Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của DHV-1 gây bệnh tích trên ba loại tế bào qua thời gian và mật độ CPE trên từng loại tế bào. Tế bào nào có mật độ CPE cao thì tính thích ứng của DHV-1 đối với tế bào đó cao.
3.4.2.1. Phương pháp nhuộm bằng neutral red
- Dùng micropipette hút bỏ môi trường duy trì trong các giếng chứa tế bào đã nhiễm virus viêm gan vịt và cho biểu hiện bệnh lý tế bào ổn định.
- Rửa tế bào có virus bằng đệm DPBS (đĩa 96 giếng: 100µl).
- Rút đệm ra, cho vào 0,4ml dung dịch neutral red (32µg/ml) 1:2000 ở các giếng.
- Ủ đĩa mocroplate 2 giờ trong tủ ấm CO2 (370C, 5%CO2). - Đem đĩa đã ủ và rửa 2 lần với nước muối 0,85%.
- Úp ngược đĩa để khô và quan sát kết quả (Finter, 1969).
Đ ộ ph a l oãng vi ru s 10-1 10-2 10-3 10-4 10-8 10-5 10-6 10-7
Số lần lặp lại (trên 2 đĩa)
Tỷ lệ giếng có CPE > 50% - 50%
15
3.4.2.2. Phương pháp nhuộm tế bào bằng crystal violet
- Loại môi trường duy trì ra khỏi các giếng bằng micropipette.
- Rửa nhẹ tế bào hấp thụ virus 1-2 lần bằng dung dịch đệm DPBS (giữ lạnh) (đĩa 96 giếng: 200µl).
- Hút bỏ DPBS rồi cố định bằng methanol (hoặc formalin) trong 10 phút (giữ lạnh) (đĩa 96 giếng: 50µl).
- Loại methanol (hoặc formalin), cho vào dung dịch crystal violet 0,5% (đĩa 96 giếng: 50µl) phủ bề mặt giếng. Để nhiệt độ phòng 10-50 phút.
- Rút bỏ thuốc nhuộm rồi dùng nước cất rửa 2 lần các giếng đến khi nước trong. Tránh làm bong tróc tế bào.
- Lật úp đĩa cho khô trên khăn giấy ở nhiệt độ phòng và quan sát kết quả nhuộm (Renault et al., 1991).
3.4.2.3. Bố trí thí nghiệm
Mục tiêu thí nghiệm: Xác định thời gian xuất hiện CPE đầu tiên do DHV-1 gây ra trên 3 loại tế bào (DEF, DEK và DEL) và so sánh mức độ xuất hiện CPE trên từng loại tế bào thông qua nhuộm crystal violet và neutral red.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được thực hiện trên 48 giếng cho mỗi loại tế bào trên 3 đĩa 96 giếng với mật độ tế bào 5.105 tế bào/ml, môi trường E’MEM. Mỗi giếng được đưa vào liều 100TCID50 và theo dõi cho đến khi có biểu hiện CPE ổn định, sau đó đem nhuộm.
Các chỉ tiêu theo dõi
Thời gian xuất hiện CPE đầu tiên của các giếng tế bào. Khả năng bắt màu của tế bào sống.
16
3.4.3. Xác định kháng thể kháng DHV-1 trên môi trƣờng tế bào qua phản ứng vi trung hòa
Nguyên lý: Trên các đối tượng nuôi cấy như phôi vịt, động vật cảm thụ, môi trường tế bào, virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích. Còn khi hỗn hợp virus với huyết thanh miễn dịch đặc hiệu thì virus sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích.
Mục tiêu thí nghiệm: Đánh giá khả năng trung hòa DHV-1 của các mẫu huyết thanh miễn dịch và điều tra trên 3 loại tế bào.
Chuẩn bị thí nghiệm
Môi trường tế bào đã tạo lớp trên 90% (được chuẩn bị ở trên).
Pha DHV-1 với môi trường E’MEM không huyết thanh liều 100TCID50 trong 100µl dịch virus.
Mẫu huyết thanh âm tính (-) (Navetco).
Mẫu huyết thanh miễn dịch (lấy từ vịt đã được gây nhiễm virus) và huyết thanh kiểm tra lấy từ thực địa (các đàn vịt tại tỉnh Trà Vinh).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên 3 đĩa 96 giếng lần lượt là 3 loại tế bào DEF, DEK và DEL. Mỗi nồng độ huyết thanh được pha loãng theo cơ số 2 từ 1/2, 1/4 đến 1/4096. Thí nghiệm sử dụng 1 mẫu huyết thanh đối chứng âm, 2 mẫu huyết thanh miễn dịch lấy từ vịt đã nhiễm virus và 4 mẫu huyết thanh kiểm tra được bố trí như hình 3.3.
Tế bào DPBS DPBS
Nhuộm Neutral red Nhuộm Crystal violet DPBS
Hình 3.2. Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm trên ba loại tế bào
17
Hình 3.3. Bố trí thí nghiệm phản ứng vi trung hòa
Ghi chú:
HT(-): huyết thanh vịt âm tính với kháng thể kháng DHV-1
HTMD 1, 2: huyết thanh miễn dịch được lấy sau 7 ngày gây nhiễm virus cho vịt con 14 ngày tuổi liều
104TCID50/0,5ml
HT 1, 2, 3, 4: các mẫu huyết thanh lấy từ 4 đàn vịt tại tỉnh Trà Vinh
Phương pháp vi trung hòa được tiến hành theo Woolcock (1989):
Phản ứng vi trung hòa được thực hiện trên ba loại tế bào DEF, DEK và DEL. Pha loãng bậc 2 mỗi mẫu huyết thanh (huyết thanh đã bất hoạt bằng Water bath) bằng môi trường BME (Eagle’s basal medium) cho vào 50µl mỗi giếng và cho tiếp vào 100TCID50 DHV-1 trong 50µl/giếng, ủ hổn hợp ở 370C trong 1 giờ.
Tế bào đã tạo lớp, bổ sung thêm 10% tryptose phosphate, 2mM L- glutamine, 0,17% sodium bicarbonate và 2-4% huyết thanh bào thai bò (FBS).
Sau khi ủ hỗn hợp huyết thanh và virus rút 100µl cho vào mỗi giếng tế bào sau đó ủ trong thời gian 96 giờ ở 370
C, 5% CO2. Sau khi ủ, các tế bào được cố định bằng 10% formol-buffered saline và nhuộm với 1% crystal violet. Quan sát bằng mắt thường khả năng bắt màu và dưới kính hiển vi soi ngược.
Hoạt động trung hòa virus được thể hiện ở độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà tại đó lớp tế bào đơn vẫn còn, tức là, không có xuất hiện CPE và lúc đó đã xảy ra hiện tượng trung hòa virus.
Hiệu giá kháng thể dưới 4log2 (độ pha loãng huyết thanh ở 1/16) được coi là âm tính. Độ pha loãng huyết thanh 2 1 4 1 8 1 16 1 32 1 64 1 128 1 256 1 512 1 1024 1 2048 1 4096 1 HT(-) HTMD1 HTMD2 HT1 HT2 HT4 HT3 DPBS
18
3.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng One-way ANOVA và phép thử Chi-Square Test trong phần mềm Minitab 16.
19
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu nhận lớp tế bào DEF, DEK và DEL
Từ phôi vịt 16 ngày tuổi được xử lý với trypsin tạo tế bào đơn, sau đó đưa vào đĩa 96 giếng với mật độ 5.105
tế bào/ml và ủ trong điều kiện 370C, 5%CO2, ẩm độ 80%. Ba loại tế bào trên được theo dõi cách nhau 24 giờ, theo móc 8 giờ hằng ngày. Trong quá trình theo dõi và quan sát chúng tôi ghi nhận kết quả sau:
Đối với tế bào DEF, sau khi thu nhận các tế bào đơn (hình 4.1a), tế bào được ủ tới 24 giờ, thấy có một số tế bào đã bám dính và kéo dài trên bề mặt giếng nhưng vẫn còn rất ít, các tế bào chưa bám vẫn còn nhiều (hình 4.1b). Sau 48 giờ, số tế bào kéo dài tăng lên và phủ nhiều trên bề mặt nuôi cấy (hình 4.1c). Đến 72 giờ, tế bào kéo dài khắp bề mặt giếng trên 90% (hình 4.1d).
Đối với tế bào DEK, sau khi xử lý mô bằng trypsin các tế bào tròn được thu nhận (hình 4.2a), sau 24 giờ, các tế bào đã bám và kéo dài trên bề mặt giếng (hình 4.2b). Đến 48 giờ nuôi cấy, các tế bào kéo dài tăng lên nhưng vẫn còn một số tế bào chưa bám dính (hình 4.2c). Qua đến 72 giờ tế bào đã tạo lớp từ 80 – 90% (hình 4.2d).
Đối với tế bào DEL, tế bào tròn cũng được thu nhận (hình 4.3a) và ủ sau 24 giờ thì có một số ít kéo dài, còn nhiều tế bào chưa bám dính và thấy có một số tạp mô (hình 4.3b). Thời gian từ 48 - 96 giờ nuôi cấy, các tế bào phủ nhiều hơn trên bề mặt đĩa, số lượng tế bào tròn không kéo dài giảm nhiều. Đến 120 giờ nuôi cấy tế bào đã phủ khoảng 90% bề mặt đĩa nuôi.
Tế bào tăng trưởng và phát triển trải qua 4 giai đoạn: ổn định, phát triển, tăng trưởng và suy giảm. Khi tế bào phủ khoảng 80 – 90% bề mặt giếng nuôi cấy là lúc tế bào ở cuối giai đoạn phát triển và chuẩn bị sang giai đoạn cân bằng. Theo Võ Thị Minh Thư (2002) thì thời gian tế bào phủ kín 90% bề mặt nuôi cấy là thích hợp để tiến hành thí nghiệm. Từ đó cho thấy, đối với tế bào DEF và DEK sau 72 giờ, DEL là 120 giờ đã phủ được 80-90% bề mặt giếng nuôi cấy, đây là thời điểm thích hợp thu nhận tế bào để tiến hành cho các thử nghiệm sau.
20
a. Tế bào sau khi xử lý với trypsin
Hình 4.1. Thời gian tạo lớp của tế bào DEF
c. Tế bào DEF sau 48h d. Tế bào DEF sau 72h
b. Tế bào DEF sau 24 giờ
c. Tế bào DEK sau 48h d. Tế bào DEK sau 72h
a. Tế bào sau khi xử lý với trypsin b. Tế bào DEK sau 24h
21
c. Tế bào DEL sau 48h d. Tế bào DEL sau 72h
a. Tế bào sau khi xử lý với trypsin b. Tế bào DEL sau 24h
f. Tế bào DEL sau 120h e. Tế bào DEL sau 96h
22
4.2. Chuẩn độ virus
Bảng 4.1. Kết quả tỷ lệ CPE do DHV-1 gây ra theo nồng độ virus trên môi trƣờng tế bào DEF Nồng độ virus Giếng có CPE Giếng không có CPE Giá trị cộng dồn Tỷ lệ Tỷ lệ phần trăm có CPE Giếng có CPE Giếng không có CPE 10-1 24 0 104 0 104/104 100 10-2 24 0 80 0 80/80 100 10-3 24 0 56 0 56/56 100 10-4 18 6 32 6 32/38 84,21 10-5 7 14 14 23 14/37 37,84 10-6 4 20 7 43 7/50 14 10-7 3 21 3 64 3/67 4,48 10-8 0 24 0 88 0/88 0
Qua kết quả Bảng 4.1, ở các nồng độ virus 10-1, 10-2 và 10-3 thì cả 24 giếng đều xuất hiện CPE, tỷ lệ xuất hiện CPE là 100%. Tại các nồng độ virus thấp hơn, tỷ lệ xuất hiện CPE cũng giảm, đến nồng độ pha loãng 10-8
thì không còn xuất hiện CPE. Ở nồng độ 10-4 là nồng độ virus thấp nhất gây bệnh tích trên 50% và 10-5 là nồng độ virus cao nhất gây bệnh tích dưới 50% các giếng tế bào với tỷ lệ tương ứng là 84,21% và 37,84%.
Theo Reed và Muench (1938), chỉ số TCID50/0,1 ml được tính như sau:
Khoảng cách tỷ lệ giữa 2 độ pha loãng cho tỷ lệ xuất hiện CPE > 50% và CPE < 50% tương ứng là 10-4 và 10-5 PD = 37,84 - 84,21 50 - 84,21 = 0,74 lg TCID50/0,1ml = lg10-4 - 0,74 = -4,74 TCID50 = 1/10-4,74 = 104,74
Vậy ở độ pha loãng 1:104,74, 0,1ml huyễn dịch virus sẽ gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy. Tức 0,1 ml huyễn dịch đặc sẽ chứa 104,74 TCID50. Do đó, chúng tôi sẽ sử dụng liều pha loãng 100TCID50/0,1ml DHV-1 gây nhiễm cho tế bào nuôi cấy ở các thí nghiệm sau.
23
4.3. So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp 4.3.1. Thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên của ba loại tế bào 4.3.1. Thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên của ba loại tế bào
Đĩa thí nghiệm được quan sát ở 3 thời điểm cố định 8 giờ, 14 giờ và 20 giờ, theo dõi ở các móc thời gian 6h, 12h, 18h, 24h, 36h, 48h, 54h chúng tôi ghi nhận được kết quả qua bảng 4.2.
Bảng 4.2. Thời gian xuất hiện CPE trung bình đầu tiên của ba loại tế bào sau khi gây nhiễm
Loại tế bào Số giếng Thời gian trung bình (giờ) xuất hiện CPE
(X ± SE)
DEF 48 39,13a±1,34
DEK 48 35,38ab±1,68
DEL 48 31,63b±1,48
X : thời gian xuất hiện CPE trung bình.
a,b những giá trị trong cùng một cột có chữ số khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
SE: sai số chuẩn
0 5 10 15 20 25 30 35 40
DEF DEK DEL
DEF DEK DEL
Hình 4.4. Biểu đồ thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên
Dưới đây là hình ảnh ghi nhận được trong quá trình theo dõi thí nghiệm trong 54 giờ, bắt đầu gây nhiễm virus vào tế bào:
Th ời gi an ( gi ờ) Mật độ 5.105 tế bào/ml
24
Từ số liệu và hình ảnh chúng tôi đưa ra nhận xét về kết quả sau:
Thời gian xuất hiện CPE trung bình đầu tiên là tế bào DEL với thời gian trung bình 31,63 giờ, kế tiếp là DEK với 35,38 giờ và DEF với 39,13 giờ. Sự khác biệt về thời gian xuất hiện CPE đầu tiên chỉ có tế bào DEF và DEL là khác nhau có ý nghĩa (P<0,05), còn so sánh giữa tế bào DEF với DEK và DEK với DEL là không khác nhau (P>0,05). Trong quá trình theo dõi từ sau 24 giờ thì xuất hiện CPE đầu tiên (tế bào co tròn) trên từng loại tế bào cao hơn so với nghiên cứu của Maiboroda (1972) (xuất hiện CPE sau 8 giờ gây nhiễm).
Kết quả trên cũng có thể giải thích là do thời gian tạo lớp 3 loại tế bào khác nhau nên gây nhiễm DHV-1 vào các thời điểm khác nhau, do thao tác đưa virus vào các giếng tế bào và khả năng thích ứng của virus qua số lần cấy chuyền trên tế bào.
Tế bào co tròn trên môi trƣờng DEK Tế bào co tròn trên môi trƣờng DEL
Tế bào co tròn trên môi trƣờng DEF
Hình 4.5. Tế bào tạo CPE đầu tiên sau khi gây nhiễm Tế bào co tròn
25
4.3.2. So sánh mức độ xuất hiện CPE trên từng loại tế bào thông qua nhuộm crystal violet và neutral red nhuộm crystal violet và neutral red
Bảng 4.3. So sánh mức độ sức hiện CPE khi quan sát tƣơi, nhuộm Crystal violet và Neutral red trên tế bào DEF
Các kiểu CPE
Hiệu quả quan sát CPE
Quan sát tƣơi Nhuộm Crystal
violet Nhuộm Neutral red Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Tế bào co tròn 24/24a 100 24/24a 100 24/24a 100 Sự kết cụm tế bào 24/24a 100 16/24b 66,66 12/24b 50 Vết hoại tử, vệt tan 20/24a 83,33 22/24a 91,67 7/24b 29,17
Ghi chú: a,b những giá trị trong cùng một hàng có chữ số khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Theo Bảng 4.3 các tế bào co tròn đều cho thấy 100% khi quan sát tươi và nhuộm hai loại thuốc nhuộm.
Sự kết cụm tế bào, khả năng quan sát tươi là 100% cao hơn nhuộm crystal violet là 66,66% và neutral red là 50%, khi so sánh giữa quan sát tươi và hai loại thuốc nhuộm thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05) và giữa nhuộm crystal violet và neutral red thì không khác nhau (P>0,05). Còn bệnh tích hoại tử, vệt tan khi nhuộm crystal violet (91,67%) cho khả năng quan sát cao hơn quan sát tươi và nhuộm neutral red lần lượt là 83,33% và 29,17%, tuy nhiên giữa nhuộm neutral red với quan sát tươi và nhuộm crystal violet là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Tóm lại qua tỷ lệ quan sát bệnh tích cho thấy khả năng quan sát tươi tốt hơn hai loại thuốc nhuộm và khả năng tế bào bắt màu khi nhuộm crystal violet cao hơn nhuộm neutral red.
Bảng 4.4. So sánh mức độ sức hiện CPE khi quan sát tƣơi, nhuộm Crystal violet và Neutral red trên tế bào DEK
Các kiểu CPE
Hiệu quả quan sát CPE
Quan sát tƣơi Nhuộm Crystal
violet Nhuộm Neutral red Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Tế bào co tròn 24/24a 100 21/24a 87,50 21/24a 87,50 Sự kết cụm tế bào 15/24a 62,50 8/24b 33,33 5/24b 20,83 Vết hoại tử, vệt tan 7/24a 29,17 11/24a 45,83 5/24a 20,83
Ghi chú: a,b những giá trị trong cùng một hàng có chữ số khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
26
Theo Bảng 4.4 cho thấy phương pháp xem tươi thấy nhiều bệnh tích tế bào co tròn (100%) cao hơn phương pháp nhuộm crystal violet (87,50%) và nhuộm neutral red (87,50%) nhưng không khác nhau có ý nghĩa; sự kết cụm tế bào (62,50%) cao hơn nhuộm crystal violet (33,33%) và nhuộm neutral red (20,83%) nhưng chỉ có quan sát tươi và nhuộm neutral red là có ý nghĩa thống kê (P<0,05); vết hoại tử, vệt tan qua quan sát tươi là 29,17% thấp hơn so với