Bảng 4.1. Kết quả tỷ lệ CPE do DHV-1 gây ra theo nồng độ virus trên môi trƣờng tế bào DEF Nồng độ virus Giếng có CPE Giếng không có CPE Giá trị cộng dồn Tỷ lệ Tỷ lệ phần trăm có CPE Giếng có CPE Giếng không có CPE 10-1 24 0 104 0 104/104 100 10-2 24 0 80 0 80/80 100 10-3 24 0 56 0 56/56 100 10-4 18 6 32 6 32/38 84,21 10-5 7 14 14 23 14/37 37,84 10-6 4 20 7 43 7/50 14 10-7 3 21 3 64 3/67 4,48 10-8 0 24 0 88 0/88 0
Qua kết quả Bảng 4.1, ở các nồng độ virus 10-1, 10-2 và 10-3 thì cả 24 giếng đều xuất hiện CPE, tỷ lệ xuất hiện CPE là 100%. Tại các nồng độ virus thấp hơn, tỷ lệ xuất hiện CPE cũng giảm, đến nồng độ pha loãng 10-8
thì không còn xuất hiện CPE. Ở nồng độ 10-4 là nồng độ virus thấp nhất gây bệnh tích trên 50% và 10-5 là nồng độ virus cao nhất gây bệnh tích dưới 50% các giếng tế bào với tỷ lệ tương ứng là 84,21% và 37,84%.
Theo Reed và Muench (1938), chỉ số TCID50/0,1 ml được tính như sau:
Khoảng cách tỷ lệ giữa 2 độ pha loãng cho tỷ lệ xuất hiện CPE > 50% và CPE < 50% tương ứng là 10-4 và 10-5 PD = 37,84 - 84,21 50 - 84,21 = 0,74 lg TCID50/0,1ml = lg10-4 - 0,74 = -4,74 TCID50 = 1/10-4,74 = 104,74
Vậy ở độ pha loãng 1:104,74, 0,1ml huyễn dịch virus sẽ gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy. Tức 0,1 ml huyễn dịch đặc sẽ chứa 104,74 TCID50. Do đó, chúng tôi sẽ sử dụng liều pha loãng 100TCID50/0,1ml DHV-1 gây nhiễm cho tế bào nuôi cấy ở các thí nghiệm sau.
23
4.3. So sánh tính thích ứng của chủng DHV-1 trên ba loại tế bào sơ cấp 4.3.1. Thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên của ba loại tế bào 4.3.1. Thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên của ba loại tế bào
Đĩa thí nghiệm được quan sát ở 3 thời điểm cố định 8 giờ, 14 giờ và 20 giờ, theo dõi ở các móc thời gian 6h, 12h, 18h, 24h, 36h, 48h, 54h chúng tôi ghi nhận được kết quả qua bảng 4.2.
Bảng 4.2. Thời gian xuất hiện CPE trung bình đầu tiên của ba loại tế bào sau khi gây nhiễm
Loại tế bào Số giếng Thời gian trung bình (giờ) xuất hiện CPE
(X ± SE)
DEF 48 39,13a±1,34
DEK 48 35,38ab±1,68
DEL 48 31,63b±1,48
X : thời gian xuất hiện CPE trung bình.
a,b những giá trị trong cùng một cột có chữ số khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
SE: sai số chuẩn
0 5 10 15 20 25 30 35 40
DEF DEK DEL
DEF DEK DEL
Hình 4.4. Biểu đồ thời gian trung bình xuất hiện CPE đầu tiên
Dưới đây là hình ảnh ghi nhận được trong quá trình theo dõi thí nghiệm trong 54 giờ, bắt đầu gây nhiễm virus vào tế bào:
Th ời gi an ( gi ờ) Mật độ 5.105 tế bào/ml
24
Từ số liệu và hình ảnh chúng tôi đưa ra nhận xét về kết quả sau:
Thời gian xuất hiện CPE trung bình đầu tiên là tế bào DEL với thời gian trung bình 31,63 giờ, kế tiếp là DEK với 35,38 giờ và DEF với 39,13 giờ. Sự khác biệt về thời gian xuất hiện CPE đầu tiên chỉ có tế bào DEF và DEL là khác nhau có ý nghĩa (P<0,05), còn so sánh giữa tế bào DEF với DEK và DEK với DEL là không khác nhau (P>0,05). Trong quá trình theo dõi từ sau 24 giờ thì xuất hiện CPE đầu tiên (tế bào co tròn) trên từng loại tế bào cao hơn so với nghiên cứu của Maiboroda (1972) (xuất hiện CPE sau 8 giờ gây nhiễm).
Kết quả trên cũng có thể giải thích là do thời gian tạo lớp 3 loại tế bào khác nhau nên gây nhiễm DHV-1 vào các thời điểm khác nhau, do thao tác đưa virus vào các giếng tế bào và khả năng thích ứng của virus qua số lần cấy chuyền trên tế bào.
Tế bào co tròn trên môi trƣờng DEK Tế bào co tròn trên môi trƣờng DEL
Tế bào co tròn trên môi trƣờng DEF
Hình 4.5. Tế bào tạo CPE đầu tiên sau khi gây nhiễm Tế bào co tròn
25
4.3.2. So sánh mức độ xuất hiện CPE trên từng loại tế bào thông qua nhuộm crystal violet và neutral red nhuộm crystal violet và neutral red
Bảng 4.3. So sánh mức độ sức hiện CPE khi quan sát tƣơi, nhuộm Crystal violet và Neutral red trên tế bào DEF
Các kiểu CPE
Hiệu quả quan sát CPE
Quan sát tƣơi Nhuộm Crystal
violet Nhuộm Neutral red Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Tế bào co tròn 24/24a 100 24/24a 100 24/24a 100 Sự kết cụm tế bào 24/24a 100 16/24b 66,66 12/24b 50 Vết hoại tử, vệt tan 20/24a 83,33 22/24a 91,67 7/24b 29,17
Ghi chú: a,b những giá trị trong cùng một hàng có chữ số khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Theo Bảng 4.3 các tế bào co tròn đều cho thấy 100% khi quan sát tươi và nhuộm hai loại thuốc nhuộm.
Sự kết cụm tế bào, khả năng quan sát tươi là 100% cao hơn nhuộm crystal violet là 66,66% và neutral red là 50%, khi so sánh giữa quan sát tươi và hai loại thuốc nhuộm thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05) và giữa nhuộm crystal violet và neutral red thì không khác nhau (P>0,05). Còn bệnh tích hoại tử, vệt tan khi nhuộm crystal violet (91,67%) cho khả năng quan sát cao hơn quan sát tươi và nhuộm neutral red lần lượt là 83,33% và 29,17%, tuy nhiên giữa nhuộm neutral red với quan sát tươi và nhuộm crystal violet là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Tóm lại qua tỷ lệ quan sát bệnh tích cho thấy khả năng quan sát tươi tốt hơn hai loại thuốc nhuộm và khả năng tế bào bắt màu khi nhuộm crystal violet cao hơn nhuộm neutral red.
Bảng 4.4. So sánh mức độ sức hiện CPE khi quan sát tƣơi, nhuộm Crystal violet và Neutral red trên tế bào DEK
Các kiểu CPE
Hiệu quả quan sát CPE
Quan sát tƣơi Nhuộm Crystal
violet Nhuộm Neutral red Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Tế bào co tròn 24/24a 100 21/24a 87,50 21/24a 87,50 Sự kết cụm tế bào 15/24a 62,50 8/24b 33,33 5/24b 20,83 Vết hoại tử, vệt tan 7/24a 29,17 11/24a 45,83 5/24a 20,83
Ghi chú: a,b những giá trị trong cùng một hàng có chữ số khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
26
Theo Bảng 4.4 cho thấy phương pháp xem tươi thấy nhiều bệnh tích tế bào co tròn (100%) cao hơn phương pháp nhuộm crystal violet (87,50%) và nhuộm neutral red (87,50%) nhưng không khác nhau có ý nghĩa; sự kết cụm tế bào (62,50%) cao hơn nhuộm crystal violet (33,33%) và nhuộm neutral red (20,83%) nhưng chỉ có quan sát tươi và nhuộm neutral red là có ý nghĩa thống kê (P<0,05); vết hoại tử, vệt tan qua quan sát tươi là 29,17% thấp hơn so với phương pháp nhuộm crystal violet (45,83%) và cao hơn khi nhuộm neutral red (20,83%) và không khác nhau có ý nghĩa thống kê. Nhìn chung trên tế bào DEK thì quan sát tươi cho phép nhìn tốt hơn nhuộm crystal violet và nhuộm neutral red.
Bảng 4.5. So sánh mức độ sức hiện CPE khi quan sát tƣơi, nhuộm Crystal violet và Neutral red trên tế bào DEL
Các kiểu CPE
Hiệu quả quan sát CPE
Quan sát tƣơi Nhuộm Crystal
Violet Nhuộm Neutral red Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Số giếng Tỷ lệ % Tế bào co tròn 24/24a 100 24/24a 100 24/24a 100 Sự kết cụm tế bào 13/24a 54,17 13/24a 54,17 10/24a 41,67 Vết hoại tử, vệt tan 18/24a 75,00 16/24b 66,67 10/24b 41,67
Ghi chú: a,b những giá trị trong cùng một hàng có chữ số khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Qua Bảng 4.5 cho thấy khi quan sát tươi và nhuộm 2 loại thuốc nhuộm đều quan sát được 100% tế bào co tròn; sự kết cụm tế bào khi quan sát tươi và nhuộm crytal violet đều cho tỷ lệ quan sát là 54,17% cao hơn nhuộm neutral red là 41,67%. Còn khi quan sát vệt hoại tử, vệt tan chiếm 75 % ở quan sát tươi cao hơn nhuộm crystal violet là 66,67% và nhuộm neutral red là 41,67% và chỉ có bệnh tích hoại tử, vệt tan khi quan sát tươi so với hai phương còn lại là có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Khi quan sát tươi cho thấy bệnh tích rõ hơn nhuộm crystal violet tốt hơn nhuộm neutral red.
Nhìn chung, trên cả ba loại tế bào thì khả năng quan sát tươi cho thấy các bệnh tích tế bào tốt hơn hai loại thuốc nhuộm. Có thể giải thích khi lớp tế bào có bệnh tích ổn định, lúc này một số giếng có lớp tế bào bị bong tróc nên khi nhuộm làm mất lớp tế bào đó nên không thể quan sát được hoặc trong lúc quan sát tươi thì một số giếng tế bào bị nhiễm khuẩn một phần (vẫn còn quan sát được bệnh tích) cho đến khi nhuộm thì không quan sát được.
Còn khi so sánh giữa hai thuốc nhuộm khả năng quan sát bệnh tích khi nhuộm crystal violet cao hơn nhuộm neutral red. Ta có thể giải thích như sau: khi
27
nhuộm crystal violet, các tế bào bắt màu thuốc nhuộm (ở DNA, protein trong tế bào). Tế bào chất bắt màu tím nhạt, nhân màu tím đỏ, thấy 1 – 2 hạt nhân (màu tím đậm) trong nhân. Sự tương phản về màu sắc cho thấy rõ ranh giới giữa nhân và tế bào chất, giữa tế bào và môi trường ngoài, do vậy xác định được hình thái của tế bào và các dạng bệnh tích tế bào như co tròn, tạo vệt tan, hoại tử tế bào (hình 4.6). Còn khi nhuộm neutral red , tế bào bắt màu hồng đỏ (ở lysosome trong tế bào chất), nhân không bắt màu với thuốc nhuộm thể hiện qua vệt tròn màu trắng trong tế bào. Ranh giới giữa nhân và tế bào chất, giữa tế bào và môi trường ngoài chưa rõ nét. Không thấy rõ được hình thái của tế bào hay các dạng bệnh tích tế bào (hình 4.7).
Vì vậy, việc sử dụng thuốc nhuộm crystal violet trên cả 3 loại tế bào DEF, DEK và DEL sẽ cho hiệu quả tốt hơn thuốc nhuộm neutral red trong khảo sát hình thái tế bào sống cũng như so sánh giữa tế bào bình thường và tế bào bất thường (bệnh tích tế bào khi nhiễm virus, tế bào già, nhiễm tạp mô...).
Hình 4.7. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Crystal violet Tế bào bình thƣờng
Hình 4.6. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi quan sát tƣơi
Tế bào co tròn Tế bào kết cụm, tạo vệt tan
Vệt tan Kết cụm
Co tròn
Tế bào đã gây nhiễm virus
28
4.4. Kết quả phản ứng vi trung hòa
Bảng 4.6. Kết quả phản ứng vi trung hòa trên 3 loại tế bào
Huyết thanh
Độ pha loãng huyết thanh cao
nhất bảo vệ tế bào Hiệu giá kháng thể
DEF DEK DEL DEF DEK DEL
HT(-) - - - -
HTMD 1 1/32 1/64 1/64 5log2 6log2 6log2
HTMD 2 1/16 1/32 1/32 4log2 5log2 5log2
HT 1 1/2 1/2 - 1log2 1log2 -
HT 2 - - - -
HT 3 1/4 1/8 1/8 2log2 3log2 3log2
HT 4 - - - -
Ghi chú:
HT(-): huyết thanh vịt âm tính với kháng thể kháng DHV-1
HTMD 1, 2: huyết thanh miễn dịch được lấy sau 7 ngày gây nhiễm virus cho vịt con 14 ngày tuổi liều
104TCID50/0,5ml
HT 1, 2, 3, 4: các mẫu huyết thanh lấy từ 4 đàn vịt tại tỉnh Trà Vinh
Hình 4.8. Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm DHV-1 khi nhuộm Neutral red
Tế bào bình thƣờng Tế bào khi nhiễm virus
29
Theo Woolcock (1989), hiệu giá kháng thể ≥ 4log2 được xem là phản ứng dương tính.
Từ Bảng 4.6 cho thấy HT(-), HT 2 và HT 4 không có kháng thể nên không bảo vệ được trên 3 loại tế bào khi bị virus tấn công.
Đối với tế bào DEF, HTMD 1 và HTMD 2 có hiệu giá kháng thể lần lượt là 5log2 và 4log2 cho kết quả dương tính, còn các mẫu huyết thanh kiểm tra HT 1 và HT 3 có hiệu giá kháng thể thấp hơn 4log2 lần lượt là 1log2 và 2log2 cho kết quả âm tính.
Tế bào không đƣợc bảo vệ bởi mẫu huyết thanh âm tính
Tế bào đƣợc bảo vệ bởi mẫu huyết thanh dƣơng tính Hình 4.9. Kết quả phản phản ứng vi trung hòa trên tế bào
Hình 4.10. Kết quả phản ứng vi trung hòa qua nhuộm Crystal violet
30
Đối với tế bào DEK và DEL, HTMD 1 và HTMD 2 đều cho kết quả dương tính với hiệu giá kháng thể lần lượt là 6log2 và 5log2. HT 1 và HT 3 có kháng thể với hàm lượng thấp không bảo vệ được tế bào cũng cho kết quả âm tính. Tóm lại, các mẫu huyết thanh miễn dịch lấy từ vịt đã gây nhiễm virus đều hiện diện với hàm lượng kháng thể cao nên bảo hộ được tế bào, còn các mẫu huyết thanh lấy từ đàn vịt khảo sát có hàm lượng kháng thể thấp hoặc không có kháng thể nên không bảo vệ được tế bào. Cho thấy đàn vịt đã tiếp xúc với mầm bệnh nên có kháng thể nhưng với hàm lượng thấp và một số chưa tiếp xúc với mầm bệnh nên không có kháng thể.
31
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Virus viêm gan vịt từ bệnh phẩm nuôi cấy trên môi trường tế bào DEF có chỉ số TCID50/0,1ml là 10-4,74.
Thời gian tạo CPE đầu tiên sớm nhất là tế bào DEL (31,63 giờ), kế đến là DEK (35,38 giờ) và chậm nhất là DEF (39,13 giờ).
Cả 3 loại tế bào DEF, DEK và DEL đều bắt màu thuốc nhuộm crystal violet tốt hơn neutral red.
Kết quả phản ứng vi trung hòa đã thực hiện được trên ba loại tế bào và cho thấy ứng dụng để khảo sát hiệu giá kháng thể trung hòa DHV-1 cũng cho kết quả tốt.
5.2. Đề nghị
Nên sử dụng crystal violet để nhuộm khi quan sát các bệnh tích tế bào.
Có thể sử dụng cả 3 loại tế bào để nuôi cấy virus viêm gan vịt và thực hiện phản ứng vi trung hòa.
32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cann A. J., 2005. “Pathogenesis”. Principles of Molecular Virology (Eds. A. J. Cann). 4th ed, Elseveir Academic Press, London, UK, pp. 208. 2. Davis D., 1987. Temperture and pH stability of duck hepatitis virus. Avian
Pathology, 16 (1): 21-30.
3. Finter, N. B., 1969. Dye Uptake Methods for Assessing Viral Cytopathogenicity and thier Application to Interferon Assays. In: J. gen. Virol 5, pp. 419-427.
4. Fitzgerald, J. E., Hanson, L. E., and Wingard, M., 1963. Cytopathic effects of Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Kidney Cell Cultures. Biol Med 114 (3), pp.814-816.
5. Hiến Thị Mỹ Trang, 2011. Thử nghiệm hoạt tính kháng virus Newcasle của interferon alpha gà biểu hiện trên hệ thống nấm men pichia pastoris ở điều kiện in vitro. Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
6. Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc gia cầm. NXB Đại học Cần Thơ, tr. 283-288.
7. Hwang J., 1965. Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Fibroblast
Cultures. Avian Diseases 9(2), pp. 285-290
8. Hwang J., 1966. Duck hepatitis virus in duck embryo liver cell culture.
Avian Diseases 10(4), pp. 508-512.
9. Lê Trần Hoài Khanh, 2009. Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle. Luận văn tốt nghiệp ngành Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ.
10.Levine P. P. và Fabricant J., 1950. A hitherto – undescribed virus diseases of ducks in North America. Cornell Vet 40, pp. 71-78.
11.Maiboroda A. D., 1972. Formation of duck hepatitis virus in culture cells.
Veterinaria 8, pp. 50-52.
12.Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007. Giáo trình vi sinh vật bệnh truyền nhiễm vật nuôi. NXB Hà Nội, tr. 290-296.
13.Nguyễn Đức Hiền, 2012. Bệnh truyền nhiễm gia cầm. NXB Đại học Cần Thơ. tr. 75-84.
33
14.Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002. Bệnh viêm gan virus vịt. Khoa