2.2.1. Dụng cụ và hoá chất
Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA).
Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
Các hệ dung môi khai triển SKLM:
1. n-hexane - EtOAc (8 : 1) hệ A
3. n-hexane - EtOAc (2 : 1) hệ C 4. n-hexane - EtOAc (1 : 1) hệ D 5. Chloroform - methanol (9 : 1) hệ E 6. Chloroform - methanol (5 : 1) hệ F 7. Chloroform - methanol (3 : 1) hệ G 8. Chloroform - methanol (2 : 1) hệ H 9. Chloroform - methanol (1 : 1) hệ I
Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV-
BIOBLOCK ) ở bước sóng = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là
vanilin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000C . Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:
Rf = chiều dài di chuyển củachất thử
chiều dài di chuyển của dung môi Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rfx100.
Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230 - 400 mesh (0,063 - 0,200 mm).
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200.
- Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) dưới dạng viên nén KBr.
- Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD.
nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-D6.
2.3. Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) 2.3.1. Các dịch chiết 2.3.1. Các dịch chiết
Toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng ethanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexane, ethylacetate, đuổi hết nước và chiết bằng n-butanol, tiếp tục đuổi hết nước và chiết bằng methanol.
Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500
C. Cặn được sấy khô và cân để xác định khối lượng. Như vậy, từ toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen đã thu nhận được 4 phân đoạn là n-hexane, ethylacetate, n-butanol và methanol với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexane (HP), cặn trong ethylacetate (EP), cặn trong n-butanol (BP) và cặn trong methanol (MP).
Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu
1. Ethanol
2. Cặn trong nước
n-hexane EtOAc BuOH MeOH MẪU KHÔ Cặn n-hexane (HP) Cặn BuOH (BP) (PB) Cặn EtOAc (EP) (PE) Cặn MeOH (MP)
EP-1 EP-2 EP-3
Bảng 2.1: Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn của cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.)
Khối lượng nguyên liệu khô (g) Khối lượng cặn cồn tổng số (g)
Khối lượng cặn chiết (g)
n-hexane Ethylacetate n-butanol methanol
1250 315,60 37,75 26,90 26,47 47,28
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml chloroform - lấy dịch chloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhydridacetic + 1ml chloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloid
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tính.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml methanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột
magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoid.
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính.
Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin.
2.3.2.5. Định tính các glucosid tim
Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1.
+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolid.
+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim.
2.3.2.6. Định tính các saponin
Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. Lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính.
Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen
Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae được nêu trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen Phyllanthus
reticulatus Poir, Euphorbiaceae
STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Cặn tổng
1 Sterol Lieberman-
Bourchardt
Màu xanh
Màu vàng +
2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam +
3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + H2SO4 đặc Hồng nhạt + NaOH đặc Vàng + FeCl3 5% Xanh thẫm + 4 Cumarin Phản ứng tạo kết
tủa bông Có kết tủa +
5 Glucosit trợ tim FeCl3 trong CH3COOH +H2SO4đ Vàng nâu rõ ─
6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH +
Chú giải : + : Phản ứng dương tính ─ : Phản ứng âm tính
2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) reticulatus P.)
2.4.1. Dịch chiết n-hexane
Từ 15g cặn dịch n-hexane của toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen, ký hiệu HP được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexane : ethylacetate với các tỷ lệ tăng dần ethylacetate từ 0% đến 100%, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu được ba chất HP-2, H-4, HP-5.
2.4.1.1. Chất HP-2 (β-sitosterol hay stigmast-5-en-24R-3-ol )
Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexane : ethylacetate = 9 : 1. Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện chất HP-2 bằng vanilin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexane thu được 29 mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139 - 1400
C và Rf = 72 (trong hệ dung môi A).
Đo phổ chất HP-2 thu được các thông tin phổ như sau:
Phổ FT-IR (KBr): νmax(cm-1): 3431,5 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3): (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3): (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s,
C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29).
2.4.1.2. Chất HP-4 (β-sitosterolglucosid hay -sitosterol-3-O--D-
glucopyranosyl)
Ở hệ rửa giải n-hexane : ethylacetate = 2 : 3, những phân đoạn có cùng Rf = 80 trong hệ dung môi D được gộp lại, thu được cặn thô. Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 23 mg một chất rắn vô định hình, nóng chảy ở nhiệt độ 269 - 270C.
Tiến hành đo phổ chất HP-4 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ FT-IR max (cm-1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6]+ (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100). Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6); (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19). Phổ 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6); (ppm): 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C- 6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C-9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C- 20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18). 2.4.1.3. Chất HP-5 (2-Acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3- phenylpropanoate hay -acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-
phenylpropinoate)
Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform : methanol = 9 : 1, loại bỏ dung môi thu được 12mg chất rắn là những tinh thể hình kim, màu trắng, Rf = 87,5 trong hệ dung môi F, nóng chảy ở nhiệt độ 193-195oC.
Đo phổ chất HP-5 thu được các thông tin phổ như sau:
Phổ FT-IR max (cm-1): 3323 (OH, NH), 3031, 2924, 2853 (CH3, CH2, CH), 1726 (C=O), 1661, 1632 (CO amit bậc I), 1532 (NH amit), 1449, 1264, 1052 (C-O-C), 699 (cấu dạng của liên kết CH=CH).
Phổ ESI-MS (m/z): [M+H]+ 445 amu. Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), (ppm) : 7.70 (2H, dd, J 1.4 ; 8.5Hz), 7.52 (1H, tdd, J1.1, 2.3, và 7.4Hz), 7.42 (2H, dd, J 1.6 và 7.4Hz), 7.28 (2H, ddd, J 1.5, 6.7 và 7.3 Hz), 7.21 (2H, dd, J 2.3, 6.8Hz), 7.14 (3H, m), 6.72 (1H, d, J 7.4Hz), 5.96 (1H, d, J 8.6Hz), 4.75 (1H, ddd, J 6.0, 5.7, và 8.1Hz), 4.34 (1H, m), 3.93 (1H, dd, J 4.9 và 11.3Hz), 3.82 (1H, dd, J 4.3 và 11.3Hz), 3.22 (1H, dd, J 5.9 và 13.7Hz), 3.05 (1H, dd, J 8.4 và 13.7Hz), 2.74 (2H, ddd, J 6.7, 7.5 và 13.7Hz), 2.02 (3H, s, OCH3). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, (ppm) : 170.75 (s, C), 170.26 (s, C), 167.12 (s, C), 136.72 (s, C), 136.65 (s, C), 133.72 (s, C), 131.91 (d, C), 129.30 (d, 2C), 129.14 (d, 2C), 128.78 (d, 2C), 128.64 (d, 2C), 128.59 (d, 2C), 127.16 (d, C), 127.06 (d, 2C), 126.76 (d, C), 64.61 (t, C), 55.01 (t, C), 49.50 (d, C), 38.43 (t, C), 37.47 (t, C), 20.78 (q, CH3O). 2.4.2. Dịch chiết ethylacetate
Ở phần cặn dịch ethylacetate của cây Phèn đen, ký hiệu chung là EP được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi chloroform : methanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, từ 0 - 100% methanol, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% và hơi I2 sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi thu được 3 cặn thô tương ứng là: EP-1, EP-2 và EP-3. Những tín hiệu từ hình ảnh của phổ 1H-NMR cho thấy những chất trên chưa tinh khiết, theo đó không xác định được cấu trúc hóa học của chúng.
Chương 3
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung
Trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hóa học của các chất sẵn có trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi mẫu thu hái xong phải được diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo.
Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ v.v… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật, đó là:
Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu - nước để tách hầu hết các chất ra khỏi thực vật. Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo.
Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung môi từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lượt là: n- hexane, chlorofom, ethylacetate, n-butanol, methanol (ethanol), ethanol-nước. Việc chiết lấy chất từ mẫu thực vật (Phyllanthus reticulatus P.) được thực hiện theo cách 1 (Sơ đồ 2.1).
3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Phèn đen
Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất
ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần.
Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng.
Khi phân lập các thành phần hoá học từ lá cây Phèn đen được thực hiện như trong sơ đồ 2.1. Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n- hexane của cây Phèn đen chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: .
3.2.1. Chất HP-2 (β-sitosterol)
Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexane: ethylacetate = 9 : 1. Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, thu được 29 mg chất HP-2 có Rf = 72.
Chất HP-2 là những tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy ở 139-1400
C, tan tốt trong n-hexane, chloroform… Khi trộn lẫn với chất chuẩn cho một hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi.
Phổ EI- MS, m/z (%) cho [M+
] = 414 (23), [M-1]+ = 413 (41).
Từ phổ EI-MS cho pic [M+] = 414 ứng với công thức phân tử C29H50O. Phổ hồng ngoại, phổ 1
H-NMR và phổ 13C-NMR cho thấy trong phân tử
có nhóm OH tại vị trí C-3 (IR có vân 3450 cm-1
rộng, δH-3α = 3,57ppm và δC-3
= 72,1ppm). Một liên kết đôi tại C6 (phổ IR có νmax= 3010cm-1 và 1650cm-1 ứng với dao động hoá trị của liên kết đôi; còn trên phổ 1
H-NMR cho δH-6 = 5,42ppm (1H, d, J, 5,2Hz), phổ 13C-NMR cho δC-5 = 141,1ppm và δC-6 = 121,7ppm). So sánh các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất với số liệu phổ NMR của β-sitosterol chuẩn hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ ra ở bảng 3.1.
Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của hợp chất hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol.
3.2.2. Chất HP-4 (β-sitosterolglucosid hay -sitosterol-3-O--D-