Nghiên cứu hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa (xanthium strumarium l.) .pdf

Nghiên cứu hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa (xanthium strumarium l.) .pdf

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Văn Thỉnh

1.1.1 Họ cúc (asteraceae) 3

1.1.2 Chi xanthium 3

1.2 GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY KÉ ĐẦU NGỰA 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Đặc điểm sinh thái 4

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CHI XANTHIUM 5

1.3.1 Một số nghiên cứu hoá thực vật quả Ké đầu ngựa 5

1.3.2 Sử dụng trong y học dân gian 8

1.3.3 Một số bài thuốc dân gian từ quả Ké đầu ngựa 9

1.4 CÁC DẠNG AXIT BÉO HAY GẶP TRONG TỰ NHIÊN 10

CHƯƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp sử lý mẫu 18

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 20

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 20

2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20

2.4.2.2 3-O- -D-glucopyranosyl--Sitosterol (KĐN.E33) 32

CHƯƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN TẮC CHUNG 35

3.2 PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA

(XANTHIUM STRUMARIUM L.) 36

3.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L) 36

3.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ

3.4.2.1 β-sitosterol hay 24R-stigmast-5 en-3-õ-ol (KĐN.H8) 41

3.4.2.2 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33) 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 49

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Thị Hồng Thái

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Phạm Văn Thỉnh người thầy đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồmg Minh, phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá học - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công việc nghiên cứu của mình

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn Phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hóa học, Phòng Hoá - Sinh Biển Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, đã giúp tôi thực hiện các phép phân tích phổ và phân tích thành phần axit béo trong mẫu nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn hoá hữu cơ, các thầy, cô trong khoa Hoá học, các phòng ban của trường ĐHSP Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên , ngày 20 tháng 9 năm 2007 Tác giả

Nguyễn Thị Hồng Thái

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

GC - MS : Gas Chromatography - Mass Spectroscopy EI - MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

ESI - MS : Electron sprayionisation - Mass Spectroscopy FAB - MS : Fast Atom Bombardment Mass spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance 13

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation NOESY : Nuclear Overhauser and Exchange Spetroscopy

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN

Hình Và sơ đồ

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học quả

Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của quả Ké đầu ngựa

Bảng 3.1 Các cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1% trong quả Ké đầu ngựa

MỞ ĐẦU

Nước ta có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú và đa dạng Dân tộc Việt Nam có truyền thống về sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh Những năm gần đây xu hướng tìm kiếm một số hoạt chất trong các loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh ngày một tăng, thu hút các nhà khoa học nghiên cứu

Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian [1], [2], [3], [4], [5]

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ cho con người Ngày nay những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khoẻ con người Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các

chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm được dùng chữa bệnh hiện nay, hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên [7]

Trong công tác phòng chữa bệnh ở nước ta, Đảng và Nhà nước luôn chủ trương và khuyến khích Đông Tây y kết hợp để chăm sóc sức khoẻ cho nhân dân, kế thừa và phát huy vốn quý của nền Y học cổ truyền trong đó có nhiều cây thuốc quý

Trong thế giới thực vật muôn màu, nhiều loài cây cỏ đã được sử dụng như những dược liệu quý Trong số đó có cây Ké đầu ngựa đặc biệt là bộ phận quả của cây Loài cây này mọc rất phổ biến ở Việt Nam, thường mọc ở vùng đất hoang, bờ ruộng, bờ đường, xen kẽ với các loại cỏ khác

Dân gian thường dùng Ké đầu ngựa chữa phong hàn, đau đầu, chân tay đau co rút, phong tê thấp, đau khớp, mũi chảy nước hôi, mày đay, lở ngứa, chữa đau răng, đau họng, biếu cổ, hủi, eczema [4]

Để góp phần nghiên cứu làm rõ thành phần, tính chất của các chất hoá học trong thực vật làm thuốc chữa bệnh chúng tôi chọn hướng nghiên cứu hoá học các hợp chất thiên nhiên

Tên đề tài là: “Nghiên cứu hoá học các hợp chất có hoạt tính sinh

học trong quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.)”, nhằm làm rõ các

cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Ké đầu ngựa như một nguồn dược liệu quý, dùng làm thuốc chữa bệnh

Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn nêu trên, nhiệm vụ của đề tài này là tiến hành phân lập các chất hoá học có trong quả Ké đầu ngựa, nhận dạng cấu tạo hoá học của một số chất tách được bằng các phương pháp hoá lý hiện đại

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT VỀ HỌ CÚC (ASTERACEAE) VÀ CHI XANTHIUM

1.1.1 Họ cúc (Asteraceae)

Họ cúc (Asteraceae) là họ lớn nhất trong thực vật có hoa, gồm 2 phân

họ Ở Việt Nam có khoảng 125 chi và trên 350 loài [1], chủ yếu là cỏ dại, một số được trồng làm thực vật cảnh (các loại Cúc), rau ăn (Ngải cứu, Cải cúc, Rau diếp), gia vị (Cúc tần), phẩm nhuộm (Hồng hoa)

Họ cúc gồm 2 phân họ là:

+ Phân họ hoa ống (Rubuliflorae): Trên cụm hoa chỉ có hoa hình ống,

hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh đầu Cây không có nhựa mủ,

+ Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguliflorae, Cichorioideae) : Tất cả các hoa

trong cụm hoa đầu là hoa lưỡi nhỏ, không có hoa ống Cây có nhựa mủ

Họ cúc là họ có số loài làm thuốc lớn nhất trong thực vật giới, có

khoảng 51 loài thường làm thuốc, trong đó có 18 loài dùng trong công nghiệp dược là: Atiso, Bạch truật, Cỏ nhọ nồi, Cỏ ngọt, Cúc hoa, Cúc tần, Hồng hoa, Hy thiêm, Ké đầu ngựa, Khoản đông hoa, Mần tưới, Mộc hương, Ngải cứu, Ngưu bàng, Sài đất, Thương truật, Thanh cao hoa vàng, Tử uyển

1.1.2 Chi xanthium

Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.): Thân xù xì, lá chia 3-5 thuỳ

hay hình bầu dục có khía răng Quả Ké đầu ngựa có răng móc, cây thường mọc ở ven đường bãi hoang ven sông, suối Quả dùng làm thuốc gọi là Thương nhĩ tử, chữa phong tê thấp, mụn nhọt Theo Đỗ Tất Lợi quả Ké đầu ngựa là thành phần thuốc nam thiết yếu trong một số bài thuốc Y học cổ truyền Việt Nam Trên thế giới có 25 loài còn ởViệt Nam có 2 loài đó là:

Xanthium Strumarium L là loài rất phổ biến, mọc hoang ở mọi nơi trong

nước ta, được dùng làm nguyên liệu cho Đông y và Xanthium Inaequilaterum

DC., loài này phân bố từ miền Trung trở vào, cũng được làm thuốc như loài

trên [6]

1.2 GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY KÉ ĐẦU NGỰA

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây Ké đầu ngựa còn gọi là thương nhĩ (tên Trung Quốc), phắt ma

(Thổ) Tên khoa học là Xanthium strumarium L thuộc họ cúc (Asteraceae)

Cây Ké đầu ngựa mọc hoang ở khắp nơi trong nước ta, từ vùng núi cao tới vùng trung du, đồng bằng Trên thế giới loài này cũng được phân bố ở hầu hết các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Mọc nhiều ở các nước

Châu Á như Trung Quốc, Malaixia, Ấn độ Ngoài ra, Xanthium strumarium còn được biết đến ở Brazin, Mỹ Ở Việt Nam Xanthium strumarium là một

loài rất phổ biến

1.2.2 Đặc điểm sinh thái

Cây Ké đầu ngựa là một cây nhỏ, cao độ 2m, thân có khía rãnh, lá mọc so le, phiến lá hơi 3 cạnh, mép có răng cưa có chỗ khía hơi sâu thành 3-5 thuỳ, có lông ngắn cứng Hoa tự hình đầu có thứ lưỡng tính ở phía trên, có thứ chỉ gồm có 2 hoa cái nằm trong hai lá bắc dầy và có gai Quả giả hình thoi, có móc, có thể móc vào lông động vật, cắt đôi ở trong có hai quả thực [4]

Cây Ké đầu ngựa có thể sống trên nhiều loại đất khác nhau, cây bắt đầu mọc vào mùa Xuân sinh trưởng và phát triển nhanh trong mùa mưa ẩm, sang Hạ cây ra hoa, kết trái, cuối Hạ sang Thu quả chín Cây ưa ánh sáng và có thể chịu hạn, thường mọc thành đám ở ven đường, vùng đồi, bãi hoang, bờ sông Mùa Xuân, nhân dân thường trồng cây Ké đầu ngựa bằng cách đào lỗ nhỏ cho vào 3-4 hạt mỗi hố cách nhau chừng 50-60cm, phủ ít đất lên và tưới ẩm, độ 10 ngày sau cây mọc [5]

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CHI XANTHIUM

1.3.1 Một số nghiên cứu hoá thực vật quả Ké đầu ngựa

Trong quả Ké đầu ngựa có nhiều iốt và vitamin C, ngoài hai chất này trong quả Ké đầu ngựa còn có các glucoza, -sitosterol, -(D,L)-glucozit

có tác dụng chống viêm [11]

Trong quả Ké đầu ngựa ở Liên Xô có chứa ancaloit nhưng theo sự phân tích của Viện Y học Bắc Kinh (1958) thì trong quả Ké đầu ngựa có chất saponin (glucozit), không có ancaloit [6]

Theo Khafagy trong quả Ké đầu ngựa có một số secqiutecpen - lacton chưa no có khung xanthonolit: xanthinin (nhiệt độ nóng chảy 123- 1240

), xanthanol và izoxanthanol [5]

Trong quả Ké đầu ngựa có 30% dầu béo Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy có hoạt tính giảm đường huyết của chuột bình thường, ức chế thần kinh trung ương, kháng khuẩn Gr (-), kháng nấm [11]

Theo Wehmer trong quả Ké đầu ngựa có 1,27% một glucozit (xanthostrumarin) tương ứng với chất datixin, chưa rõ hoạt tính, 3.3% nhựa và vitamin C

Quả Ké đầu ngựa có chứa:

+ Carboxy atractylozit ở dạng muối có tác dụng hạ đường huyết rất mạnh, có độc tính

+ Xanthetin và Xanthamin là những chất có tác dụng kháng khuẩn [4]

Theo nghiên cứu của Ying-Tsun Ma, Mu-Chi Huang và các cộng sự, họ đã tìm ra hai chất mới thiazinediones cùng với năm chất đã biết được tách

ra từ quả của Xanthium strumarium L

Cấu trúc của 2 chất mới này đã được xác định là:

* 7-Hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4] 3,5-dione-11-0--D-glucopyranoside (chất I)

* 2-Hydroxy-7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4] thiazine-5,5-dione-11-0-- D-glucopyranoside (chất II)

Năm chất đã biết được xác định là: * Xanthiazone (chất III)

* chlorogenic acid (chất IV) * Ferulic acid (chất V) * Fomononetin (chất VI) * Ononin (chất VII)

Trên thế giới chi Xanthium có 25 loài [10] Các loài Xanthium được sử

dụng như một loại thuốc thảo mộc cổ truyền trong một thời gian dài ở các

nước phương Đông Xanthium strumarium L là loài chính được tìm thấy

nhiều ở Trung Quốc, quả của nó là Fructus Xanthi (Tên Trung Quốc là Er-Zi), người dân Trung Quốc sử dụng quả này để chữa viêm xoang, đau đầu

Cang-do cảm lạnh, viêm khớp [9] Từ Xanthium strumarium L người ta đã phân lập

và nhận dạng được một số chất thuộc các nhóm sau: * Diterpenoit

* Secquiterpen lacton * Caffeoylquinic axit * Thiazinedion

Các chất trên đã được I R Chu công bố năm 1965

Các hợp chất dầu trong hạt của Xanthium strumarium L đã được V K

Kapoor công bố năm 1976

Chất I: R1= - D-Glu; R2=H Chất II: R1= - D-Glu; R2=OH Chất III: R1=H; R2=H

Hình 1.1 Công thức cấu tạo tổng quát của các chất I, II, III

Họ tách được các chất từ Xanthium strumarium L., bằng cách phân chia

chúng trên cột sắc ký silicagel kết hợp với cột sephadex LH-20 trong các hệ dung môi khác nhau, kết quả thu được hai chất mới: 7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol[1,4]thiazine-3,5-dione-11-0--D-glucopyranoside (chất I) và 2-hydroxy-7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4] thiazine-5,5-dione-11-0--D-glucopyranoside (chất II), cùng với năm chất đã biết là: Xanthiazone (chất III), chlorogenic acid (chất IV), ferulic acid (chất V) từ phần chiết trong n-butanol, fomononetin (chất VI) và ononin (chất VII) từ phần chiết trong ethyl acetate

Hợp chất I thu được là chất bột mầu trắng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy là: 180-1820C, phổ tử ngoại-khả kiến có ởmax (MeOH) là: 280

nm; phổ khối ion hoá bụi electron (ESI) cho tín hiệu m/z = 402 [M+H]+

, công

thức hoá học là C17H23N2SO8, được xác định bằng phổ khối phân giải cao Phổ hồng ngoại của chất I chỉ ra sự hiện diện của nhóm hydroxyl (3369cm-1

) và hai nhóm cacbonyl (1680 cm-1 ,1655cm-1)

Từ các dữ liệu về phổ IR, UV, nhất là phổ NMR và phổ MS, Ting Han đã đề xuất cấu trúc hợp chất I là glucozit Liên kết glucozit với gennin được thực hiện ở nhóm OH tại C-11 Đường tham gia tạo liên kết là đường glucoza và liên kết glucozit là õ-glucozit

Hình 1.2: Cấu trúc của chất (I)

CH2 OH

8 9 1011

12 13

1.3.2 Sử dụng trong y học dân gian

Quả Ké đầu ngựa (Thương nhĩ tử) có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính ấm, có tác dụng tiêu độc, sát trùng, tán phong, trừ thấp Lương y Việt Cúc ghi nhận về Ké đầu ngựa như sau: Thương nhĩ thảo ấm, giải phong nhiệt thấp tê, bổ não tuỷ, chữa nhức đầu, viêm mũi dị ứng bạch đới, lâm lậu [4]

Hiện nay Ké đầu ngựa là một vị thuốc thường dùng trong nhân dân Việt Nam, được dùng chủ trị các bệnh ngoài da, bệnh mũi xoang, bệnh xương khớp

Trong bài thuốc Y học cổ truyền của Trung Quốc quả Ké đầu ngựa được dùng để chữa viêm xoang, đau đầu do cảm lạnh, viêm khớp, ung thư phát bối (sau lưng), đau răng, viêm mũi [12]

Nhân dân Liên xô cũ dùng Ké đầu ngựa để chữa bướu cổ, các bệnh mụn nhọt, nấm tóc, hắc lào, lỵ và đau răng

Nhân dân ta và Trung Quốc thường chế Ké đầu ngựa thành cao thương nhĩ để chuyên chữa lỏ loét, mụn nhọt

Ở Ấn Độ, người ta dùng Ké đầu ngựa trị sốt rét, làm toát mồ hôi, trị bệnh tràng nhạc, ung thư, quả làm dịu kích thích, trị bệnh đậu mùa

Một số loài của chi Xanthium có nguồn gốc từ Bắc Mỹ được dùng trong y

học

1.3.3 Một số bài thuốc dân gian từ quả Ké đầu ngựa

Chữa phong tê thấp, tay chân co rút: Quả Ké đầu ngựa 12g giã nát sắc uống [6]

Chữa đau răng: Sắc nước quả Ké đầu ngựa, Ngậm lâu lại nhổ Ngậm nhiều lần [6]

Chữa mũi chảy nước trong, đặc: Quả Ké đầu ngựa sao vàng tán bột Ngày uống 4-8g [6]

Chữa thuỷ thũng, bí tiểu tiện (lợi tiểu): Thương nhĩ tử, thiêu tồn tính; đình lịch Hai vị bằng nhau, tán nhỏ Uống với nước mỗi lần 8g, ngày hai lần [2]

Chữa biếu cổ: Ngày uống 4-5g quả Ké đầu ngựa dưới dạng thuốc sắc (đun sôi, giữ sôi 15 phút ) (Đỗ tất lợi )

Chữa tổ đỉa: Quả Ké đầu ngựa 50g, hạ khô thảo 50g, vỏ núc nác 30g, sinh địa 20g, hạt dành dành 15g, được tán bột làm viên Ngày uống 20-25g

Chữa các bệnh phong, dị ứng gan, mẩn ngứa, mày đay: Ké đầu ngựa 15g, kinh giới bông 10g, muồng trâu 15g, cỏ mần trầu 15g, cam thảo đất 10g, bạc hà 10g, cỏ hôI 10g, bèo tai tượng 10g, chổi đực 10g, nghề bà 10g Các

vị hiệp chung 1 thang, đổ 1 bát nước, sắc còn 8 phần, uống ngày 1 thang (bài thuốc ở An Giang)

Các bệnh ngoài da do dị ứng, chàm (BS Nguyễn Xuân Sơn, khoa da liễu Bệnh viện Việt- Tiệp): Ké đầu ngựa 9kg, thổ phục linh 9kg, cồn benzoic 10% 300ml Nước vừa đủ 23lit Nếu không dùng đường thì nấu nước, cô cao, tán bột làm viên Đã điều trị 124 trường hợp cho kêt quả tốt Chữa ung thư não: Thương nhĩ tử 15g, thất diệp nhất chi hoa (cây 7 lá 1 hoa) 16g, viễn chi 10g, xương bồ 6g, sắc uống ngày 1 thang [6]

1.4 CÁC DẠNG AXÍT BÉO HAY GẶP TRONG TỰ NHIÊN [7]

Lipit là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào các cơ thể sống, trong động vật, thực vật và vi sinh vật Chúng có thành phần hoá học và cấu tạo khác nhau nhưng cùng có tính chất chung là không hoà tan trong nước mà hoà tan tốt vào các dung môi hữu cơ như: ete, clorofom, benzen, ete dầu hoả…

Cấu trúc đa dạng của lipit được bắt nguồn từ các axit béo khác nhau tham gia vào trong thành phần của nó Ngày nay, đã phát hiện được hơn 500 axit béo khác nhau ở mức độ và đặc điểm phân nhánh của mạch hydrocacbon, số lượng và vị trí các nối đôi trong mạch, vị trí và số lượng các nhóm chức, độ dài của mạch hydrocacbon

Các axít béo có mặt trong thành phần lipit thực vật, động vật, thường

có từ 16-20 nguyên tử cacbon trong phân tử Theo Ackman trong sinh vật biển số lượng nguyên tử các bon của axít béo còn nhiều hơn có khi đến 30 nguyên tử cacbon

Hầu hết các axit béo no có mặt trong tự nhiên có cấu tạo mạch thẳng với số nguyên tử cacbon chẵn Các axit với số nguyên tử cacbon từ C2-C30được biết đến, nhưng phổ biến và quan trọng nhất là C12-C22 Chúng có thể được gọi tên theo tên thường và tên khoa học hoặc gọi theo kí hiệu số như

16:0 (nghĩa là axit béo có 16 cacbon và không có nối đôi) Những axit béo đơn giản trong tự nhiên là các axit béo no, với mạch hydrocacbon dài, không phân nhánh có công thức chung như sau:

CH3(CH2)nCOOH

Trước đây người ta cho rằng số n bao giờ cũng là số chẵn, hiện nay nhờ các phương pháp phân tích hiện đại, người ta đã phát hiện trong dầu mỡ tự nhiên có cả các axit béo no có số nguyên tử cacbon n lẻ Các axit này chiếm khoảng 1% so với tổng số các axit béo

Hơn một trăm axit béo một nối đôi được tìm thấy trong tự nhiên, nhưng hầu hết chúng là những hợp chất hiếm Thực tế tất cả các axit béo một nối đôi đều có công thức chung là:

CH3 (CH2)mCH=CH(CH2)nCOOH

Đa số các axit béo có một nối đôi tham gia vào thành phần lipit tồn tại ở

dạng cấu hình –cis:

CH3(CH2)m (CH2)nCOOH H C=C H

Các axit béo tự nhiên có nhiều hơn một liên kết đôi có thể chia thành một số nhóm Nhóm quan trong nhất cả về mặt cấu trúc và mức độ tồn tại, là

nhóm có vị trí nối đôi được phân cách đều đặn bởi nhóm metylen

(methylene-interrupted) và nối đôi cấu hình dạng cis (Z), đại diện cho nhóm này là 2 axit

linoleic và axit archidonic

Nhóm khác là các axit có tất cả một hoặc một phần không no trong một

hệ liên kết đôi liên hợp dạng cis (Z) hoặc trans (E)

Nhóm thứ ba thường xuyên miêu tả là liên kết đôi C=C không bị

phân cách đều đặn bởi nhóm metylen (non methylene-interrupted diens

NMID), axit 5,9,12-18:3 có trong dầu hạt cây tùng lớn là ví dụ:

Các axit béo không no đa nối đôi phân cách đều đặn bởi nhóm allyl (-CH=CHCH2)- đều có chung công thức là:

CH3(CH2)m(CH=CHCH2)n(CH2)COOH

Các axit béo đa nối đôi liên hợp (conjugated polyenenoic fatty acids)

là các axit béo không no chứa nhiều liên kết đôi liên hợp tồn tại trong thành phần

Các axit béo đa nối đôi liên hợp không có dấu hiệu tồn tại trong lipit bất kì một loại động vật nào và được thừa nhận có vai trò đáng kể chỉ trong một số dầu hạt thực vật, trong đó có dầu trẩu là một loại dầu thương mại quan trọng Phần lớn các axit béo đa nối đôi liên hợp trong tự nhiên thường tồn tại dưới 7 dạng đồng phân của axit octadecatrienoic Trước đây đã có thời gian người ta cho rằng chỉ có 1dạng của axit này tồn tại, nhưng gần đây nhờ phổ 13

C- NMR phân giải cao và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã chỉ ra rằng

các axit béo đa nối đôi liên hợp khác nhau bởi chính các dạng đồng phân cis (Z) hoặc trans (E) của chúng Điều đó được chỉ ra trên phổ tử ngoại UV,

chúng có nhiệt độ nóng chảy cao và thường tồn tại dưới dạng không no cấu

hình trans (E) Tính đặc biệt của dầu hạt sồi (Sapium sebierum) là trong một

vài dạng glyxerit của nó có chứa 4 nhóm RCO (axyl), bao gồm 2 axit C18thông thường, một axit C8 hydroxy allenic và 1 axit deca-2E,4Z-dienoic Dạng glyxerit trong dầu hạt sồi có công thức như sau:

CH2OCO(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH3

CHOCO(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3

CH2OCO(CH2)3CH=C=CHCH2OCOCH=CHCH=CH(CH2)4CH3

Mặc dù các axit béo mạch nhánh có mặt nhiều trong tự nhiên, nhưng chúng thường tồn tại như những thành phần phụ và hiếm khi chúng có số lượng đáng kể trong các axit béo tổng Hầu hết kiểu nhánh chỉ là một nhóm metyl Các axit với một nhóm metyl ở các vị trí hai hoặc ba [n-2 (izo axit), n-3 (anteiso axit)], hoặc có thể ở vị trí khác Các axit có nhiều hơn một nhóm metyl thường gắn với các nguyên tử cacbon chẵn Đây là sự giải thích về mặt sinh tổng hợp cho hầu hết các cấu trúc chung của các axit béo mạch nhánh Các axit béo có mạch vòng là các axit béo tồn tại trong tự nhiên mà trong phân tử có chứa cacbon mạch vòng gồm 3 nguyên tử cacbon (cyclo propan), chúng thường có mặt trong dầu hạt họ thông, tùng Các axit béo cyclopropanyl cũng thường xuất hiện nhiều trong phốtpholipit màng vi khuẩn, chúng cũng thường đi kèm axit cyclopropenyl có trong thành phần axit béo của dầu các hạt thực vật

Trong tự nhiên các axit béo với nhóm chức khác nhóm cacboxyl và một hoặc nhiều dạng khác của axit béo không no thì thường gặp, tuy nhiên phổ biến hơn cả là dạng hydroxy axit và eproxy axit

Các epoxy axit và furanoic axit là các axit béo có chứa vòng epoxy hoặc vòng furan trong phân tử, chúng có mặt trong thành phần một số dầu hạt thực vật, thường tồn tại ở dạng triaxylglyxerol và trong cutin mà ở đó chúng tồn tại dưới dạng polyme của các hydroxy axit

Bảng 1.1 Các dạng axít béo no thường gặp trong tự nhiên [7]

Số nguyên

tử C

Tên hệ thống khoa học

Tên thông dụng

Điểm chảy Mpt (0C)

Phân bố trong tự nhiên

nhiều trong thực vật và một vài triglycerit thực vật Thường they trong dạ cỏ động vật dưới dạng muối

vật

béo của động vật nhai lại

động vật thực vật

quan trọng trong thành phần dầu 1 vài hạt thực vật, sinh vật biển

đối tượng trong thiên nhiên

gặp trong tự nhiên và là một trong những axít béo phổ biến nhất của quá trình sinh tổng hợp chất béo trong thực vật, động vật biển

dầu béo thiên nhiên

vai trò rất quan trọng ở một vài

đối tượng như sinh vật biển

triglycerit của dầu một số hạt thực vật

dầu hạt các loài thực vật biển

thực vật và nhựa sáp của côn trùng, sâu bọ

vài loài sáp thực vật, sinh vật biển

Bảng 1.2: Các axít béo không no thường gặp trong tự nhiên [7]

Số ng tử C

Tên hệ thống khoa học

Tên thông dụng

Điểm chảy

-Có trong lá cây thực vật, đặc biệt là cấu phần chính của phosphatidylglycerol

-Có trong thực vật, khuẩn que

-Có trong dong tảo, thực vật bậc cao, vi khuẩn

cis-9- hexadecenoic Palmitoleic -Phổ biến trong động vật, thực vật, tổ chức vi sinh vật, là cấu phần chủ yếu của một vài loài hạt thực vật

-Phổ biến hầu hết trong các động vật, thực vật và tổ chức vi sinh vật

-Có trong E-coli và các vi khuẩn khác

16

18

Axít béo 2 nối đôi

cis,cis-7,10- hexadecadienoic cis,cis-9,12- hexadecadienoic cis,cis-6-9- octadecenoic cis,cis-9-12- octadecenoic

Linoleic

-5,0

Phổ biến trong thực vật, rong, tảo…

-Cấu tử thứ yếu

Cấu phần thứ yếu ở động vật sống

-Cấu phần chủ yếu trong lipit thực vật, ở động vật và con người, nó chỉ bổ xung vào qua con đường thức ăn rau quả hoặc dầu mỡ thực vật và sinh vật biển

Axít béo 3 nối đôi

all-cis-7,10,13- hexadecatrienoic all-cis-6,9,12- octadecatrienoic all-cis-9,12,15- hexadecatrionic

Axít béo 3 nối đôi

(nối đôi liên hợp)

11,trans-13-octadecatrienoic

Cis-9,trans-Axít béo 4 nối đôi

all-cis-4,7,10,13- hexadecatrionic all-cis-5,8,11,14- eicosatetraenoic

-Là cấu phần thứ yếu trong động vật và một vài loài rong biển.Là cấu thành rất quan trọng của một vài loài thực vật

-Phổ biến ở thực vật bậc cao và rong tảo biển, là cấu phần đặc biệt của galatosyl diglycerit

phospholipit

Axit béo 5 nối đôi

22

22

All-cis-7,10,13,16,19- Docosapentaenoic

Axít béo 6 nối đôi

All-cis-docosahexanenoic

4,7,10,13,16,19-clupanodonic

DHA

Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển

Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển

CHƯƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu là quả của cây Ké đầu ngựa được thu hái vào cuối tháng 8 đầu tháng 9 năm 2006 tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên

Quả Ké đầu ngựa còn được gọi là Thương nhĩ tử (Trung Quốc) Có tên

khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae [5]

Mẫu quả tươi thu hái về (16kg), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 1100

C khoảng 10 phút để diệt men Sau đó sấy khô ở 50-600

C cho tới khi độ ẩm nhỏ hơn 10% thu được 8.8kg mẫu khô Mẫu khô được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng etanol 900

Hình 2.1 Cây Ké đầu ngựa

Hình 2.2 Quả Ké đầu ngựa

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của quả Ké đầu ngựa cần phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp :

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột Silicagel thường

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v Sau đó sẽ tiến hành ghi các các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR) với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất

2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất

Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA)

Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 và đế nhựa (polyme) DC-Plastikfolien Kieselgel 60F254 Art.5735 tráng sẵn, độ dày 0,2mm cũng đã được sử dụng để xác định số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

Các hệ dung môi triển khai SKLM

2 n-Hexan-etylaxetat (5:1) Hệ B

Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại

Vanilin 1% trong hỗn hợp metanol + H2SO4 đặc và sấy trên 1000C hoặc đưa vào buồng I2 để xác định thành phần cấu tử

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B, C)x100

Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,040 đến 0,063mm hoặc 0,1 đến 0,16mm)

Các dụng cụ khác được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là: - Cân phân tích

- Máy cất quay chân không - Bộ chiết Shoxlet

- Bình nón, bình định mức, bình cầu, buret, picromet, pipet - Cột thủy tinh các cỡ có khóa để làm cột sắc ký

Hoá chất:

 Dung dịch axit sunfuric (H2SO4)

 Dung dịch axit chlohiđric (HCl)

 Dung dịch axit axetic (CH3COOH)

 Tinh thể muối natrisunfat khan (Na2SO4)

 Dung dịch Sodium metanolat, axetyl chlorit

 Hỗn hợp dung môi ete etylic - cồn 950

(2:1 theo thể tích)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boátus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200

- Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - TTKHTN & CNQG) dạng viên nén KBr

- Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV, và sử dụng ngân hàng dữ liệu

Chương trình chạy nhiệt độ: 850

(0/min.) -1500(10/min) -2000(10/min) 2300(5/min)

-2.3 CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM

L.)

2.3.1 Các dịch chiết

Quả Ké đầu ngựa đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao lỏng, sau đó lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat và metanol

Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500 C Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng Như vậy từ quả Ké đầu ngựa thu nhận được 3 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các ký hiệu tương ứng là: KĐN.H, KĐN.E và KĐN.M (xem trong sơ đồ 2.1)

Kí hiệu:

- KĐN.H sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng n-Hexan - KĐN.E sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng EtOAc - KĐN.M sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng MeOH

Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu

Mẫu khô nghiền nhỏ

1.Etanol 2.Cặn + H2O

4 Metanol (KĐN.M) 1.Cô khô

2 Metanol

Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn

của quả Ké đầu ngựa

(Xanthium strumarium L.)

Bộ phận

Khối lượng mẫu (g)

Bước1: Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ

Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng bằng các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có từ nồng độ 128ỡg/ml; 32ỡg/ml; 8ỡg/ml; 2ỡg/ml; 0,5ỡg/ml đối với chất sạch, 256ỡg/ml; 64ỡg/ml; 16ỡg/ml; 4ỡg/ml; 1ỡg/ml đối với dịch chiết

Bước 2: Thử hoạt tính:

Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 khi tiến hành thử

Lấy 10ỡl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng thêm 200ỡl dung dịch vi sinh vật hoặc nấm, ủ 370

sau 24 giờ, đọc độ đục tế bào trên máy Tecan, xử lý số liệu và tính toán giá trị IC50

Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả Ké đầu ngựa

Tên chủng vi sinh vật kiểm định

Ec Escherichia

coli IC50g/ml

Pa: Pseudomonas

aeruginosa IC50g/ml

Bs: Bacillus

subtilis IC50g/ml

Sa: Staphylococcus

aureus IC50g/ml

Ca: Candida albicans

Ống 1: cho 1 – 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là dương tính

Ống 2: cho 1 – 2 giọt thuốc thử Dragendorff: nếu thấy xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính

Ống 3 : cho 3 – 5 giọt thuốc thử Mayer: nếu xuất hiện kết tủa trắng là dương tính