Nghiên cứu phát hiện các hợp chất dioxin ở người phơi nhiễm chất da cam dioxin bằng kỹ thuật DR calux

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC HỢP CHẤT DIOXIN Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM CHẤT DA CAM/DIOXIN BẰNG KỸ THUẬT DR CALUX NGUYỄN NGỌC TỒN CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 60420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ MINH TRUNG HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập hồn thành luận văn này, tơi nhận hướng dẫn, giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị, em bạn Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Ban Lãnh đạo, Khoa Sau đại học, Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội TS Đỗ Minh Trung Cán Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân -Học viện Quân y, người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Hội đồng chấm luận văn cho nhiều ý kiến xác đáng q báu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Văn Khoa, TS Phạm Thế Tài tập thểcán bộ, giảng viên Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân -Học viện Quân y, lãnh đạo, cán nhân viên Sở Xây dựng Hà Nội, Sở Tài Nguyên & Môi Trường Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối cho gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ln cạnh tơi, giúp đỡ động viên tơi q trình thực hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn ngọc Toàn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .1 DANH MỤC CÁC TỪ, NGỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .10 1.1 Dioxin độc tính dioxin 10 1.1.1 Dioxin chất loại dioxin 10 1.1.2 Độc tính dioxin .12 1.1.3 Quá trình hấp thụ tích lũy thể người 15 1.1.4 Cơ chế tác động dioxin lên tế bào 17 1.2 Tác động chất da cam/dioxin lên người 18 1.2.1 Tác động gây tử vong cấp tính 19 1.2.2 Tác động hệ hô hấp 19 1.2.3 Tác động hệ tuần hoàn 20 1.2.4 Tác động hệ tiêu hóa 21 1.2.5 Tác động hệ nội tiết .21 1.2.6 Tác động da 22 1.2.7 Tác động hệ thần kinh 22 1.2.8 Tác động hệ sinh sản phát triển 23 1.2.9 Tác động lên vật chất di truyền 24 1.2.10 Tác động hệ miễn dịch .24 1.2.11 Tác động gây ung thư .25 1.2.12 Tác động máu quan tạo máu 26 1.3 Biến đổi nồng độ dioxin mô thể người động vật 26 1.3.1 Sự tập trung dioxin mô 26 1.3.2 Biến đổi nồng độ dioxin máu 27 1.4 Các phương pháp phân tích phát Dioxin 29 1.4.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GSMS – Gas Chromatography MassSpectrometry) 29 1.4.2 Phương pháp ELISA .29 1.4.3 Phương pháp CALUX (Chemical Activated Luciferase gene eXpression) .30 1.5 Tình hình nghiên cứu dioxin 32 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước dioxin 32 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước dioxin .38 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Vật liệu nghiên cứu 43 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 43 2.1.2 Hóa chất vật tư tiêu hao 43 2.1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu .43 2.2 Phương pháp nghiên cứu 44 2.2.1 Phương pháp chọn mẫu nghiên cứu 44 2.2.2 Các tiêu chung đối tượng nghiên cứu 44 2.2.3 Giải đông Nuôi cấy tăng sinh tế bào 45 2.2.4 Bảo quản tế bào 45 2.2.5.Xét nghiệm dioxin mẫu máu kỹ thuật DR CALUX 45 2.2.6 Xác định hàm lượng dioxin hệ thống GC-MS 48 2.3 Đạo đức nghiên cứu 50 2.4 Xử lý số liệu .50 2.5 Địa điểm nghiên cứu 50 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Kết nuôi cấy tăng sinh ứng dụng dòng tế bào DR xét nghiệm nồng độ dioxin mẫu máu người bị phơi nhiễm dioxin 51 3.1.1 Kết nuôi cấy tăng sinh tế bào DR 51 3.1.2 Kết nồng độ dioxin máu mẫu máu người bị phơi nhiễm dioxin 52 3.2 Kết mối liên quan nồng độ dioxin mẫu máu với người bị phơi nhiễm dioxin/chất da cam 60 3.2.1 Một số đặc điểm người phơi nhiễm chất da cam/dioxin 60 3.2.2 Kết đánh giá biến động nồng độ dioxin máu người phơi nhiễm chất da cam/dioxin có nồng độ dioxin cao 62 KẾT LUẬN .74 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….76 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ, NGỮ VIẾT TẮT AhR Arnt CCB DDT DR-CALUX DRE EDCs GSMS Hb HpCDF HxCDD HxCDF OCDD OCDF PBBs PCB PCDD PCDF PeCDD PeCDF Ppt TCDD TCDF TEF TEQ USAF WHO 2,4,5-T Aryl hydrocarbon receptor Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator Cựu chiến binh Dichlorodiphenyltrichloroethane Dioxin Response-Chemical Activated Luciferase Gene eXpression Dioxin response element Endocrine disrupting chemicals (các chất gây rối loạn nội tiết) Gas Chromatography Mass Speetrometry (Sắc ký khí khối phổ) Hemoglobin Heptachlorodibenzofuran Hexachlorodibenzo-p-dioxin Hexachlorodibenzofuran Octachlorodibenzodioxin Octachlorodibenzofuran Polybromobiphenyls Polychlorinated biphenyls Polychlorinated dibenzo-p-dioxins Polychlorinated dibenzofurans Pentachlorodibenzo-p-dioxin Pentachlorodibenzofuran Parts per trillion Tetrachlorodibenzo-p-dioxin Tetrachlorodibenzofuran Toxicity Equivalency Factor Toxicity Equivalent Quantity US Air Force World Health Organization 2,4,5-Trichloroacetic acid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Giá trị TEF số đồng phân dioxin 14 Bảng 1.2 Thời gian bán hủy sinh học (năm) dioxin người 17 Bảng 1.3 Bảng so sánh hai phương pháp GC-MS DR CALUX [6] 32 Bảng 2.1 Các chất loại dioxin 49 Bảng 3.1 Biến đổi nồng độ dioxin trung bình máu DR CALUX người có nồng độ dioxin máu cao (n=58) 53 Bảng 3.2 Biến đổi nồng độ dioxin trung bình máu GC-MS người có nồng độ dioxin máu cao 57 Bảng 3.3 Tỷ lệ đóng góp độc tính 2,3,7,8 TCDD độc tính dioxin (n=58) 59 Bảng 3.4 Đặc điểm tuổi giới tính đối tượng nghiên cứu 60 Bảng 3.5 Đặc điểm BMI .61 Bảng 3.6 Tiền sử phơi nhiễm với da cam/dioxin .61 Bảng 3.7 Mối liên quan biến đổi nồng độ dioxin trung bình máu theo tuổi, giới, thời gian phơi nhiễm số BMI (n=58) .62 Bảng 3.8 Mối liên quan 2,3,7,8 TCDD, 1,2,3,7,8 PeCDD, WHO – TEQ với tuổi, thời gian phơi nhiễm, BMI (n=58) 64 Bảng 3.9 Liên quan nhóm tuổi nồng độ TCDD 69 Bảng 3.10 Liên quan giữa nhóm tuổi nồng độ PeCDD 69 Bảng 3.11 Liên quan nhóm tuổi nồng độ WHO-TEQ 69 Bảng 3.12 Liên quan giữa số năm phơi nhiễm nồng độ TCDD 69 Bảng 3.13 Liên quan số năm phơi nhiễm nồng độ PeCDD 69 Bảng 3.14 Liên quan số năm phơi nhiễm nồng độ WHO-TEQ 70 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học số chất Dioxin giống Dioxin 10 Hình 1.2.Hình ảnh chế tác động dioxin lên tế bào 18 Hình 1.3 Bản đồ phun rải miền Nam Việt Nam, phía vĩ tuyến 17 điểm nóng nhiễm dioxin Việt Nam 39 Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật DR CALUX 46 Hình 2.2 Quy trình phân tích dioxin/PCB phương pháp DR CALUX 47 Hình 2.3 Thực phân tích dioxin kỹ thuật DR CALUX .48 Hình 3.1 Hình ảnh ni cấy tế bào DR .51 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Biểu đồ biến đổi đương lượng độc chất loại dioxin qua năm .60 Biểu đồ 3.2 Biểu đồ tương quan 2,3,7,8-TCDD (TEQ) với số tuổi 64 Biểu đồ 3.3 Mối liên quan1,2,3,7,8-PeCDD (TEQ) với số tuổi 65 Biểu đồ 3.4 Mối liên quanWHO-TEQ với số tuổi 65 Biểu đồ 3.5 Mối liên quan 2,3,7,8-TCDD (TEQ) với số BMI 66 Biểu đồ 3.6 Mối liên quan 1,2,3,7,8-PeCDD (TEQ) với số BMI 66 Biểu đồ 3.7 Mối liên quan tổng đương lượng độc (WHO-TEQ) 67 Biểu đồ 3.8 Mối liên quan 2,3,7,8-TCDD (TEQ) với thời gian phơi nhiễm .67 Biểu đồ 3.9 Mối liên quan 1,2,3,7,8-PeCDD (TEQ)với thời gian phơi nhiễm 68 Biểu đồ 3.10 Mối liên quan (WHO-TEQ) với thời gian phơi nhiễm 68 Biểu đồ 3.11 Biểu đồ đánh giá liên quan nồng độ dioxin (TEQ) số chất với số BMI 70 ĐẶT VẤN ĐỀ Dioxin tên gọi chungđể tập hợp nhiều chất halogen thơm, bao gồm hai nhóm có cấu trúc phân tử khác nhau, nhóm polychlorinated dibenzop-dioxin (PCDD) nhóm polychlorinated dibenzo furan (PCDF) Tùy thuộc vào số lượng vị trí nguyên tử Clo gắn vào vòng benzene mà tạo 75 đồng đẳng nhóm PCDD 135 đồng đẳng nhóm PCDF Tuy nhiên, đồng đẳng chứa nguyên tử Clo vị trí 2,3,7,8 cóđộc tính Dioxin tạo từ nhiều nguồn khác nhau, chúng sản phẩm q trình đốt cháy khơng hồn tồn hợp chất Carbon có chứa Clo, hình thành trình tẩy trắng giấy, sản xuất thuốc trừ sâu, chất diệt cỏ Dioxin cịn bao gồm nhóm chất tương tự dioxin có tên gọi chung polychlorobiphenyl (PCB).PCB sử dụng rộng rãi dung dịch làm lạnh cách điện thiết bị thiết bị chuyển nguồn, thiết bị lưu điện động cơđiện Dioxin PCB cóđiểm nóng chảy cao, bền vững với axit bazơ Những đặc điểm làm chúng tồn bền vững nhiều năm môi trường tự nhiên Tại miền Nam Việt Nam, việc sử dụng chất Da cam chất gây rụng có chứa 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TetraCDD) thời kỳ chiến tranh nguồn gây ô nhiễm dioxin chủ yếu Các sân bay quân đội Hoa Kỳ trước thành phố Biên Hịa, Đà Nẵng Phù Cát điểm nóng ô nhiễm dioxin lượng lớn chất gây rụng rơi vãi trình lưu trữ, trộn, rửa, vận chuyển Theo số liệu Young, 2009: từ năm 1961 đến năm 1972, Quân độiHoa Kỳ rải xuống miền Nam Việt Nam khoảng 79.488.240 lít chất diệt cỏ Trong có 46.276.880 lít (chiếm 62,4%) chất diệt cỏ chứa dioxin (130-144kg dioxin) Dioxin xâm nhập vào thể qua đường da, đường hô hấp, đường ăn uống, dioxin gây ung thư, đột biến gen vàđể lại di chứng hai ba hệ sau Khi dioxin thâm nhập vào tế bào, dioxin gắn với AhR(Aryl hidrocabon receptor), AhR bị thay đổi mặt cấu trúc có khả di chuyển vào nhân Khi vào nhân, AhR gắn với chất dioxin gắn với protein nhân Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) Sau gắn với Arnt, AhR Arnt gắn với đoạn DNA đặc hiệu gọi DRE (Dioxin response element) tạo thành phức hệ AhR/Arnt/DRE DRE nằm đoạn khởi động nhiều gen khác nhau, phức hệ AhR/Arnt/DRE hình thành, nhiều gen khởi động tăng biểu hiệnở gan số quan, làm cho nhiều vật chất tự nhiên tổng hợp thể bị chuyển hóa thành chất nguy hại cho thể dioxin xếp vào hợp chất hóa học nguy hại Trong năm qua, nhiều tác giảđã quan tâm nghiên cứu đến tác hại chất da cam/dioxin để sức khỏe người, nhiều mẫu sinh học (máu, sữa) ngườiđãđược phân tích hàm lượng dioxin nhiên mẫu phân tích phương pháp sắc ký khí khối phổ (GCMS-Gas Choromatography Mass Spectrometry), phương pháp địi hỏi thiết bị phân tích đắt tiền, quy trình phức tạp giá thành cao Dựa chế tác động Dioxin lên tế bào, phương pháp DR-CALUX (Dioxin Response Chemical Activated Luciferase Gene eXpression) kỹ thuật dùng tế bào cảm biến sinh học chuyển gen sinh tổng hợp luciferase đểđịnh lượng Dioxin PCB mẫu vật phẩm đời với nhiều ưu điểm, có thểđánh giá chế Dioxin lên tế bào phân tích sàng lọc nhiều mẫu với thời gian ngắn Xuất phát từ vấn đề tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phát hợp chất Dioxin người phơi nhiễm chất da cam/dioxin kỹ thuật DR-CALUX” với mục tiêu sau: Mục tiêu: - Nuôi cấy tăng sinh vàứng dụng dòng tế bào DR xét nghiệm nồng độ dioxin mẫu máu người bị phơi nhiễm dioxin/chất da cam - Tìm hiểu mối liên quan nồng độ dioxin mẫu máu với người bị phơi nhiễm dioxin/chất da cam Bảng3.9 Liên quan nhóm tuổi nồng độ TCDD Nhóm tuổi Tần suất Median p (TEQ) 50 39 11,55 p>0,05 Bảng 3.10 Liên quan giữa nhóm tuổi nồng độ PeCDD Nhóm tuổi Tần suất Median p (TEQ) 50 39 11,55 P>0,05 Bảng 3.11 Liên quan nhóm tuổi nồng độ WHO-TEQ Nhóm tuổi Tần suất Median p (TEQ) 50 39 70,51 P>0,05 Bảng 3.12 Liên quan giữa số năm phơi nhiễm nồng độ TCDD Số năm Tần suất Median p (TEQ) 50 20 20,15 P>0,05 Bảng 3.13 Liên quan số năm phơi nhiễm nồng độ PeCDD 69 Số năm Tần suất Median p (TEQ) 50 20 11,80 P>0,05 Bảng 3.14 Liên quan số năm phơi nhiễm nồng độ WHO-TEQ Số năm Tần suất Median p (TEQ) 50 20 59,32 P>0,05 Các kết trình bày Bảng 3.8 đến 3.13 chưa thấy mối liên quan nồng độ TCDD, PeCDD TEQ với nhóm tuổi thời gian phơi nhiễm 100 200 300 có ý nghĩa thống kê tcdd2 pecdd2 teq2 Biểu đồ 3.11 Biểu đồ đánh giá liên quan nồng độ dioxin (TEQ) số chất với số BMI 70 1: BMI