Nghiên cứu thành phần hoá học có trong cây phèn đen (phyllanthus reticulatus poir euphorbiaceae) .pdf

Nghiên cứu thành phần hoá học có trong cây phèn đen (phyllanthus reticulatus poir euphorbiaceae) .pdf

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

PHAN VĂN DÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÓ TRONG CÂY PHÈN ĐEN

(PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR

EUPHORBIACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC

THÁI NGUYÊN - 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

PHAN VĂN DÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÓ TRONG CÂY PHÈN ĐEN

(PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR EUPHORBIACEAE)

Chuyên ngành : Hoá hữu cơ Mã số : 60.44.27

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS.NGƯT Phạm Văn Thỉnh - người Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồng Minh, ThS Vũ Anh Tuấn đã giúp đỡ tôi nhiều kiến thức bổ ích và những kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học

Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo khoa Hóa, khoa Sau Đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, phòng hoạt chất sinh học - Viện Hóa học, Hội đồng giáo dục trường THPT Bắc Đông Quan - Thái Bình, Bố - Mẹ tôi cùng những người thân trong gia đình, anh em bè bạn… đã hết lòng tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2009

Tác giả

Phan Văn Dân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

PHAN VĂN DÂN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các bảng, hình và sơ đồ

Mục lục

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Mô tả thực vật 3

1.2 Các hợp chất hoá học có hoạt tính sinh học trong chi Phyllanthus 4

1.2.1 Một số đại diện của khung axit 4

1.2.2 Một số đại diện của nhóm tecpenoit 6

1.2.3 Một số đại diện của lignan 9

1.2.4 Một số đại diện của khung flavonoit 12

1.2.5 Một số hợp chất phenolic khác 14

1.2.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit 17

1.3 Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir 18

1.4 Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus 19

1.4.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus 19

1.4.2 Một số tác dụng dược lý của chi Phyllanthus 21

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 22

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 22

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 22

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 22

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 23

2.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 23

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất 23

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 24

2.3 Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) 25

2.4.2 Dịch chiết ethylacetate (EP) 31

CHƯƠNG III THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

DANH MỤC CÁC BẢNG,HÌNH & SƠ ĐỒ

Trang Bảng 2.1: Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn của cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus P., Euphorbiaceae……… … ……….26 Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen Phyllanthus

reticulatus Poir, Euphorbiaceae ……… ………28 Bảng 3.1: Độ chuyển dịch hóa học 13

C-NMR của một số sterol trong loài

Phyllanthus ……… ……….… 35 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của HP-5………… 38

Bảng 3.3: Bảng so sánh số liệu phổ 1

H và 13C-NMR (500MHz, CDCl3) của acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate và chất thực nghiệm (HP-5) 40

-Hình 1.1: Cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus P., Euphorbiaceae…… 3 Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu 25

MỞ ĐẦU

Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, gió mùa, độ cao không đều, diện tích vùng núi và vùng trung du chiếm đến 70% - với điều kiện môi trường tự nhiên thuận lợi tạo nên một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam - nguồn tài nguyên sinh học quý giá - có trên 12000 loài, trong số đó có tới hơn 3200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong Y học dân gian

Dân số Việt Nam gồm nhiều dân tộc anh em sinh sống, từ xa xưa đã có truyền thống chữa bệnh bằng cây cỏ mà Hải Thượng Lãn Ông gọi chung là Thảo dược Từ nhiều thế hệ, người dân đã sử dụng tri thức bản địa để phòng và chữa bệnh cho bản thân và cộng đồng Ngày nay, mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược đã phát triển mạnh mẽ nhờ những thành tựu mang tính đột phá và hiện đại của khoa học công nghệ nhằm giảm thiểu bệnh tật và làm tăng tuổi thọ của con người Song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc vẫn ngày càng tăng lên, vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp, ngoài ra, việc dùng thuốc Nam hầu như không gây tác dụng phụ

Theo điều tra của Bộ Y tế, trong những năm gần đây, ở Việt Nam số người có mầm bệnh viêm gan chiếm tỷ lệ khá lớn, nó đã trở thành đề tài nghiên cứu cho nhiều ngành khoa học nhằm chăm lo tốt hơn đối với sức khỏe cộng đồng Tham gia vào việc tìm thuốc từ nguồn thực vật, Y học dân gian đã phát hiện khoảng 20 loại cây cỏ có khả năng chữa trị viêm gan, trong đó đáng

chú ý là các loài thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu, Euphorbiaceae) [2] Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir) là thực vật thuộc chi

Phyllanthus được dùng trong Y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước

trên Thế giới Các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc: rễ Phèn đen được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và trẻ em cam tích Lá thường dùng chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết do đòn ngã,

huyết nhiệt sinh đinh nhọt, còn dùng chữa bị thuốc độc mặt xám da vàng và rắn cắn Vỏ thân dùng chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn

Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học của cây Phèn đen Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn và có thể đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh cho nhân dân trong cộng

đồng các dân tộc Việt Nam Chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu thành phần

hóa học có trong cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir, họ Thầu dầu, Euphorbiaceae)” - đó chính là tên của đề tài cho công trình nghiên cứu này

Cây Phèn đen còn được gọi là cây Nỗ hay Sáp tràng thảo, Tảo phàn

diệp Tên khoa học là: Phyllanthus reticulatus Poir, họ Thầu dầu,

Euphorbiaceae

Phân bố địa lý: là loài cổ nhiệt đới, mọc hoang khắp nơi, ở bờ bụi ven đường, ven rừng có khi được trồng làm hàng rào phổ biến ở nước ta Trên thế giới thấy nhiều ở vùng Đông Á, ở Nhật Bản cũng có mọc

Mô tả: cây bụi, cao 2 - 4m, cành gầy mảnh đen nhạt, đôi khi họp từng 2 đến 3 cành trên cùng một đốt dài 10 - 20cm Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bầu dục hay hình trứng ngược nhọn, hay tù ở hai đầu, phiến lá rất mỏng, dài 1,5 - 3cm, rộng 6 - 12mm, mặt trên màu sẫm hơn mặt dưới, lá kèm hình tam giác hẹp Cụm hoa hình chùm mọc ở nách lá, riêng lẻ hay xếp 2 - 3 cái một Quả hình cầu, khi chín màu đen dài 5 mm, rộng 3mm Hạt hình 3 cạnh, màu nâu có những đốm rất nhỏ Ra hoa kết quả tháng 8 - 10 [7]

1.2- Các hợp chất hoá học có hoạt tính sinh học trong chi

Phyllanthus

Người ta đã phát hiện chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có

trên 700 loài gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ Ở Việt

Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus

urinaria L (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus Poir (cây Phèn

đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đắng) Thành

phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [20]

1.2.1- Một số đại diện của khung axit

Năm 1995, từ loài Phyllanthus amarus L Yeap Foo [40] và Thales R

Cipriani, Caroline G Mellinger - năm 2008 đã phân lập được axit amariinic,

axit thiobarbituric và axit ascorbic [61]

1 Axit amariinic

Ying-Jun Zhang đã tách được axit phyllaemblic [70], axit amlaic [62],

axit ascorbic (vitamin C) là một enđiol-lacton [38], 2-O-(3,4,5-trihydroxy benzoyl) có tên khác là 2-O-galloylgalactaric acid hay 2-O-galloylmucic acid

[10, 19, 92], O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl) còn gọi là axit galloylmalic [43,

69] từ loài Phyllanthus emblica

OO

2 Axit ascorbic 3 Axit galloylmalic

4 Axit amlaic 5 Axit 2-O-galloylgalactaric

Từ loài Phyllanthus fraternus năm 1997, Rajasubramaniam cùng các

cộng sự đã tách được axit indole-3-butyric, axit 1-naphthaleneacetic [52] Còn

Mericli và Wanxing Wei khi nghiên cứu độc lập từ loài Phyllanthus urinaria

đã phân lập được axit pentahydroxybenzoic [46, 67]

6 Axit 1-naphthaleneacetic 7 Axit pentahydroxybenzoic 1.2.2- Một số đại diện của nhóm tecpenoit

Tanaka và các cộng sự từ loài Phyllanthus flexuosus đã phân lập được 5

tritecpen mới, cấu trúc được chỉ ra là: olean-12-en-3β,15α-diol; lup-20 en-3β,24-diol; olean-12-en-3β,24-diol; olean-11:13(18)-dien-3β,24-diol và olean-12-en-3β,15α,24-triol và hai chất đã biết là: tritecpendiolbetulin [64]; lup-20(29)-en-3β,15α-diol [60]

OH

Năm 1988, từ loài Phyllanthus fraternus - Shunyo Matsunaga và Reiko

Tanaka công bố đã tách được axit trichadenic B có cấu trúc như axit 3β-hydro xy-D:A-friedooleanan-27-oic, được xác định dựa vào phương pháp phân tích

X-ray [58] Còn từ loài Phyllanthus engleri Hnatyszyn và Sengupta đã tách

được phyllanthol có cấu trúc được chỉ ra là 13,27-cyclo-3-taraxastanol (hay 13,27-cyclo-3-ursanol) [31, 56]

CH3 CH3

4 56

10 Axit trichadenic B 11 Phyllanthol

Zhang L Z đã tách được một số triterpen như: lupeol acetat, β-amyrin,

β-amyrylglucosid, lup-28 (29)-en-3 β-ol từ loài Phyllanthus urinaria L [71]

Cấu trúc một số hợp chất tritecpen điển hình đã được xác định như sau:

Theo Sutthivaiyakit và Nakorn N từ loài Phyllanthus oxyphyllus tách

được: 29-nor-3,4-seco-friedelan tritecpen (axit 4(23),20(30)-dien-3-oic) và một secquitecpen mới là guaiane secquitecpen (5-

29-nor-3,4-seco-friedelan-hydroxy-6,9-epoxyguaiane) Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ thử nghiệm IC50 = 0.017 ± 0.001 mM [59]

15 29-nor-3,4-seco-friedelane tritecpen 16 Guaiane secquitecpen

Tại Châu Phi từ loài Phyllanthus plyanthus, Vuyelwa J.N và Neil R.C

đã tìm ra được một số tritecpenoit có công thức cấu trúc được xác lập là: (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, δ-amyrin acetate, lupenone và (20S)-3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, họ đặt tên cho nó là phyllanthol và phyllanthone [65]

17 (20S)-3β-Acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol

Trên tạp chí “Phytochemistry” năm 1966 đăng tải, Sengupta và

Mukhopadhyay đã tách được hai pentacyclic tritecpenoit, đó là: phyllanthol

và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) từ loài Phyllanthus acidus [56] Trước đó từ loài Phyllanthus niruri Bikram Singh đã tách được một acyclic tritecpen, cấu

trúc của nó được dự đoán dựa trên các phương pháp phân tích phổ là: 3, 7,11,15,19,23-hexamethyl-2Z,6Z,10Z,14E,18E,22E-tetracoshexen-1-ol [17]

Còn từ loài Phyllanthus watsonii đã tách được hợp chất tritecpen mới:

26-Nor-D:A-friedooleanane tritecpen cùng với lupenyl palmitate, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, lup-20(2) [45]

1.2.3- Một số đại diện của Lignan

Năm 1998 - Chen và năm 2003 - Li thông báo từ loài Phyllanthus

niruri đã tách được demethyleneniranthin C23H32O7 (cấu trúc của demethyl eneniranthin được chỉ ra là 4,5-dihydroxy-3,3',4',9,9'-pentamethoxylignan), linnanthin C25H36O7 hay 3-methoxyphyllanthin (cấu trúc của linnanthin là 3,3',4,4',5,9,9'-heptamethoxylignan) [22, 41] Phyllanthin C24H34O6, hypo phyllanthin C24H30O7, niranthin C24H32O7 (cấu trúc của niranthin được chỉ ra là 3,4-methylene, 3',4',5,9,9'-penta-Me ether hay 3',4',5,9,9'-pentamethoxy-3,4-methylenedioxylignan), nirtetralin C24H30O7 và phyllteralin C24H34O6[11] Dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, cấu trúc của nirtetralin và phylltetralin được xác định là 1-phenyl tetralins

18 Demethyleneniranthin

CH3 O

19 Linnanthin 20 Niranthin

Trong loài Phyllanthus discoides người ta đã tách được phyllanthin

(MPLC) từ loài Phyllanthus niruri L ở vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh

[4], đây là hai lignan đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc tế bào gan bằng CCl4 và D- GalN/ TNF- [3, 64]

Theo Satyanarayana và Venkateswarlu [54], từ loài Phyllanthus niruri

đã tách được 4 diarylbutane lignan mới, chúng được coi là sản phẩm chuyển

hóa thuộc hệ thống 5′-desmethoxy niranthin Trong đó hai chất (25) và (26) là sản phẩm chuyển hóa từ axit veratrylidene piperonylidene succinic, (27) được

chuyển hóa từ axit veratrylidene 3,4,5-trimethoxy benzylidene succinic và

(28) được chuyển hoá từ (27)

25 R = H 27 R = H 26 R = CH3 28 R = CH3

Đầu những năm 90 thế kỷ trước, các nhà khoa học do Pettit đứng đầu

khi nghiên cứu về loài Phyllanthus acuminatus đã tách được phyllanthostatin

1 có công thức phân tử C40H52O17 công thức cấu tạo đã được làm rõ là

Từ tài liệu của Asakawa [12], Bick [16] và Bilia [18] - từ loài

Phyllanthus tenellus đã phân lập được flavonoit tenellus-1 có công thức phân

tử C35H28O17 là chất bột màu vàng với tên gọi Hexahydroxydiphenoyl]-D-glucopyranoside] có cấu tạo:

30 Flavonoit tenellus-1

và flavonoit tenellus-2 có công thức phân tử C42H32O21 ứng với tên gọi và cấu tạo là: 7-O-[4,6-[(S)-4,4',5,5',6,6'-Hexahydroxydiphenoyl]-3-O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl) D-glucopyranoside]:

31 Flavonoit tenellus-2

Từ dịch chiết ethanol loài Phyllanthus emblica L đã phân lập được

quecxetin và catechin - đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa tốt [68]

Các nhà khoa học Ấn Độ đã khảo sát khả năng chống oxi hóa từ dịch

chiết methanol của 5 loài Phyllanthus là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus

urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus và khẳng định; các dịch chiết này đều cho kết quả tốt [37]

Từ loài Phyllanthus sellowianus Hnatyszyn đã phân lập được rutin và

isoquercitrin là hai flavonoit chiếm thành phần chủ yếu trong cây này [32]

34 Rutin 35 iso-Quercitrin

Theo Shakil và Pankaj, từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 2

flavanon: 8-(3-metyl-but-2-enyl)-2-phenyl chroman-4-on (36) và hydroxy phenyl)-8-(3-metyl-but-2-enyl)-chroman-4-on (37) Hai chất trên

2-(4-được các tác giả nhận định là có khả năng làm thuốc chữa bệnh gút và bệnh thận [57]

36 37

1.2.5- Một số hợp chất phenolic khác

Từ loài Phyllanthus myrtifolius và Phyllanthus urinaria ở Đài Loan,

Lin và Chen Lui đã phân lập và nhận dạng được O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranos là chất bột màu vàng có công thức phân tử C40H28O25 và cấu tạo được xác lập là glycozit của axít gallic với đường galactozơ theo kiểu liên kết ete [23, 42]

38 4-O-Brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl D-glucopyranos

Một số hợp chất được tách từ loài Phyllanthus emblica như:

2-O-D-Glucopyranoside C17H24O9 ở dạng tinh thể và

2-O-[-D-Apiofuranosyl-(16)-D-glucopyranoside] C22H32O13 (40) là chất vô định hình màu vàng [15, 36, 73]

Chất 3'-Epimer còn được gọi là (Epigallocatechin-(27,48)-gallocatechin hay prodelphinidin A1: C30H24O14 [72], putranjivain A C46H36O31 [25] Ở quả của loài này còn phân lập được phyllanemblinin A C27H20O17 là chất bột màu trắng, emblicanin A C34H22O22, emblicanin B C34H20O22 [28]

Những thông tin mới đây của Farah Naaz và Herbert Kolodziej cho

biết từ loài Phyllanthus amarus đã tách được axit shikimic (3-and 5-O-gallat),

flavan-3-ol (epigallocatechin 3-gallat), proanthocyanidin và hydrolysable tannin (corilagin, casuariin, geraniin) [26, 30]

39 2-O-D-Glucopyranoside 40 2-O-[-D-Apiofuranosyl-(16)-D-glucopyranoside]

41 Prodelphinidin A1

OH

44 Proanthocyanidins

Cũng từ loài này L.Yeap Foo và Herbert Wong đã tách được một sản phẩm từ tannin thủy phân và đặt tên là phyllanthusiin D có cấu trúc được xác định: 1-galloyl-2,4-(acetonyl-dehydrohexahydroxydiphenoyl)-3,6-hexahydro xydiphenoylglucopyranozit [39]

Từ phần dịch chiết ethylaxetat của loài Phyllanthus niruri L, ở vùng

Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh đã phân lập được hai chất là: 2,4,6- xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on và 5,7,8 - trihidroxi-9,10- peoxi-4-ethoxy benzo[2,3-d] coumarin, hai chất này cho đến nay chưa thấy

thông báo có mặt trong các loài Phyllanthus [4]

45 2,4,6-xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on

46 5,7,8-trihidroxi-9,10-peoxi-4-ethoxybenzo[2,3-d]coumarin

Hoạt tính chống oxy hóa của 5,7,8-trihidroxi-9,10-peoxi-4-ethoxy benzo[2,3-d] coumarin cùng với quercetin làm đối chứng đã được thử bằng phương pháp Potterat trong cùng một điều kiện Cho thấy chất này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa yếu hơn so với quercetin (ở nồng độ 25 mg/l vẫn còn phản ứng dương tính) [4]

47 Nirurine 48 4-Methoxynorsecurinine

Từ loài Phyllanthus amarus đã tách được 2 ankaloit mới là

isobubbialine (7-epimer) và epibubbialine (2-epimer Prenirurine)) cùng với 3 ankaloit đã biết là phyllanthine, securinine và norsecurinine Cấu trúc của chúng được xác định trên cơ sở phân tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ khối lượng và phổ NMR [48]

Tại bang Florida nước Mĩ, từ loài Phyllanthus niruroides - Babady

Bila, Thomas E Gedris và Werner Herz đã phân lập được một hợp chất mới

thuộc nhóm ankaloit là niruroidine (2,7-diepimer), cấu trúc của nó được làm

sáng tỏ dựa trên các phương pháp phổ [13] Từ loài Phyllanthus simplex lần

đầu tiên đã phân lập được một ankaloit là simplexine methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) và một ankaloit đã biết là phyllanthine [53] Chất này đã và đang được sử dụng làm thuốc Tây y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phổ biến trên thị trường

(14-hydroxy-4-Ngoài những nhóm hợp chất trên, từ loài Phyllanthus discoides đã tách

được 14,15-Dihydroallosecurinine-15-ol C13H17NO3 tinh thể màu vàng da cam [14, 21, 47] và phyllalbine (vanillyl tropate) C16H21NO4 [55]

1.3- Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir

Theo tài liệu của GS Đỗ Tất Lợi thì tại Việt Nam chưa có công trình

nghiên cứu nào về thành phần hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir [7]

Ở Kenya - các nhà khoa học của nước này đã sử dụng dịch chiết từ lá

của loài Phyllanthus reticulatus Poir để khảo sát khả năng chống sốt rét trên

chủng chloroquine - nhạy (K67) và chloroquine - kháng (ENT36) ở nồng độ thử nghiệm cho kết quả IC50  10g/ml [24]

reticulatus đã phân lập được một hợp chất mới là: 21-α-hydroxyfriedel-4(23)

-en-3-on và một vài triterpenoit khác Các nhà khoa học tại đây cũng khẳng định họ đã tách được friedelin, sitosterol, friedelan-3β-ol, glochidonol và 21α-

hydroxyfriedelan-3-one [66] từ loài Phyllanthus reticulatus

Các loài cây thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng rộng

rãi trong y học dân tộc của nhiều nước để chữa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh viêm gan B…[9] Các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là

Phyllanthus urinaria L, Phyllanthus reticulatus Poir và Phyllanthus amarus

Chữa xơ gan cổ trướng thể năng: Cây Diệp hạ châu đắng sao khô 100g sắc nước 3 lần Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày, liệu trình 30 - 40 ngày Khẩu phần ăn hàng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ)

Cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) trong y học dân tộc

được nhân dân dùng để chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở

ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, chữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn rất có hiệu quả

Một số bài thuốc dùng cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L)

[6, 8]:

Nhân dân ta thường dùng toàn cây hái về làm thuốc, mùa thu hái quanh năm nhưng tốt nhất là vào mùa hạ Thường dùng tươi có khi phơi khô, ngày uống 20 - 40g cây tươi, sao khô, sắc đặc, uống thay nước

Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Chó đẻ răng cưa sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g Sắc nước uống hàng ngày

Đối với bệnh ngoài da: Cây tươi giã nát với một ít muối đắp ngoài da với liều lượng không hạn chế

Theo các lương y, lá cây Phèn đen có vị chát, tính mát, đã được dùng lâu đời trong y học dân tộc với tác dụng làm mát máu, cầm máu, thu sáp và giảm đau Rễ tính lạnh có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, chỉ tả Vỏ gây chuyển hóa [5]

Một số bài thuốc dùng cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) [5, 7]:

Chữa kiết lỵ: dùng rễ cây Phèn đen, dây mơ lông, cỏ seo gà, cỏ tranh bằng nhau, mỗi vị 20g, gừng 2 lát 2g - sắc uống (Nam dược thần hiệu)

Chữa bị đòn máu ứ ở trong nguy cấp: lá Phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào và vắt lấy nước uống (Bách gia trân tàng), hoặc dùng 40g sắc rồi chế thêm một chén rượu - uống

Chữa nhọt độc mới phát: lá Phèn đen và lá Bèo ván giã nát rồi đắp (Bách gia trân tàng)

Chữa nhiệt tả và lỵ: cây Phèn đen cả cành và lá, đậu đen sao, mỗi thứ 40g, đổ 4 bát nước sắc lấy 1 bát, chia ra uống làm 3 lần (Hoạt nhân toát yếu của Hoàng Đôn Hòa)

Chữa đại tiện ra máu: cây Phèn đen cả cành và lá, thái nhỏ 3 bát, sắc đặc uống (Bách gia trân tàng)

Chữa chảy máu nướu răng: lá Phèn đen phối hợp với lá Long não và lá Xuyên tiêu phơi khô, chế thành viên rồi ngậm

Trị rắn cắn: lá Phèn đen tươi nhai nát nuốt hết nước rồi lấy bã đắp lên chỗ rắn cắn

1.4.2- Một số tác dụng dược lý của chi Phyllanthus

Năm 1961, phòng Đông Y - viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cây chó đẻ răng cưa thấy kết quả tác dụng kháng sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Typhi (0,9 cm), Flexneri (1,1cm), Sonnei (0 cm), Shiga (1cm), Subtilis (0,4 cm), Coli (0 cm)

Năm 1988 các tác giả Blunberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37

bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng chó đẻ răng cưa Phyllanthus amarus và

Phyllanthus niruri đạt kết quả âm tính 22/37 bệnh nhân sau 30 ngày Các tác

giả còn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men

pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B [6]

Tại bệnh viện Thanh Nhàn - Hà Nội, năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng, sử dụng chế phẩm LIV/94 điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001-2002) đạt kết quả tốt Thuốc có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân [8]

Những công trình nghiên cứu hóa học gần đây về các loài Phyllanthus

đã phát hiện một vài lignan, flavonoit và tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HBsAg, ức chế mạnh HIV transcriptase ngược [34]

Các thí nghiệm in vitro của cây chó đẻ với kháng nguyên HBsAg và với tổn thương gan do cacbontetraclorit gây nên đã chứng minh cây chó đẻ răng cưa có khả chống virus viêm gan B Cây chó đẻ răng cưa có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Coli, Shigella dysenteriae, S flexneri, S shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus fumigatus [1]

Chương 2

THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen, được thu hái vào tháng 11 năm 2008 tại làng Nguyễn, huyện Đông Hưng, tỉnh Thái Bình

Cây Phèn đen có tên khác là cây Nỗ hay Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp, dân địa phương còn gọi là Thèn đen Mẫu cây đã được bộ môn Phân loại thực vật của khoa Sinh - trường ĐHSP Thái Nguyên giám định tên khoa học là

“Phyllanthus reticulatus Poir”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Mẫu cây tươi sau khi thu hái gồm thân và lá được đem sấy ở 800C trong 10 phút để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 600C cho tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết trong ethanol ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong nhiều ngày

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô đến dưới dạng xirô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethylacetate, n-butanol, methanol Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500C dưới áp suất thấp Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây phèn đen chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm:

- Sắc kí lớp mỏng bằng bản tráng sẵn trên đế nhôm

- Sắc kí cột silicagel, thường dùng silicagel Merck 63 - 200nm - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy, đo hoạt tính quang học v.v khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân

với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể Các số liệu thực nghiệm của các chất sạch được dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng

2.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1 Dụng cụ và hoá chất

Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA)

Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

Các hệ dung môi khai triển SKLM:

Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV-

vanilin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000C Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:

chiều dài di chuyển của dung môi Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rfx100

Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230 - 400 mesh (0,063 - 0,200 mm)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200

- Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) dưới dạng viên nén KBr

- Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD

nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-D6

2.3 Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.)

2.3.1 Các dịch chiết

Toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng ethanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexane, ethylacetate, đuổi hết nước và chiết bằng n-butanol, tiếp tục đuổi hết nước và chiết bằng methanol

Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500

C Cặn được sấy khô và cân để xác định khối lượng Như vậy, từ toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen đã thu nhận được 4 phân đoạn là n-hexane, ethylacetate, n-butanol và methanol với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexane (HP), cặn trong ethylacetate (EP), cặn trong n-butanol (BP) và cặn trong methanol (MP)

Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu

Cặn BuOH (BP)

(PB) Cặn EtOAc

(EP)

(PE)

Cặn MeOH (MP)

Bảng 2.1: Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn của

cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.)

Khối lượng nguyên liệu

khô (g)

Khối lượng cặn cồn tổng

số (g)

Khối lượng cặn chiết (g)

n-hexane Ethylacetate n-butanol methanol

2.3.2 Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1 Phát hiện các hợp chất sterol

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô Hoà tan cặn trong 3ml chloroform - lấy dịch chloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhydridacetic + 1ml chloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc) Lấy 1ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính

magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoid

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1 Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn

đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính

Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin

2.3.2.5 Định tính các glucosid tim

Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1

+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolid

+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim

2.3.2.6 Định tính các saponin

Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1 Lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho

2ml dịch thử Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính

Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen

Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae được nêu trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen Phyllanthus

reticulatus Poir, Euphorbiaceae

STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Cặn tổng

2.4 Phân lập, tinh chế các chất từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.)

2.4.1 Dịch chiết n-hexane

Từ 15g cặn dịch n-hexane của toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen, ký hiệu HP được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexane : ethylacetate với các tỷ lệ tăng dần ethylacetate từ 0% đến 100%, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu được ba chất HP-2, H-4, HP-5

2.4.1.1 Chất HP-2 (β-sitosterol hay stigmast-5-en-24R-3-ol )

Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexane : ethylacetate = 9 : 1 Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện chất HP-2 bằng vanilin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexane thu được 29 mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139 - 1400

C và Rf = 72 (trong hệ dung môi A)

Đo phổ chất HP-2 thu được các thông tin phổ như sau:

Phổ FT-IR (KBr): νmax(cm-1): 3431,5 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804

Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11)

Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18)

Phổ 13

C-NMR (125MHz, CDCl3):  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s,

C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29)

2.4.1.2 Chất HP-4 (β-sitosterolglucosid hay -sitosterol-3-O-glucopyranosyl)

-D-Ở hệ rửa giải n-hexane : ethylacetate = 2 : 3, những phân đoạn có cùng Rf = 80 trong hệ dung môi D được gộp lại, thu được cặn thô Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 23 mg một chất rắn vô định hình, nóng chảy ở nhiệt độ 269 - 270C

Tiến hành đo phổ chất HP-4 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ FT-IR max (cm-1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026 Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6]+ (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100)

Phổ 1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6);  (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19)

Phổ 13

C-NMR (125MHz, DMSO-d6);  (ppm): 140,6 (s, 5); 121,3 (d, 6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C-9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C-20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18)

C-2.4.1.3 Chất HP-5 (2-Acetamido-3-phenylpropyl phenylpropanoate hay -acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate)

2-benzamido-3-Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform : methanol = 9 : 1, loại bỏ dung môi thu được 12mg chất rắn là những tinh thể hình kim, màu trắng, R = 87,5 trong hệ dung môi F, nóng chảy ở nhiệt độ 193-195oC

Đo phổ chất HP-5 thu được các thông tin phổ như sau:

Phổ FT-IR max (cm-1): 3323 (OH, NH), 3031, 2924, 2853 (CH3, CH2, CH), 1726 (C=O), 1661, 1632 (CO amit bậc I), 1532 (NH amit), 1449, 1264, 1052 (C-O-C), 699 (cấu dạng của liên kết CH=CH)

Phổ ESI-MS (m/z): [M+H]+ 445 amu Phổ 1

H-NMR (500 MHz, CDCl3),  (ppm) : 7.70 (2H, dd, J 1.4 ; 8.5Hz), 7.52 (1H, tdd, J1.1, 2.3, và 7.4Hz), 7.42 (2H, dd, J 1.6 và 7.4Hz), 7.28 (2H, ddd, J 1.5, 6.7 và 7.3 Hz), 7.21 (2H, dd, J 2.3, 6.8Hz), 7.14 (3H, m), 6.72 (1H, d, J 7.4Hz), 5.96 (1H, d, J 8.6Hz), 4.75 (1H, ddd, J 6.0, 5.7, và 8.1Hz), 4.34 (1H, m), 3.93 (1H, dd, J 4.9 và 11.3Hz), 3.82 (1H, dd, J 4.3 và 11.3Hz), 3.22 (1H, dd, J 5.9 và 13.7Hz), 3.05 (1H, dd, J 8.4 và 13.7Hz), 2.74 (2H, ddd, J 6.7, 7.5 và 13.7Hz), 2.02 (3H, s, OCH3)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3,  (ppm) : 170.75 (s, C), 170.26 (s, C), 167.12 (s, C), 136.72 (s, C), 136.65 (s, C), 133.72 (s, C), 131.91 (d, C), 129.30 (d, 2C), 129.14 (d, 2C), 128.78 (d, 2C), 128.64 (d, 2C), 128.59 (d, 2C), 127.16 (d, C), 127.06 (d, 2C), 126.76 (d, C), 64.61 (t, C), 55.01 (t, C), 49.50 (d, C), 38.43 (t, C), 37.47 (t, C), 20.78 (q, CH3O)

2.4.2 Dịch chiết ethylacetate

Ở phần cặn dịch ethylacetate của cây Phèn đen, ký hiệu chung là EP được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi chloroform : methanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, từ 0 - 100% methanol, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% và hơi I2 sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi thu được 3 cặn thô tương ứng là: EP-1, EP-2 và EP-3 Những tín hiệu từ hình ảnh của phổ 1H-NMR cho thấy những chất trên chưa tinh khiết, theo đó không xác định được cấu trúc hóa học của chúng

Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ v.v… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật, đó là:

Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu - nước để tách hầu hết

các chất ra khỏi thực vật Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo

Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung

môi từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lượt là: hexane, chlorofom, ethylacetate, n-butanol, methanol (ethanol), ethanol-nước

n-Việc chiết lấy chất từ mẫu thực vật (Phyllanthus reticulatus P.) được thực hiện theo cách 1 (Sơ đồ 2.1)

3.2 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Phèn đen

Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) đều là

những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau Để phân lập từng chất