Bảng 4.6. Kết quả phản ứng vi trung hòa trên 3 loại tế bào
Huyết thanh
Độ pha loãng huyết thanh cao
nhất bảo vệ tế bào Hiệu giá kháng thể
DEF DEK DEL DEF DEK DEL
HT(-) - - - -
HTMD 1 1/32 1/64 1/64 5log2 6log2 6log2
HTMD 2 1/16 1/32 1/32 4log2 5log2 5log2
HT 1 1/2 1/2 - 1log2 1log2 -
HT 2 - - - -
HT 3 1/4 1/8 1/8 2log2 3log2 3log2
HT 4 - - - -
Ghi chú:
HT(-): huyết thanh vịt âm tính với kháng thể kháng DHV-1
HTMD 1, 2: huyết thanh miễn dịch được lấy sau 7 ngày gây nhiễm virus cho vịt con 14 ngày tuổi liều
104TCID50/0,5ml
HT 1, 2, 3, 4: các mẫu huyết thanh lấy từ 4 đàn vịt tại tỉnh Trà Vinh
Hình 4.8. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Neutral red
Tế bào bình thƣờng Tế bào khi nhiễm virus
29
Theo Woolcock (1989), hiệu giá kháng thể ≥ 4log2 được xem là phản ứng dương tính.
Từ Bảng 4.6 cho thấy HT(-), HT 2 và HT 4 không có kháng thể nên không bảo vệ được trên 3 loại tế bào khi bị virus tấn công.
Đối với tế bào DEF, HTMD 1 và HTMD 2 có hiệu giá kháng thể lần lượt là 5log2 và 4log2 cho kết quả dương tính, còn các mẫu huyết thanh kiểm tra HT 1 và HT 3 có hiệu giá kháng thể thấp hơn 4log2 lần lượt là 1log2 và 2log2 cho kết quả âm tính.
Tế bào không đƣợc bảo vệ bởi mẫu huyết thanh âm tính
Tế bào đƣợc bảo vệ bởi mẫu huyết thanh dƣơng tính Hình 4.9. Kết quả phản phản ứng vi trung hòa trên tế bào
Hình 4.10. Kết quả phản ứng vi trung hòa qua nhuộm Crystal violet
30
Đối với tế bào DEK và DEL, HTMD 1 và HTMD 2 đều cho kết quả dương tính với hiệu giá kháng thể lần lượt là 6log2 và 5log2. HT 1 và HT 3 có kháng thể với hàm lượng thấp không bảo vệ được tế bào cũng cho kết quả âm tính. Tóm lại, các mẫu huyết thanh miễn dịch lấy từ vịt đã gây nhiễm virus đều hiện diện với hàm lượng kháng thể cao nên bảo hộ được tế bào, còn các mẫu huyết thanh lấy từ đàn vịt khảo sát có hàm lượng kháng thể thấp hoặc không có kháng thể nên không bảo vệ được tế bào. Cho thấy đàn vịt đã tiếp xúc với mầm bệnh nên có kháng thể nhưng với hàm lượng thấp và một số chưa tiếp xúc với mầm bệnh nên không có kháng thể.
31
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Virus viêm gan vịt từ bệnh phẩm nuôi cấy trên môi trường tế bào DEF có chỉ số TCID50/0,1ml là 10-4,74.
Thời gian tạo CPE đầu tiên sớm nhất là tế bào DEL (31,63 giờ), kế đến là DEK (35,38 giờ) và chậm nhất là DEF (39,13 giờ).
Cả 3 loại tế bào DEF, DEK và DEL đều bắt màu thuốc nhuộm crystal violet tốt hơn neutral red.
Kết quả phản ứng vi trung hòa đã thực hiện được trên ba loại tế bào và cho thấy ứng dụng để khảo sát hiệu giá kháng thể trung hòa DHV-1 cũng cho kết quả tốt.
5.2. Đề nghị
Nên sử dụng crystal violet để nhuộm khi quan sát các bệnh tích tế bào.
Có thể sử dụng cả 3 loại tế bào để nuôi cấy virus viêm gan vịt và thực hiện phản ứng vi trung hòa.
32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cann A. J., 2005. “Pathogenesis”. Principles of Molecular Virology (Eds. A. J. Cann). 4th ed, Elseveir Academic Press, London, UK, pp. 208. 2. Davis D., 1987. Temperture and pH stability of duck hepatitis virus. Avian
Pathology, 16 (1): 21-30.
3. Finter, N. B., 1969. Dye Uptake Methods for Assessing Viral Cytopathogenicity and thier Application to Interferon Assays. In: J. gen. Virol 5, pp. 419-427.
4. Fitzgerald, J. E., Hanson, L. E., and Wingard, M., 1963. Cytopathic effects of Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Kidney Cell Cultures. Biol Med 114 (3), pp.814-816.
5. Hiến Thị Mỹ Trang, 2011. Thử nghiệm hoạt tính kháng virus Newcasle của interferon alpha gà biểu hiện trên hệ thống nấm men pichia pastoris ở điều kiện in vitro. Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
6. Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc gia cầm. NXB Đại học Cần Thơ, tr. 283-288.
7. Hwang J., 1965. Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Fibroblast
Cultures. Avian Diseases 9(2), pp. 285-290
8. Hwang J., 1966. Duck hepatitis virus in duck embryo liver cell culture.
Avian Diseases 10(4), pp. 508-512.
9. Lê Trần Hoài Khanh, 2009. Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle. Luận văn tốt nghiệp ngành Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ.
10.Levine P. P. và Fabricant J., 1950. A hitherto – undescribed virus diseases of ducks in North America. Cornell Vet 40, pp. 71-78.
11.Maiboroda A. D., 1972. Formation of duck hepatitis virus in culture cells.
Veterinaria 8, pp. 50-52.
12.Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007. Giáo trình vi sinh vật bệnh truyền nhiễm vật nuôi. NXB Hà Nội, tr. 290-296.
13.Nguyễn Đức Hiền, 2012. Bệnh truyền nhiễm gia cầm. NXB Đại học Cần Thơ. tr. 75-84.
33
14.Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002. Bệnh viêm gan virus vịt. Khoa học và kỹ thuật Thú y. Hội Thú y Việt Nam, tr. 87-90.
15.Nguyễn Ngọc Thanh Thảo, 2007. Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản xơ phôi gà. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
16.Nguyễn Xuân Bình. 2002. Bệnh của vịt và biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr. 56-59.
17.Phạm Sỹ Lăng, Tô Long Thành, Cù Hữu Phú và Nguyễn Hoài Nam, 2005.
Bệnh mới ở gia cầm và kỹ thuật phòng trị. NXB Nông Nghiệp, tr.100- 106.
18. Phạm Văn Kim, 2000. Vi sinh học đại cương. Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, tr. 114-116.
19.Phạm Văn Ty, 2005. Virus học. NXB Giáo Dục, tr. 50-54.
20.Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007. Công nghệ sinh học trên người và động vật. NXB Giáo Dục, tr. 127-205.
21.Renault, T., Torchy, C. and de Kinkelin, P., 1991. Spectro photometric method for titration of trout interferon, and its application to rainbout fry experimentally infected with viral haemorrhagic septicaemia virus. In: Dis.aquat.Org, 10, pp. 23-29.
22.Reuss, U., 1959. Versuche zur aktiven und passiven Immunisierung bei der Virus hepatitis der Entenkuken. Zentrabl Veterinaermed 6, pp. 808-815. 23.Woolcock P. R. và Fabricant J., 1997. Duck Hepatitis. Diseases of Poultry
(Calnek B. W., Barnes H. J., Beard C. W., McDougald L. R.). Saif Y. M., Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, pp. 661-670.
24. Woolcock, 1989. Duck virus hepatitis. A laboratory manual for the isolation and indentification of avian pathogens, the American association of avian pathologists, pp.152-155.
25.96-well PS plate, V bottom, pinch bar, sterile.
http://www.usascientific.com/96-well-plate-v-bottom-pinch-bar-sterile.aspx
26.Corning® Proculture® Spinner Flasks.
http://www.krackeler.com/products/1165-Spinner/15148-Corning-Proculture- Spinner-Flasks.htm
34
27. DMEM, high glucose, pyruvate.
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11995065#
28.E-MEM (Earle's solution) without Glutamine.
http://www.kohjin-bio.co.jp/english/products/?id=1269908974-900746 29.Instrumentos de laboratorio. http://www.museohistoricodeenfermeria.org/lista_colecciones.php?cat=3&ins trumento=1&scat1=5&scat2=131 30.MEM. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11095080#
31. OIE (2008) Chapter 2.3.8. Duck virus hepatitis. Terrestrial Manual 2008 http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/ 2008/pdf/2.03.08_DVH.pdf
32.Tissue Culture Flask
35
Phụ chƣơng 1. CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 1.1. Quy trình tạo lớp đơn tế bào DEF, DEK và DEL
- Soi trứng vịt, chọn trứng có phôi 16 ngày tuổi. Sau đó lau sạch quả trứng bằng cồn 700.
- Dùng kéo cắt vòng quanh đầu vỏ trứng trên buồng khí. Dùng kẹp đặt ở cổ và kéo phôi (phôi sống) cho vào đĩa Petri (chứa sẳn DPBS)
- Cắt bỏ đầu, các chi và nội tạng. Thu lại phần mô cơ, thận, gan và cắt nhỏ, chuyển mô đã cắt sang 1 bình erlen, rửa lại 2-3 lần với DPBS
- Rửa với trypsin – EDTA 0,05% (đã làm ấm 370C)
- Tiếp tục cho vào 10ml dung dịch trypsin – EDTA 0,05% vào, khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, rồi lọc lấy dịch nổi qua 2 lớp vải gạc vào ống falcon
- Ly tâm 1000 vòng/phút trong 15 phút, thu cặn
- Cho DPBS vào, ly tâm 1000 vòng/phút trong 15 phút và thu cặn - Cho MTTT vào, ly tâm 1000 vòng/phút trong 15 phút và thu cặn
- Cho MTTT vào, dùng micropipette để huyền phù tế bào. Sau đó tính số tế bào/ml bằng buồng đếm Neubauer
- Phân phối dịch tế bào vào các đĩa môi trường với mật độ 5.105 và ủ đĩa ở 370C, 5% CO2, 80% độ ẩm. Ta thu được lớp tế bào DEF, DEK và DEL.
1.2. Chuẩn bị lớp tế bào DEF, DEK và DEL
Mục tiêu: Tạo môi trường tế bào DEF, DEK và DEL chuẩn bị trong các thử nghiệm sau.
Chuẩn bị: Trước khi tiến hành nuôi cấy, tủ nuôi cấy và dụng cụ phải được vô trùng và chiếu tia UV trong 15 phút. Sau đó thực hiện quy trình tạo lớp các loại tế bào như ở phụ chương 1.1
Tính số lượng tế bào/ml bằng buồng đếm Neubauer và đưa tế bào vào đĩa nuôi cấy ở mật độ 5.105 tế bào/ml. Số lượng tế bào chứa trong 1ml hỗn hợp dịch tế bào được tính theo công thức:
x = (a x 1000 x 2) / y
Trong đó: x: số lượng tế bào trong 1ml
36
y: thể tích buồng đếm tính bằng cm3
2: hệ số pha loãng hỗn dịch tế bào với thuốc nhuộm
1.3. Quy trình thu nhận huyễn dịch virus từ bệnh phẩm
- Bệnh phẩm là gan, lách đem nghiền và hòa trong nước đảm bảo huyễn dịch 10%.
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dịch nổi và lọc qua đầu lọc vô trùng 0,22µm.
- Thêm 5000UI/ml penicillin, 500µg/ml streptomycin và 100µg/ml amphotericilin, sau đó trữ -700C đến khi sử dụng.
1.4. Quy trình hoạt hóa và nhân số lƣợng virus và cấy chuyền virus 3-5 lần trên môi trƣờng tế bào DEF
- Đĩa với các giếng đã có lớp đơn tế bào DEF - Rút bỏ môi trường, rửa 1 lần với DPBS
- Cho vào 100µl virus ở nồng độ pha loãng 10-1 và ủ đĩa 2 giờ ở 370C, 5% CO2.
- Loại môi trường, rửa 1 lần với DPBS
- Cho 100µl MTDT vào mỗi giếng
- Quan sát thấy CPE xuất hiện thì tiến hành đông – 700C và rã đông ở nhiệt độ phòng 3 lần. Sau đó thu huyễn dịch, trữ -700C cho đến khi dung.
1.5. Chuẩn độ virus
- Đĩa với các giếng đã có lớp đơn tế bào DEF phủ 90%
- Loại môi trường rửa 1 lần với PBS. Pha loãng dịch virus với MTPL theo log10, phân phối vào các ống và giữ ở điều kiện lạnh.
- Cho 100µl mỗi độ pha loãng vào các giếng - Phủ đĩa và ủ trong 1 giờ ở 370C, 5%CO2
- Rút bỏ virus, cho 100µl MTDT vào mỗi giếng và ủ ở 370C, 5%CO2
- Theo dõi khi các giếng xuất hiện CPE ổn định. Sau đó, xác định chỉ số TCID50/0,1ml theo phương pháp của Reed và Muench (1938).
37
Phụ chƣơng 2. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Bảng: Thời gian xuất hiện CPE đầu tiên ở các giếng nuôi cấy ban đầu Thời gian theo dõi xuất hiện CPE
đầu tiên ở các giếng (giờ)
Số giếng xuất hiện CPE (giếng)
DEF DEK DEL
6 0 0 0 12 0 0 0 24 0 23 28 30 21 1 3 36 6 3 5 48 17 21 12 54 4 0 0
Tổng số giếng theo dõi 48 48 48
So sánh thời gian tạo lớp trên ba loại tế bào One-way ANOVA: DEF, DEK, DEL
Source DF SS MS F P Factor 2 1350 675 6.21 0.003 Error 141 15334 109
Total 143 16684
S = 10.43 R-Sq = 8.09% R-Sq(adj) = 6.79%
Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev
Level N Mean StDev ---+---+---+---+-
DEF 48 39.13 9.26 (---*---) DEK 48 35.38 11.63 (---*---) DEL 48 31.63 10.26 (---*---) ---+---+---+---+- 31.5 35.0 38.5 42.0 Pooled StDev = 10.43 Grouping Information Using Fisher Method N Mean Grouping DEF 48 39.13 A DEK 48 35.38 A B DEL 48 31.63 B Means that do not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 87.83% DEF subtracted from: Lower Center Upper ---+---+---+---+---
DEK -7.96 -3.75 0.46 (---*---)
DEL -11.71 -7.50 -3.29 (---*---)
---+---+---+---+--- -10.0 -5.0 0.0 5.0 DEK subtracted from:
38
Lower Center Upper ---+---+---+---+--- DEL -7.96 -3.75 0.46 (---*---)
---+---+---+---+--- -10.0 -5.0 0.0 5.0
So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và Neutral red trên tế bào DEF
Tế bào kết cụm
Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet
Expected counts are printed below observed counts
Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm
Quan sát Crystal
tươi violet Total 1 24 16 40 20.00 20.00 0.800 0.800 2 0 8 8 4.00 4.00 4.000 4.000 Total 24 24 48 Chi-Sq = 9.600, DF = 1, P-Value = 0.002 2 cells with expected counts less than 5.
Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red
Expected counts are printed below observed counts
Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm
Quan sát Neutral
tươi red Total 1 24 12 36 18.00 18.00 2.000 2.000 2 0 12 12 6.00 6.00 6.000 6.000 Total 24 24 48 Chi-Sq = 16.000, DF = 1, P-Value = 0.000
Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red
Expected counts are printed below observed counts
Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Nhuộm
Crystal Neutral
violet red Total 1 16 12 28 14.00 14.00 0.286 0.286 2 8 12 20 10.00 10.00 0.400 0.400
39
Total 24 24 48
Chi-Sq = 1.371, DF = 1, P-Value = 0.242
Vết hoại tử, vệt tan
Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Crystal violet
Expected counts are printed below observed counts
Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm
Quan sát Crystal
tươi violet Total 1 20 22 42 21.00 21.00 0.048 0.048 2 4 2 6 3.00 3.00 0.333 0.333 Total 24 24 48 Chi-Sq = 0.762, DF = 1, P-Value = 0.383 2 cells with expected counts less than 5.
Chi-Square Test: Quan sát tươi, Nhuộm Neutral red
Expected counts are printed below observed counts
Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm
Quan sát Neutral
tươi red Total 1 20 7 27 13.50 13.50 3.130 3.130 2 4 17 21 10.50 10.50 4.024 4.024 Total 24 24 48 Chi-Sq = 14.307, DF = 1, P-Value = 0.000
Chi-Square Test: Nhuộm Crystal violet, Nhuộm Neutral red
Expected counts are printed below observed counts
Chi-Square contributions are printed below expected counts Nhuộm Nhuộm
Crystal Neutral
violet red Total 1 22 7 29 14.50 14.50 3.879 3.879 2 2 17 19 9.50 9.50 5.921 5.921 Total 24 24 48 Chi-Sq = 19.601, DF = 1, P-Value = 0.000
40
So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi, nhuộm Crystal violet và