Ở Việt Nam hiện nay có nhiều loài dược liệu thuộc chi Adenosma được sử dụng trong việc phòng và điều trị viêm gan như Nhân trần (Adenosma caeruleum R. Br.), Bồ bồ (Adenosma indianum (Lour.) Merr.), Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati). Cả ba loài dược liệu trên đều được đưa vào các chuyên luận Dược điển Việt Nam và các tài liệu chính thống về cây thuốc Việt Nam. Trong đó dược liệu Bồ bồ, được nghiên cứu khá nhiều về thành phần cũng như tác dụng sinh học của tinh dầu có trong dược liệu này và được sử dụng khá phổ biến ở miền Bắc.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI- SCROPHULARIACEAE LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI- SCROPHULARIACEAE NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62720406 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Hùng Thành Phố Hồ Chí Minh Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả i MỤC LỤC Lời cam đoan DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học 1.2 Thành phần hoá học 11 1.3 Tác dụng sinh học 21 1.4 Tác dụng theo y hoc cổ truyền 26 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu 29 2.2 Dung mơi hóa chất 31 2.3 Chất đối chiếu 32 2.4 Trang thiết bị nghiên cứu 32 2.5 Nơi thực thử nghiệm 32 2.6 Phương pháp nghiên cứu 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1 Nghiên cứu thực vật học 46 3.2 Thử tinh khiết nguyên liệu a bracteosum 54 3.3 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật lồi a bracteosum 54 3.4 Xác định hàm lượng tinh dầu thân cành hoa nhân trần tía 54 3.5 Phân tích định tính thành phần hóa học a bracteosum sắc ký lớp mỏng 55 3.6 Chiết xuất phân lập thành phần mặt đất a bracteosum 56 3.7 Xác định cấu trúc chất phân lập 66 3.8 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid a bracteosum HPLC-PDA 98 ii 3.9 Xây dựng quy trình định lượng carvacrol có tinh dầu nhân trần tía GCFID 111 3.10 Khảo sát số tác dụng sinh học nhân trần tía 119 CHƯƠNG BÀN LUẬN 128 4.1 Thực vật học nhân trần tía a Bracteosum 128 4.2 Về mặt hóa học a Bracteosum 130 4.3 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid a Bracteosum HPLC-PDA 135 4.4 Xây dựng quy trình định lượng carvacrol a Bracteosum GC-FID 136 4.5 Thử tác dụng chống oxy nhân trần tía 137 4.6 Thử tác dụng kháng khuẩn tinh dầu nhân trần tía 139 4.7 Điểm đề tài 140 KẾT LUẬN 142 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI CỦA TÁC GIẢ 145 TÀI LIỆU THAM KHẢO 146 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ Chữ nguyên viết tắt Chemical shift d APG Angiosperm Phylogeny Group COSY COX-2 d DEPT DMSO DPPH EC50 FID GC HMBC HPLC HSQC IC J LD m MIC MS NMR PDA ppm s SKK SKLM TLTK UV VS Correlation Spectroscopy Cyclooxygenase-2 Doublet Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dimethyl sulfoxide 2,2-Diphenyl Picryl Hydrazyl Half maximal effective concentration Flame Ionization Detector Gas Chromatography Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Performance Liquid Chromatography Heteronuclear Single Quantum Correlation Inhibitory Concentration Coupling constant Lethal Dose Multiplet MIC-Minimal inhibitory concentration Mass Spectrometry Nuclear Magnetic Resonance Photodiode Array Parts per million Singlet Ultraviolet Vanilin-sulfuric Ý nghĩa Độ dời hóa học Hệ thống phân loại thực vật có hoa Đỉnh đơi Dimethyl sulfoxid Thuốc thử DPPH Nồng độ hiệu 50% Detector ion hóa lửa Sắc ký khí Sắc ký lỏng hiệu cao Nồng độ ức chế Hằng số ghép Liều gây chết Đỉnh đa Nồng độ ức chế tối thiểu Khối phổ Cộng hưởng từ hạt nhân Dãy diode quang Phần triệu Đỉnh đơn Sắc ký khí Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo Tử ngoại Thuốc thử VS iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Adenosma glutinosum (L.) Druce Hình 1.2 Adenosma indianum (Loureiro) Merrill Hình 1.3 Hợp chất monoterpenoid peroxid .12 Hình 1.4 Hợp chất flavonoid 13 Hình 1.5 Cấu trúc hoá học cistanosid F 13 Hình 1.6 Cấu trúc hố học adenosmosid 13 Hình 1.7 Cơng thức hóa học số hợp chất tinh dầu chi Adenosma 21 Hình 1.8 Cấu trúc hóa học carvacrol .24 Hình 2.1 Vòng kháng khuẩn 45 Hình 3.1 Tồn Nhân trần tía hoa 47 Hình 3.2 Vi phẫu rễ A bracteosum 48 Hình 3.3 Tầng lơng hút bần rễ A bracteosum 48 Hình 3.4 Mơ mềm vỏ rễ A bracteosum 48 Hình 3.5 Nội bì, mơ cưng mơ mềm A bracteosum 49 Hình 3.6 Gỗ rễ A bracteosum 49 Hình 3.7 Vi phẫu thân A bracteosum .50 Hình 3.8 Biểu bì, lơng bần A bracteosum 50 Hình 3.9 Mơ dày, nội bì, mơ cứng mơ mềm A bracteosum .51 Hình 3.10 Gỗ, libe mơ mềm tuỷ A bracteosum 51 Hình 3.11 Vi phẫu A bracteosum 52 Hình 3.12 Biểu bì dưới, túi tiết A bracteosum 52 Hình 3.13 Biểu bì, mơ dày, mô mềm libe gỗ A bracteosum 52 Hình 3.14 Vi phẫu A bracteosum 52 Hình 3.15 Các cấu tử bột A bracteosum 53 Hình 3.16 Các cấu tử bột A bracteosum 53 Hình 3.17 Sắc ký lớp mỏng phân tích thành phần Nhân trần tía .56 Hình 3.18 Cơng thức tương tác HMBC hợp chất AB1 67 Hình 3.19 Cơng thức tương tác HMBC AB10 73 v Hình 3.20 Cơng thức tương tác HMBC AB17 73 Hình 3.21 Cơng thức tương tác HMBC AB6 74 Hình 3.22 Cơng thức tương tác HMBC AB16 74 Hình 3.23 Cấu trúc hố học hợp chất flavon 74 Hình 3.24 Cơng thức tương tác HMBC hợp chất AB2 80 Hình 3.25 Cơng thức tương tác HMBC hợp chất AB9 80 Hình 3.26 Cơng thức tương tác HMBC hợp chất AB13 80 Hình 3.27 Cơng thức tương tác HMBC hợp chất AB19 80 Hình 3.28 Cấu trúc hố học hợp chất flavon-O-β-glucuronid 82 Hình 3.29 Cơng thức tương tác HMBC hợp chất AB18 83 Hình 3.30 Cơng thức hợp chất AB22 85 Hình 3.31 Công thức hợp chất AB4 87 Hình 3.32 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất AB5 89 Hình 3.33 Cấu trúc hợp chất AB7 .90 Hình 3.34 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất AB12 95 Hình 3.35 Cơng thức hợp chất AB11 97 Hình 3.36 Cơng thức hợp chất AB12 97 Hình 3.37 Cơng thức hợp chất AB14 97 Hình 3.38 Công thức hợp chất AB15 97 Hình 3.39 Cơng thức cấu tạo (a) phổ UV (b) isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid 99 Hình 3.40 Cơng thức cấu tạo (a) phổ UV (b) isoscutellarein 8-O-βglucuronopyranosid 99 Hình 3.41 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết AB18 100 Hình 3.42 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết AB9 100 Hình 3.43 Sắc ký đồ HPLC AB9 AB18 điều kiện sắc ký khảo sát 101 Hình 3.44 Sắc ký đồ hỗn hợp mẫu chuẩn điều kiện sắc khảo sát HPLC-PDA 103 Hình 3.45 Sắc ký đồ mẫu thử điều kiện sắc ký khảo sát 103 Hình 3.46 Biểu đồ khảo sát điều kiện chiết xuất Nhân trần tía 105 vi Hình 3.47 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống AB9 AB18 .106 Hình 3.48 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu phân tích AB9 AB18 HPLC-PDA .107 Hình 3.49 Hàm lượng chất AB9 AB18 A bracteosum định lượng HPLC-PDA .111 Hình 3.50 Cơng thức cấu tạo (a) phổ UV (b) carvacrol .112 Hình 3.51 Sắc ký đồ GC mẫu chuẩn mẫu thử điều kiện sắc ký khảo sát .113 Hình 3.52 Sắc ký đồ GC khảo sát tính tương thích hệ thống carvacrol 114 Hình 3.53 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phân tích carvacrol GC-FID 115 Hình 3.54 Hàm lượng chất carvacrol tinh dầu A bracteosum định lượng GC-FID .118 Hình 3.55 So sánh tác dụng chống oxy hóa cao chiết dựa SKLM 119 Hình 3.56 So sánh tác dụng chống oxy hóa cao chiết từ Nhân trần tía 120 Hình 3.57 Kết định tính khả kháng khuẩn Tinh dầu Nhân trần tía 122 Hình 3.58 Kết thử MIC tinh dầu Nhân trần tía 122 Hình 4.1 Con đường sinh phát nguyên piceol 134 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm phân biệt lồi Nhân trần hình thái thực vật 10 Bảng 1.2 So sánh khác hình thái vi học loài Nhân trần 10 Bảng 1.3 So sánh số tiêu kiểm nghiệm lồi Adenosma có Dược Điển 11 Bảng 1.4 So sánh hàm lượng hợp có tinh dầu Nhân trần tía thu hái vùng khác 14 Bảng 1.5 Hàm lượng hợp chất hố học có tinh dầu loài thuộc chi Adenosma 16 Bảng 1.6 Tóm tắt tính chất lý hóa carvacrol 24 Bảng 1.7 Kết hoạt tính chống oxy hóa in vitro Adenosma bracteosum .25 Bảng 2.1 Ký hiệu mẫu nguyên liệu nghiên cứu dùng cho phân tích định lượng 29 Bảng 2.2 Các yếu tố khảo sát quy trình chiết xuất cho trình định lượng flavonoid từ Nhân trần tía 38 Bảng 3.1 Kết thử tinh khiết mẫu bột dược liệu Nhân trần tía phần mặt đất (n=3) 54 Bảng 3.2 Kết phân tích sơ thành phần hố thực vật lồi A bracteosum 54 Bảng 3.3 Tính chất hàm lượng tinh dầu có Nhân trần tía 55 Bảng 3.4 Điều kiện sắc ký phân lập hợp chất có A bracteosum .63 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ 13C -NMR 1H- NMR (DMSO-d6, 125/500 MHz) hợp chất AB1 carvacrol (CDCl3, 100/400 MHz) 66 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ 13 C -NMR 1H- NMR (DMSO- d6, 125/500 MHz) AB10 apigenin 4’57 trimethoxy flavon (DMSO- d6, 125/500 MHz) 68 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 13C -NMR 1H- NMR phổ AB17 xanthomicrol (DMSO-d6, 125/500 MHz) 70 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 13C -NMR 1H- NMR (DMSO-d6, 125/500 MHz) AB6 cirsilineol .71 Lần TB SD RSD (%) AB18 tR (phút) 21,29 21,53 22,27 21,95 21,56 21,86 21,74 0,35 1,61 S (mAU*phút) 7054300 7273211 7170215 7084979 7071010 7069721 7120573 85398 1,20 Rs 1,78 1,85 1,86 1,84 1,83 1,84 1,83 As 1,38 1,38 1,42 1,47 1,39 1,36 1,40 Phụ lục 132 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử Phụ lục 133 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử AB9 (Isoscutellarein 8-O- β glucuronopyranosid) Lần TB SD RSD (%) AB9 tR (phút) 18,18 18,17 18,26 18,52 18,17 18,17 18,25 0,14 0,76 S (mAU*phút) 1814496 1860525 1862931 1852875 1882299 1894152 1861213 27514 1,48 Rs 5,14 5,00 4,96 5,17 5,17 5,17 5,10 As 1,08 1,11 1,08 1,11 1,13 1,12 1,11 Phụ lục 134 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử AB18 (isoscutellarein 8-O-β-D-glucopyranosid) Lần TB SD RSD (%) AB18 tR (phút) 22,57 22,64 22,78 23,00 22,59 22,57 22,72 0,18 0,79 S (mAU*phút) 2693310 2600006 2659766 2665856 2699956 2680753 2663779 39586 1,49 Rs 1,91 1,95 1,96 2,04 1,96 1,98 1,96 As 1,29 1,25 1,31 1,25 1,31 1,22 1,28 Phụ lục 135 Định tính AB9 (Isoscutellarein 8-O- β glucuronopyranosid) dựa tR mẫu chuẩn mẫu thử Phụ lục 136 Định tính AB18 (isoscutellarein 8-O-β-D-glucopyranosid) dựa tR mẫu chuẩn mẫu thử Phụ lục 137 Quy trình định lượng đồng thời isoscutellarein 8-O-βglucuronopyranosid isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid Nhân trần tía HPLC-PDA Quy trình định lượng hai flavonoid HPLC-PDA tóm tắt sau: Pha động nước-acid phosphoric pH 2,5 (A) - acetonitril (B) với tỷ lệ 0-10 phút 2080, tốc độ dòng 1,2 mL/phút Tỷ lệ 13-50 phút 83-17, tốc độ dòng 1,4 mL/phút Dung dịch chuẩn: Pha chất MeOH để có dung dịch chuẩn 80 µg/mL Dung dịch thử: Cân xác 2g dược liệu bột Nhân trần tía, dược liệu chiết siêu âm với 100 mL methanol, chiết lần, lần 40 phút, nhiệt độ 60 °C (PL khảo sát quy trình chiết), dịch chiết đến căn, cắn hòa tan NaOH 1%, lọc bỏ tủa Dịch chiết nước kiềm acid hoá đến pH=2, dịch chiết nước acid chiết phân bố với ether dầu để loại tạp, dịch chiết nước acid chiết phân bố với ethyl acetat (đến dịch chiết nước khơng dương tính với phản ứng cyanidin Dịch chiết ethyl acetat đến cắn, hòa tan methanol lọc qua màng lọc 0,45 µm, cho vào bình định mức mL Điều kiện sắc ký: Cột RP18 (250 mm x mm, µm).detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 270 nm Tốc độ dòng 1,4 mL/phút với thể tích tiêm mẫu 20 µL nhiệt độ cột: 25 °C Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa vào diện tích pic thu dung dịch thử, dung dịch chuẩn nồng độ dung dịch chuẩn, tính hàm lượng hợp chất theo cơng thức: Trong đó: X: hàm lượng AB9 AB18 bột dược liệu (%) Sc: diện tích pic thu mẫu chuẩn (àVìgiõy) St: din tớch pic thu c ca mu th (àVìgiõy) Cc: nng ca mu chun (mg/mL) k: pha loãng mẫu đo m: khối lượng dược liệu (mg) h: độ ẩm dược liệu (%) p: độ tinh khiết hợp chất đối chiếu (%) Phụ lục 138 Kết xác định độ ẩm dược liệu Nhân trần tía Nơi thu mẫu Tây Ninh Bình Dương An Giang Thời kỳ sinh trưởng Độ ẩm Lần (%) Lần (%) Lần (%) TB (%) Trước hoa 7,58 7,53 7,55 7,55 Đang hoa 7,58 7,93 8,01 7,51 Ra hoa đầy đủ 10,02 10,91 11,01 10,64 Trước hoa 7,18 7,18 7,19 7,18 Đang hoa 10,87 10,91 10,88 10,89 Ra hoa đầy đủ 7,53 7,84 8,12 7,83 Trước hoa 7,58 8,16 7,18 7,64 Đang hoa 7,59 7,63 7,60 7,61 12,84 12,72 13,02 12,86 Bệnh viện YHCT Cần Thơ Phụ lục 139 Kết kiểm tra độ mẫu thử thêm chuẩn nồng độ 80% Phụ lục 140 Kết kiểm tra độ mẫu thử thêm chuẩn nồng độ 100% Phụ lục 141 Kết kiểm tra độ mẫu thử thêm chuẩn nồng độ 120% Phụ lục 142 Kết phân tích tinh dầu hoa Nhân trần tía mua nhà thuốc bệnh viện Y học Cổ truyền Cần Thơ Phụ lục 143 Kết phân tích tinh dầu thân Nhân trần tía mua nhà thuốc bệnh viện Y học Cổ truyền Cần Thơ Phụ lục 144 Kết phân tích tinh dầu hoa Nhân trần tía thu hái Bình Dương Phụ lục 145 Kết phân tích tinh dầu thân Nhân trần tía thu hái Bình Dương Phụ lục 146 Kết phân tích tinh dầu hoa Nhân trần tía thu hái Tây Ninh Phụ lục 147 Kết phân tích tinh dầu thân Nhân trần tía thu hái Tây Ninh Phụ lục 148 Quy trình định lượng carvacrol tinh dầu Nhân trần tía GC-FID Quy trình định lượng carvacrol tinh dầu Nhân trần tía GC-FID - Nhiệt độ tiêm mẫu: 300 oC, tỷ lệ chia dòng : 70 - Cột phân tích: HP-5 (30 m x 320 µm x 0,25 µm) - Detector ion hóa lửa (FID) Nhiệt độ detector: 280 oC, tốc độ dòng khí H2: 30 mL/phút, dòng khơng khí: 300 mL/phút, dòng khí bổ trợ: 45 mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: µL - Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút - Thời gian phân tích mấu: 30,5 p - Chương trình rửa giải xây dựng sau: Chương trình nhiệt định lượng carvarol carvacrol GC-FID Tốc độ tăng nhiệt Nhiệt độ đạt 10 40 50 60 90 120 160 180 250 Thời gian lưu giữ (phút) 3 3 Dung dịch chuẩn: Pha chất MeOH để có dung dịch chuẩn 200,2 µg/mL Dung dịch thử: chiết xuất theo mục 2.6.3.2 Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa vào diện tích pic thu dung dịch thử, dung dịch chuẩn nồng độ dung dịch chuẩn, tính hàm lượng hợp chất theo cơng thức: Trong đó: X: hàm lượng carvacrol có dược liệu (%) Sc: diện tích pic thu c ca mu chun (àVìgiõy) St: din tớch pic thu c ca mu th (àVìgiõy) Cc: nng mẫu chuẩn (mg/mL) k: độ pha loãng mẫu đo m: khối lượng tinh dầu (mg) p: độ tinh khiết hợp chất đối chiếu (%) Phụ lục 149 Kết tra cứu chất AB12 www.scifinder.cas.gov ngày 13/2/02/2017 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA ADENOSMA BRACTEOSUM. .. khoa học nghiên cứu [18][40][42] Nhằm mục đích nâng cao giá trị sử dụng, hiểu biết dược liệu Nhân trần tía Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Nhân trần. .. trần tía (Adenosma bracteosum BotaniScrophulariaceae)” thực với mục tiêu: Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu đặc điểm thực vật Nhân trần tía Nghiên cứu hóa học Nhân trần tía - Khảo sát thành phần hóa