm nghiên cứu Đại Học Y Dược TPHCM đã nghiên cứu sàng lọc 56 dược liệu, trong đó dược liệu Nhân trần tía cho tác dụng chống oxy hoá cao, trên cả 4 mô hình thử nghiệm. Bên cạnh các nghiên cứu được đánh giá cao về tác dụng trị liệu, thì việc nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi, đánh giá thành phần, hàm lượng các hợp chất chính, để có thể đánh giá, đảm bảo hợp chất lượng, tiêu chuẩn hóa dược liệu, sử dụng trong chăm sóc sức khỏe một cách an toàn, hiệu quả và khoa học vẫn có rất ít nghiên cứu. Để nâng cao giá trị cũng như hiểu biết về dược liệu Nhân trần tía, đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học về cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Botani- Scrophulariacea)” được thực hiện với các mục tiêu: 1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của cây Nhân trần tía 2. Nghiên cứu về hóa học của cây Nhân trần tía
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI SCROPHULARIACEAE Ngành: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN Mã số: 62.73.10.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 Cơng trình hồn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Hùng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng đánh gía luận án cấp trường họp tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH vào hồi … giờ……….ngày…….tháng…… năm … Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh - Thư viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Ở Việt Nam có nhiều lồi dược liệu thuộc chi Adenosma sử dụng việc phòng điều trị viêm gan Nhân trần (Adenosma caeruleum R Br.), Bồ bồ (Adenosma indianum (Lour.) Merr.), Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) Cả ba loài dược liệu đưa vào chuyên luận Dược điển Việt Nam tài liệu thống thuốc Việt Nam Trong dược liệu Bồ bồ, nghiên cứu nhiều thành phần tác dụng sinh học tinh dầu có dược liệu sử dụng phổ biến miền Bắc Tuy nhiên miền Nam, Nhân trần tía hay gọi Nhân trần Tây Ninh sử dụng phổ biến Trên lâm sàng cho thấy có tác dụng điều trị viêm gan, bệnh viện Nhiệt Đới dùng dược liệu chữa cho 4.000 trường hợp viêm gan virus đạt kết tốt, bệnh viện Y học Dân tộc Tây Ninh dùng để chữa 100 trường hợp xơ gan cổ trướng cho kết khỏi bệnh 24% tiến triển tốt 46,6% Thêm vào nhóm nghiên cứu Đại Học Y Dược TPHCM nghiên cứu sàng lọc 56 dược liệu, dược liệu Nhân trần tía cho tác dụng chống oxy hố cao, mơ hình thử nghiệm Bên cạnh nghiên cứu đánh giá cao tác dụng trị liệu, việc nghiên cứu thành phần hóa học phương pháp theo dõi, đánh giá thành phần, hàm lượng hợp chất chính, để đánh giá, đảm bảo hợp chất lượng, tiêu chuẩn hóa dược liệu, sử dụng chăm sóc sức khỏe cách an tồn, hiệu khoa học có nghiên cứu Để nâng cao giá trị hiểu biết dược liệu Nhân trần tía, đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Nhân trần tía (Adenosma bracteosum BotaniScrophulariacea)” thực với mục tiêu: Nghiên cứu đặc điểm thực vật Nhân trần tía Nghiên cứu hóa học Nhân trần tía - Khảo sát thành phần hóa thực vật dược liệu Nhân trần tía Phân lập hợp chất hố học có tinh dầu dược liệu Nhân trần tía - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Xây dựng quy trình định lượng - Xây dựng quy trình định lượng hai flavonoid có dược liệu - Xây dựng quy trình định lượng carvacrol có tinh dầu Nhân trần tía Khảo sát tác dụng sinh học - Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết số hợp chất phân lập từ Nhân trần tía mơ hình DPPH - Khảo sát tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nhân trần tía Tính cấp thiết đề tài Nước ta có có nguồn tài nguyên thực vật phong phú với 12000 loài nguồn dược liệu quý dùng bệnh Nhân trần tía dược liệu dùng để điều trị bệnh viêm gan, nhiên nghiên cứu thực vật thành phần hoá học Nhân trần nghiên cứu giới Việt Nam Do lý trên, đề tài thực loài Adenosma bracteosum nhằm làm sáng tỏ thêm thực vật, thành phần hố học, kiểm sốt hàm lượng flavonoid có dược liệu, carvacrol có tinh dầu Nhân trần tía, tác dụng dược lý dược liệu Những đóng góp luận án 3.1 Khảo sát hình thái vi học Nhân trần tía: Có so sánh khác hình thái giải phẫu học phận dùng (rễ, thân, lá) Nhân trần giai đoạn khác Bên cạnh thực soi bột phận mặt đất, tìm thấy 18 cấu tử 3.2 Chiết xuất phân lập hợp chất có dược liệu Nhân trần tía Phân lập nhóm hợp chất từ cao chiết thu 18 hợp chất định danh phương pháp phổ hoc, có hợp chất mới: AB12 3.3 Xây dựng đánh giá quy trình định lương AB9 AB18 có Nhân trần tía HPLC-PDA Đề tài xây dựng đánh giá quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid có Nhân trần tía HPLC-PDA 3.4 Xây dựng đánh giá quy trình định lượng carvacrol có tinh dầu Nhân trần tía bàng GC-FID Đề tài xây dựng đánh giá quy trình định lượng carvacrol có tinh dầu Nhân trần tía GC-FID 3.5 Thử tác dụng chống oxy Nhân trần tía 3.5.1 Thử tác dụng chống oxy hố cao chiết hợp chất phân lập Các hợp chất phân lập từ Nhân trần tía (AB2, AB6; AB16, AB17, AB18) thử tác dụng chống oxy hoá UV-Vis Trong các hợp chất thử nghiệm nồng độ khác (0,01 – 1,5 mg/mL) Ở tất mẫu nồng độ khác có khả chống oxy hố Tuy nhiên đa số các mẫu cho tác dụng chống oxy hoá cao nồng độ 1,5 mg/mL 3.5.2 Thử tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nhân trần tía Tinh dầu Nhân trần tía thử tác dụng kháng khuẩn với chủng vi khuẩn, có vi khuẩn Gram dương (Pseudomonas aeruginosam, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogennes, Streptococcus pneumoniae) vi khuẩn Gram âm (Haemophilus influenzae).Kết nhận thấy tinh dầu có khả kháng loại vi khuẩn thử nghiệm, lồi Streptococcus pneumoniae có đường kính kháng khuẩn 62 mm Tinh dầu khơng có khả kháng lồi Pseudomonas aeruginosam Khi thử MIC tinh dầu nhạy (có MIC thấp 0,025 %) với loài Streptococcus pneumoniae, loại cầu khuẩn sinh mủ 4 Bố cục luận án Luận án gồm 140 trang: Mở đầu trang, tổng quan tài liệu 26 trang, nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 16 trang, kết nghiên cứu 82 trang, bàn luận 11 trang, kết luận đề nghị trang Luận án có 55 bảng, 68 hình, sơ đồ, 114 tài liệu tham khảo gồm 21 tài liệu tiếng Việt 92 tài liệu tiếng nước ngoài, trang web, 149 phụ lục thể kết thực nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NHÂN TRẦN TÍA 1.1 THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Nhân trần tía (Adenosma bracteosum) Tên Việt Nam: Nhân trần Tây Ninh, Nhân trần (nhiều) bắc, nhân trần (miền Nam) Tên khoa học: Adenosma bracteosum Bonati, họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) Đặc điểm hình thái: thảo niên, mọc đứng, không lông, thơm, cao 20-70 cm; thân hình trụ gốc, phần thân cành vng, có cạnh góc Thân cành màu tím đỏ màu xanh Lá khơng cuống, mỏng, thường lại dễ rụng, phiến thon, dài 2-2,5 cm, rộng 0,6-0,9 cm, mép có cưa, mặt có lơng, có tuyến Cụm hoa có dạng gié đứng, dài 1,5-5 cm, có nhiều bắc gốc tạo thành tổng bao bắc Các bắc phía lợp lên nhau, dạng màng suốt hình tim có chóp nhọn, mép ngun, có lơng, có tuyến mặt ngồi Lá đài 5, khơng nhau, đài hoa dạng màng Tràng hoa có màu trắng màu xanh tím, có ống cao mm, mơi có thuỳ nhau, có lơng mặt trên, cánh hoa thường rụng, lại hai bắc đài Quả nang cao mm, không lông, chứa nhiều hạt nhỏ li ti màu nâu hay đen Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát đắng Phân bố: số loài thuộc chi Adenosma R Br sử dụng làm thuốc Việt Nam, loài Nhân trần tía có phạm vi phân bố hạn chế phát thấy vài tỉnh phía Nam, Tây Ninh, Bình Dương, khu vực Vũng Tàu, đảo như: Phú Quốc Cơn Đảo Có tài liệu ghi nhận Kon Tum, Đắc Lắc Cây phân bố phổ biến Lào Campuchia Bộ phận dùng: thân, cành mang hoa phơi hay sấy khô Thu hái lúc hoa, phơi hay sấy 40-50 °C đến khô Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát đắng 1.2 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 1.2.1 Nhân trần tía (Adenosma brateosum) 1.2.1.1 Tinh dầu Từ năm 2015 nghiên cứu phân tích thành phần tinh dầu trùng khớp kết quả, thành phần carvacrol (2737,2%), carvarol methyl ether (23,2% - 28%), α-bisabolen (15,9%30,4%) γ-terpinen (9,2%) Trong lồi Nhân trần tía thu hái vùng miền khác nhau, có thành phần hàm lượng khác 1.2.1.2 Thành phần khác Nguyễn Minh Đức cộng chiết xuất phân lập hợp chất từ Nhân trần tía bracteosid A, bracteosid B bracteosid C 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC 1.3.1 Tác dụng sinh học Nhân trần tía 1.3.1.1 Tác dụng kháng khuẩn Carvacrol tinh dầu Nhân trần tía chứng minh có tác dụng kháng khuẩn mạnh 1.3.1.2 Tác dụng gan Một số bệnh viên y học cổ truyên sử dụng Nhân trần tía để điều trị viêm gan cho bệnh nhân đạt kết tốt 1.3.1.3 Tác dụng chống oxy hóa Năm 2010, Nhóm nghiên cứu Nguyễn Ngọc Hồng, Trần Hùng thực sàng lọc hoạt tính chống oxy hố 56 loài dược liệu Adenosma bracteosum dược liệu có hoạt tính mạnh so với 56 loài dược liệu nghiên cứu 1.3.1.4 Tác dụng chống viêm Nhân trần tía Tây Ninh, chứa hàm lượng carvacrol cao (27%) Carvacrol hợp chất có tác dụng hợp chất ức chế COX-II, giống hợp chất chống viêm nonsteroid (NSAIDs) thuốc ibuprofen 1.3.1.5 Độc tính Tồn chặt nhỏ phơi khô, chiết cồn 40%, cô cách thủy đến dịch đậm đặc Chuột nhắt trắng không chết liều 300 g/kg quy dược liệu khô 1.4 TÁC DỤNG THEO Y HOC CỔ TRUYỀN 1.4.1 Nhân trần tía Nhân trần tía có vị đắng, mùi thơm chứa tinh dầu, song hàm lượng thấp Nhân trần, toàn Nhân trần tía bỏ rễ chữa viêm gan, vàng da, ăn uống tiêu, sốt, cảm cúm, ngộ độc, 4000 trường hợp viêm gan siêu vi điều trị thuốc có vị Nhân trần tía bệnh viện Chợ Quán Tp Hồ Chí Minh (1977-1984), cho kết tốt Bệnh viện Y học dân tộc Tây Ninh sử dụng thuốc Nhân trần để điều trị 100 trường hợp xơ gan cổ trướng, khỏi bệnh 24%, đáp ứng tốt 46,6% CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Nhân trần tía Nguyên liệu Nhân trần tía thu hái xác định loài Adenosma bracteosum Bonati, Scrophulariaceae dựa đặc điểm hình thái so sánh với tài liệu chuyên ngành Nguyên liệu Nhân trần tía sau thu hái phơi khô mát, loại tạp học lẫn vào, xay thành bột với cỡ hạt ≤ mm, bột dược liệu bảo quản thùng nhựa chống ẩm, để nơi khô, mát, kiểm tra đạt yêu cầu độ ẩm theo DĐVN V trước sử dụng 2.1.2 Vi khuẩn thử nghiệm Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 2.2 Staphylococcus aureus ATCC 29213 Streptococcus pneumoniae ATCC 29212 Streptococcus pyogennes ATCC 12344 Moraxella catarrhalis ATCC 25238 Haemophilus influenzae ATCC 33533 CHẤT ĐỐI CHIẾU Acid ascorbic (Vitamin C) dùng thử nghiệm chống oxy hóa (Viện Kiểm Nghiệm TPHCM) số lô: QT016070614 đạt độ tinh khiết 99,17% Chất đối chiếu nhóm nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc xác định độ tinh khiết: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9) đạt độ tinh khiết 97,51%/HPLC-PDA; isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid (AB18) đạt độ tinh khiết 99,17%/HPLC-PDA; carvarol đạt độ tinh khiết 97,30%/GC-FID 2.3 TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Hệ máy HPLC Waters 600S/626, đầu dò PDA 996, cột Merck RP18 (4,6×150 mm; µm); Máy quang phổ UV-Vis U2800 Hitachi Gene Quant 1300/); Máy HPLC Hitachi L – 2000 với đầu dò PDA L – 2455, cột Merck RP-18 (4,6×150 mm; µm); Hệ thống máy GC Agilent 7890B ghép với detector FID, Ct HB-5 (30 m ì 0,25 mm, 0,25 àm film thickness); Khối phổ đo máy Micromass Quattro microTM API, chế độ ESI+ hay ESI-; NMR: Bruker Avance 500 MHz 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dược liệu sau thu hái khảo sát đặc điểm thực vật để xác định mẫu nghiên cứu góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Nhân trần tía (Khảo sát hình thái, giải phẫu học, soi bột dược liệu) Mẫu, sau khảo sát thành phần hoá học, chiết xuất phân lập hợp chất hoá học kỹ thuật sắc ký Các hợp chất phân lập được, xác định cấu trúc phương pháp phổ học thông dụng như: UV, IR, MS, NMR Trong dược liệu có hai thành phần phần bay khơng bay Những hợp chất có hàm lượng cao xây dựng quy trình định lượng (flavonoid xây dựng quy trình định lượng HPLC-PDA, carvacrol xây dựng quy trình định lượng GC-FID theo hướng dẫn ICH Tiến hành khảo sát tác dụng sinh học mơ hình in vitro số hợp chất chiếm hàm lượng cao (6 flavonoid flavonoid khảo sát tác dụng chống oxy hoá, tinh dầu khảo sát tác dụng kháng khuẩn vi khuẩn thử nghiệm: Nội dung nghiên cứu trình bày Sơ đồ Khảo sát thực vật • Chiết xuất, phân lập, tinh chế • Quy trình định lượng Flavonoid • Xác định cấu trúc hóa học • Quy trình định lượng tinh dầu Khảo sát hóa học Kiểm nghiệm Khảo sát tác dụng sinh học • Flavonoid: tác dụng chống oxy-hóa • Tinh dầu: tác dụng kháng khuẩn Sơ đồ trình tự nội dung nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC 3.1.1 Hình thái thực vật Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati, họ Scrophulariaceae) loài thân thảo, cao khoảng 30 – 40 cm Cành toả ngang hay thẳng đứng Thân có tiết diện tròn nhơ góc, thân non màu xanh có bốn cánh toả ra, thân già đỏ tía, lơng tơ thưa, nhiều phần mắt lá, gốc thân có màu nâu tía Cành mọc thẳng đứng tỏa ngang Rễ ngắn, dài 1-4 cm, rễ chùm Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát đắng 11 tiến hành sắc ký cột (12 cột pha thuận, cột pha đảo, hai cột Sephadex LH20 cột Diaion) Các chất phân lập (18 hợp chất đặt tên AB1 (20 mg), AB2 (10 mg), AB4 (15 mg), AB5 (5 mg), AB6 12 (mg) AB7 (3,7 mg), AB9 (20 mg), AB10 (4 mg), AB11 (5 mg), AB12 (4 mg), AB13 (10 mg), AB14 12 mg), AB15 (8 mg), AB16 (12 mg), AB17 (6 mg), AB18 (20 mg), AB19 (4 mg), AB22 (5 mg)) Trong có hợp chất có cấu trúc đơn giản (AB11, AB12, AB14, AB15), hợp chất monoterpen thuộc thành phần tinh dầu (AB1), hợp chất triterpen AB5 hai hợp chất nhân sterol (AB4, , AB7), 10 flavonoid, flavonoid (AB6, AB10, AB16, AB17) flavonoid gắn hai đường (AB22), flavonoid có gắn đường (4 gắn đường glucuropyranosid: AB2, AB9, AB13, AB19; gắn đường glucopyranosid: AB18), xác định cấu trúc UV, IR, MS, NMR 3.4.1.3 Xác định cấu trúc chất phân lập 3.4.1.4 Hợp chất monoterpen AB1 AB1 hợp chất lỏng có màu vàng nhạt, tỷ trọng 0,9772 g/cm3 20 °C, điểm sôi 237,7 °C, khơng tan nước sơi, dung mơi hòa tan: ethanol, diethyl ether, carbon tetrachlorid, aceton Được phân lập từ tinh dầu Nhân trần tía 15,3 2,20 10 CH3 121,0 130,9 7,01 118,9 6,71 H3C 24,0 1,20 OH 153,8 148,6 33,9 2,80 113,1 6,64 CH3 24,0 1,20 Hình 3.6 Cơng thức tương tác HMBC hợp chất AB1 3.4.1.5 Hợp chất flavonoid Hợp chất có khung flavon (AB6, AB10, AB16, AB17) 12 116,1 6,93 j=8,5 128,2 7,86 j=8,0 94,3 6,40 HO 164,7 99,5 6,11 10 102,3 157,4 61,9 3,92 162,1 4' 3' 2' 6' 1' 120,5 163,4 O 161,3 OH 5' 132,6 152,4 H3CO 128,2 7,86 j=8,0 10 106,2 148,5 60,5 3,82 OH Hình 3.7 Cơng thức tương tác HMBC AB10 110,2 7,59 j=9,0 56,6 3,93 H3CO 91,6 6,94 158,6 56,5 3,93 131,9 H3CO O 121,4 1' 5' 3' 105,1 OH 56,0 3,90 103,3 182,2 6,93 O 1' 3' R1 2' H 10 R2 H OH 10 106,4 148,5 6' 121,0 5' OCH3 110,0 7,58 102,9 7,00 OH 4' 1' 164,0 161,5 3' 2' 55,7 3,89 182,5 O Hình 3.10 Cơng thức tương tác HMBC AB16 AB10: R1=H, R2=H, R3=OH, R4=H AB6: R1=OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3, R4=H AB16: R1= OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3, R4= OCH3 AB17: R1=H, R2= OCH3, R3= OCH3, R4= OCH3 OH 4' 6' O 145,2 H3CO H 120,3 7,59 j=7,2 OH 5' H 6,97 J=7,0 2' 128,5 7,96 J=7,0 115,9 6,98 j=8,5 O R4 135,7 60,5 3,81 Hình 3.9 Cơng thức tương tác HMBC AB6 R3 132,5 152,4 OCH3 1' 121,0 102,6 6,88 O OCH3 H3CO 148,0 4' 3' 116,1 182,5 61,8 3,92 OH 61,4 4,02 115,7 6,95 OH 161,5 5' Hình 3.8 Cơng thức tương tác HMBC AB17 4' 2' 163,9 10 152,0 6' 120,4 7,59 j=9 150,8 135,8 H3CO O 116,1 6,97 J=7,0 6' 164,2 O 149,3 102,3 6,65 181,3 OH OCH3 61,4 4,02 116,1 6,93 j=8,5 128,5 7,96 J=7,0 O Hình 3.11 Cấu trúc hoá học hợp chất flavon Hợp chất có khung flavon-O-β-glucuronid (AB2, AB9, AB13, AB19) 4,68 3,16 H3CO 69,1 3,36 60,5 3,66 3,59 HOOC HO OH 77,3 3,23 HO 75,9 3,30 74,1 3,44 OH C 106,4 4,67 j=8,0 H HO 129,1 8,14 j=8,5 O 125,3 157,2 76,1 3,79 121,1 102,3 149,4 103,4 99,0 181,8 OH O 73,7 3,47 75,3 3,33 161,3 OH C 106,3 4,80 J=7,5 129,1 8,14 j=8,5 115,9 6,94 j=9,0 H O 128,9 8,06 J=9,0 O OH H O 164,0 157,2 H 115,9 6,94 j=9,0 169,9 71,5 3,49 HO O 125,1 149,2 HO O 163,9 (Z) 102,4 6,80 103,3 157,1 OH 161,1 OH 116,0 6,90 J=9,0 121,1 157,3 98,9 6,26 116,0 6,90 J=9,0 128,9 8,06 J=9,0 181,7 O Hình 3.12 Cấu trúc tương tác Hình 3.13 Cấu trúc tương tác HMBC AB2 HMBC AB9 13 HO 71,4HOOC 170,2 3,37 6'' 4'' HO 75,4 3,37 3'' 2'' 93,7 1'' 72,81 C 100,2 3,37 OH 5,16 j=8,0 H O 151,1 6,98 121,2 105,8 OH HO 7,92, H j=9 5'' 100,2 6,03 HO O 106,6 4,65 j=7,5 2'' 72,9 3,44 C OH 1'' H O 157,2 126,1 157,2 OH 102,0 6,68 O R3 O 5' 6' 129,0 8,15 j=9,0 181,1 O Hình 3.16 Cấu trúc hố học hợp chất flavon-O-β-glucuronid Hợp chất flavon-O-β- glucopyranosid (AB18) HO 60,4 3,66; 3,59 HOH2C 6'' 77,2 3,25 4'' 3'' 5'' HO 75,9 3,30 74,0 3,43 O 2'' 1'' C 106,4 4,68 8,0 129,1 8,15 J=8,8 O OH 125,2 H HO 156,9 98,8 6,27 149,3 10 157,1 OH 103,4 O 163,9 1' 115,8 6,94 8,5 OH 4' 5' 6' 121,1 102,3 6,81 161,2 3' 2' 129,1 8,15 J=8,8 115,8 6,94 8,5 181,8 O Hình 3.17 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất AB18 Hợp chất flavonoid có cấu trúc di-glycosid (AB22) Hình 3.18 Cấu trúc hợp chất AB22 OH 4' AB9: R1=β-glucuronic, R2=OH, R3=H AB2: R1= β -glucuronic 6''methylester, R2=OH, R3=H AB13: R1=OH, R2= β -glucuronic, R3=OH AB19: R1=H, R2=OH, R3= β glucuronic R2 69,0 3,35 160,9 3' 2' 163,2 1' 121,3 O 102,0 115,9 6,90 j=8,5 Hình 3.15 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất AB19 OH R1 149,3 10 O Hình 3.14 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất AB13 OH 3'' 76,5 3,24 H 182,3 146,8 129,0 8,15 j=9,0 171,9 72,5 HOOC 6'' 76,6 3,57 4'' 6,60 H 6'128,4 102,4 6,08 10 HO 161,2 115,9 5' 6,94 j= 8,5 1' 164,0 OH 4' 130,48 HO O 115,9 6,94 3' j= 8,5 2' H O 75,1 5'' 3,93 H 128,4 7,92, j=9 H 115,9 6,90 j=8,5 14 3.4.1.6 Hợp chất flavonoid 24 29 23 19 28 22 18 20 29 17 11 13 21 26 30 25 25 14 Hình 3.19 Cấu trúc hợp chất AB4 22 OH 17 24 15 HO 19 13 26 28 11 27 HO 20 O 27 23 Hình 3.20 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất AB5 Hình 3.21 Cấu trúc hợp chất AB7 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H –NMR 13C-NMR hợp chất AB5 AB7 Hợp chất AB12 Tan EA, dễ tan DMSO, MeOH; tan CHCl3; không tan n-hexan, PE; Không phát quang UV 365 nm, tắt quang UV 254 nm, cho màu tím đen phun thuốc thử FeCl3 5%, khơng màu phun thuốc thử VS; UV/methanol: l max(nm) = 279 nm; IR (KBr): υcm-1: : thể băng hấp thu (cm-1) vùng 14501650, tín hiệu vòng g -pyron; băng hấp thu 3200 - 3550, tín hiệu OH linh động; băng từ 1500 - 1700, tín hiệu liên kết C = C vòng thơm; ESI-MS (-): m/z = 237 [M+H] Phổ 1H-NMR hợp chất AB12 cho thấy vùng trường thấp có tín hiệu hai cặp proton thơm ghép ortho với [δH 7,04 (2H; d; 8,0 Hz); H-2' H-6'] [δH 6,68 (2H; d; 8,5 Hz); H-3' H-5'], chứng tỏ vòng thơm khung flavonoid có cấu trúc đối xứng Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR cho 15 thấy proton olefin [δH 6,15 (1H; s) H-3], hai proton -CH2- [δH 4,24 (2H; s) H-8], hai proton thuộc nhóm -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0; H-7] Tuy nhiên vòng thơm có hai proton thuộc nhóm hydroxy gắn vòng thơm [δH 9,27; s; H-5] [δH 8,86; s; H-4] Phổ 13C-NMR hợp chất AB12, cho tín hiệu 15 carbon có tín hiệu cộng hưởng vùng trường thấp (δc 115,5-167,1 ppm) Ở vùng trường thấp có tín hiệu carbonyl nhóm keton [δC 167,1; C-4] kết hợp liệu 13C-NMR 1H-NMR, hợp chất AB12 có vòng thơm nhân pyran Quan sát tuơng tác HMBC cho tín hiệu proton -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0; H-7] có tương tác với C-6 [δC 141,5 ppm] Tín hiệu proton hydroxy 8,86 ppm tương tác C-5 Điều chứng tỏ -CH2OH gắn vào vị trí C-6 OH gắn vào vị trí C-5 cơng thức Bên cạnh tín hiệu proton [δH 3,81 ppm] -CH2- có tương tác với C-2 [δC 167,1 ppm] C-1' [ δC 127,0 ppm] Điều chứng tỏ -CH2-, nối vòng thơm vòng pyran Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1H –NMR 13C-NMR, HMBC (DMSO-d6; 125/500MHz) hợp chất AB12 δc (ppm) 167,1 109,0 173,6 150,3 141,5 59,5 32,7 Stt 1' 127,0 2' 129,4 3' 115,3 4' 156,1 5' 115,3 6' 129,4 4-OH' 5-OH OH-7-CH2OH- Phổ DEPT =C= =CH=C= =C= =C= CH2CH2=C= =CH=CH= =C= =CH= =CH- δH ppm, mult., J (Hz) HMBC 6,27 s C-7; C-6; C-2; C-4 4,24 (d; 6,0) C-3; C-2 3,80 s C-2’; C-4’; C-2; C-1’; C-6; C5; 7,03 (t; 2,5; 8,5) 6,69 (t; 2,5; 8,5) C-8; C-2’; C-4’; C-3’ C-2’; C-4’; C-3’; C-1’ 6,69 (t; 2,5; 8,5) 7,03 (t; 2,5; 8,5) 9,27 s 8,86 s 5,61 s C-2’; C-4’; C-3’; C-1’ C-8; C-2’; C-4’; C-3’ C-3'; C-4' C-5; C-6 C-2; C-7 16 Hợp chất AB12 đề nghị (2-(4-hydroxybenzyl)-3 hydroxy-6-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4on) lần báo cáo (kết tra www.scifinder.cas.gov, ngày 13/2/2017 Cấu trúc tương quan HMBC AB12 Hình 3.22 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất AB12 Hợp chất AB14 H H H H 139,2 8,01 145,7 HO O 168,0 173,9 O 109,8 6,33 59,4 4,28 OH H H H 115,3 6,68 j=8,5 H HO 5,61 129,4 7,04 j=8 59,2 4,24 j-6 O H2 C 167,1 32,7 3,81 141,5 109,0 6,28 HO 156,1 150,3 173,6 8,86 O OH OH 26,3 2,58 O 115,3 6,68 j=8,5 127,0 129,4 7,04 j=8 H 6,94 j=8,0 131,2 7,91 j=8,5 115,5 6,94 j=8,0 167,2 161,2 131,2 7,91 j=8,5 OH 115,1 6,81 j=8,5 129,7 H 115,5 O CH8 198,4 9,27 131,5 7,78 j=8,5 161,6 115,1 6,81 j=8,5 121,3 131,5 7,78 j=8,5 OH OH Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 Cơng thức Cơng thức Công thức Công thức hợp chất hợp chất AB12 hợp chất hợp chất AB11 AB14 AB15 3.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI FLAVONOID TRONG A BRACTEOSUM BẰNG HPLC-PDA Hợp chất có khung isoscutellarein gắn đường glucuropyranosid glucopyranosid thường xuyên xuất Nhân trần tía Vì vậy, xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid sử dụng isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9) isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AB18) chất đối chiếu cần thiết cho việc kiểm nghiệm nguyên liệu 17 3.5.1 Xây dựng quy trình định, xác định độ tinh khiết AB9 AB18 HPLC-PDA Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid thực kiểm tra độ tinh khiết HPLCPDA với điều kiện sắc ký sau: Hệ thống máy: Máy HPLC Hitachi L2000, đầu dò DAD L-2455.; Pha tĩnh: Cột LiChroCart RP C18 (250 mm x mm, 5µm); Nhiệt độ cột: 25 ̊C; Thể tích tiêm mẫu: 20 µL; Tốc độ dòng: 1,4 mL/ phút; Bước sóng phát hiện: 270 nm; Pha động: ACN – H3PO4, pH = 2,5 (30 : 70) Kết quả: Tính tương thích hệ thống isoscutellarein 8-O-βglucuropyranosid isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid có RSD 1,7% 2% Sắc ký đồ AB9 AB18 đạt tính tương tính hệ thống, AB9 AB18 tiếp tục xác định độ tinh khiết pic AB9 (97,51), AB18 (99,17) Với độ tinh khiết AB9 AB18 có sử dụng làm chất đánh dấu phân tích định lượng Nhân trần tía 3.5.2 Khảo sát điều kiện sắc ký AB9 AB18 3.5.2.1 Khảo sát điều kiện chiết xuất AB9 AB18 từ A bracteosum dùng định lượng Dược liệu khảo sát quy trình chiết xuất như: dung mơi, thời gian, nhiệt độ, thể tích dung mơi, số lần chiết xuất: Vậy điều kiện chiết xuất lựa chọn: Dược liệu chiết xuất sóng siêu âm, dung môi chiết xuất methanol, nhiệt độ 60 0C, thời gian 40 phút, thể tích dung mơi 100 mL, số lần chiết xuất lần Sau cao chiết tiếp tục xử lý mẫu dùng cho trình phân tích định lượng 3.5.3 Đánh giá quy trình định lượng HPLC-PDA Quy trình định lượng thỏa mãn đầy đủ yêu cầu quy trình định lượng theo hướng dẫn ICH AOAC 18 3.5.4 Áp dụng quy trình định lượng đồng thời isoscutellarein 8-Oβ-glucuropyranosid isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid nhân trần tía HPLC-PDA Thực định lượng mẫu nhân trần tía với điều kiện sắc ký khảo sát Trong hàm lượng isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid cao mẫu bắt đẩu hao thu hái Binh Dương Mẫu chưa hoa, thu hái Tây Ninh có hàm lượng isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid thấp Bảng 3.5 Hàm lượng chất AB9 AB18 A bracteosum định lượng HPLC-PDA Nơi thu hái M ẫ u Tây Ninh Bình Dương An Giang BV.YHCT CT Thời kỳ sinh trưởng Chưa hoa Bắt đầu có hoa Hoa nở rộ Chưa hoa Bắt đầu có hoa Hoa nở rộ Trước hoa Bắt đầu hoa Mẫu khô S (mAU*phút) AB9 AB18 262339 1830616 2168069 3425899 2553276 3242888 2092237 2654476 1359266 5744926 2727167 4255423 1222481 3924170 1234222 5387962 2267742 3505149 Hàm lượng (mg/100g) AB9 AB18 0,08 0,5 46 0,59 1,0 26 0,69 1,0 01 0,55 0,7 89 0,75 3,5 58 0,71 1,2 74 0,33 1,1 72 0,33 1,6 09 0,63 1,0 91 AB9: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid; AB18: isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid Hàm lượng AB9 AB18 cao mẫu bắt đầu hoa Bình Dương cho hàm lượng AB9 AB18 cao 19 3.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CARVACROL CĨ TRONG TINH DẦU NHÂN TRẦN TÍA BẰNG GC-FID 3.6.1 Kiểm tra độ tinh khiết carvacrol Sắc ký lớp mỏng GC-FID Carvacrol thực kiểm tra độ tinh khiết GCFID với điều kiện sắc ký sau: nhiệt độ tiêm mẫu: 280oC, tỷ lệ chia dòng : 70; Cột phân tích: HP-5 (30 m x 320 µm x 0,25 µm); Detector ion hóa lửa (FID); Nhiệt độ detector: 250 oC, tốc độ dòng khí H2: 30 mL/phút, dòng khơng khí: 300 mL/phút, dòng khí bổ trợ: 45 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu: µL; Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút; Thời gian phân tích mấu: 30,5 phút Kết quả: tham khảo sắc ký đồ kết khảo sát tính tương thích hệ thống phép đo độ tinh khiết Tính tương thích hệ thống thông số thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), RSD