NGHIÊN cứu xác ĐỊNH các hợp CHẤT PHENOL TRONG nước BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc kí LỎNG – đầu dò điện hóa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THANH BÌNH MINH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHẤT PHENOL TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG – ĐẦU DÒ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THANH BÌNH MINH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHẤT PHENOL TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÍ LỎNG – ĐẦU DÒ ĐIỆN HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2009

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THANH BÌNH MINH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHẤT PHENOL TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÍ LỎNG – ĐẦU DÒ ĐIỆN HOÁ

CHUYÊN NGÀNH HOÁ PHÂN TÍCH

MÃ SỐ: 1.04.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ PHÂN TÍCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN MAI

TS VÕ DIỆP THANH THỦY

TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2009

LỜI CẢM ƠN



Để đạt được kết quả ngày hôm nay tôi vô cùng biết ơn và không thể nào

quên:

- Công lao nuôi dưỡng của Ba Mẹ và Gia đình

- Sự giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình của cô Nguyễn Thị Xuân Mai

- Sự hướng dẫn và những lời động viên kịp thời của cô Võ Diệp Thanh Thuỷ

- Những ý kiến quý báu, thiết thực của thầy Nguyễn Thanh Khuyến và cô

Diệp Ngọc Sương

- Sự giúp đỡ của chị Trần Thị Thuỷ, bạn Phan Thị Ngọc Như, bạn Nguyễn

Huy Du, bạn Nguyễn Minh Trúc và quý Thầy Cô tại Phòng Phân Tích Trung Tâm

và Bộ môn Hoá Phân Tích Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

- Sự chia sẽ của bạn Trương Vũ Ánh Nguyệt và bạn Phan Nguyễn Tâm Minh trong quá trình thực hiện đề tài

- Những kiến thức mà thầy cô đã truyền đạt cho tôi trong thời gian qua

- Cùng sự quan tâm, khích lệ và giúp đỡ của bạn bè…

DANH MỤC CÁC BẢNG

 Bảng 1.1: Tính chất vật lí của một vài hợp chất Phenol

Bảng 1.2: Giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ Phenol và dẫn xuất

Bảng 2.1: Giá trị nồng độ đúng của các hợp chất Phenol chuẩn

Bảng 2.2: Thành phần các pha động được khảo sát

Bảng 2.3: Tỉ lệ các pha động khảo sát

Bảng 2.4: Độ phân giải Rs với các pha động khác nhau

Bảng 2.5: Kết quả khảo sát tốc độ dòng trên Resorcinol nồng độ 1 mg/l

Bảng 2.6: Kết quả khảo sát khoảng thế áp đến diện tích của các hợp chất Phenol

ở nồng độ 1 mg/l

Bảng 2.7: Vị trí và thời gian lưu của các hợp chất Phenol trên sắc kí đồ

Bảng 2.8: Độ lặp lại kết quả phân tích ở hai nồng độ là 0.1 µg/ml và 0.5 µg/ml Bảng 2.9: Số liệu diện tích và nồng độ quá trình dựng đường chuẩn của hỗn hợp

gồm 6 hợp chất Phenol và dẫn xuất: Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, Paranitrophenol, 2-Clorophenol, Ortonitrophenol

Bảng 2.10: Kết quả khoảng tuyến tính và phương trình hồi quy tuyến tính của các

hợp chất Phenol

Bảng 2.11: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các hợp chất phenol

Bảng 2.12: Hiệu suất thu hồi của các mẫu tự tạo có pH khác nhau

Bảng 2.13: Hiệu suất thu hồi của mẫu tự tạo với các dung môi rửa giải khác nhauBảng 2.14: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết theo thể tích dung môi rửa giải

Bảng 2.15: Hiệu suất thu hồi với mẫu tự tạo có nồng độ khác nhau

Bảng 2.16: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung dịch Na2SO3 10 % lên hiệu suất

chiết các hợp chất Phenol

Bảng 2.17: Hiệu suất thu hồi các hợp chất Phenol khi mẫu thật là nước sinh hoạt Bảng 2.18: Hiệu suất thu hồi các hợp chất Phenol khi mẫu thật là nước sông Sài

Gòn

Bảng 2.19: Hiệu suất thu hồi các hợp chất Phenol khi mẫu thật là nước sông

Đồng Nai Bảng 2.20: Kết quả hiệu suất chiết các hợp chất Phenol theo dung môi rửa tạp

Bảng 2.21: Kết quả phân tích mẫu nước sông Chợ Đệm

Bảng 2.22: Hiệu suất thu hồi các hợp chất Phenol khi mẫu thật là nước sông Chợ

Bảng 2.25: Hiệu suất thu hồi của các hợp chất Phenol trong nước thải KCN Lê

Minh Xuân bằng phương pháp thêm chuẩn

Bảng 2.26: Kết quả phân tích mẫu nước thải KCN Biên Hoà II bằng phương pháp

thêm chuẩn

Bảng 2.27: Hiệu suất thu hồi của các hợp chất Phenol khi mẫu thật là nước thải

KCN Biên Hoà II

DANH MỤC CÁC HÌNH

 Hình 1.1: Hệ thống vòng Loop tiêm mẫu

Hình 1.2: Cấu tạo của pha tĩnh dùng trong cột pha đảo

Hình 1.3: Phản ứng của Phenol trên điện cực chỉ thị Glassy carbon

Hình 2.7: Sắc ký đồ của dung dịch 11 chất phenol nồng độ 0.1 mg/l

Hình 2.8: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tốc độ dòng lên thời gian lưu của

Hình 2.12: Các biểu đồ đường chuẩn của 6 hợp chất Phenol: Resorcinol,

Pyrocatechol, Phenol, Paranitrophenol, Clorophenol,Ortonitrophenol

2-Hình 2.13: Sơ đồ các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn

Hình 2.14: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi theo pH của mẫu

Hình 2.15: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi theo loại dung môi rửa giải

Hình 2.16: Hiệu suất chiết trung bình của các hợp chất Phenol theo thể tích dung

môi rửa giải

Hình 2.17: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi theo nồng độ mẫu tự tạo

Hình 2.18: Sơ đồ quá trình xử lí mẫu và tối ưu hóa qui trình chiết SPE của các

hợp chất Phenol Hình 2.19: Sắc kí đồ của mẫu nước sinh hoạt

Hình 2.20: Sắc kí đồ của mẫu nước sông Sài Gòn

Hình 2.21: Sắc kí đồ của mẫu nước sông Đồng Nai

Hình 2.22: Sắc kí đồ mẫu nước sông Chợ Đệm khi không thêm chuẩn các hợp

chất Phenol

Hình 2.23: Sắc kí đồ mẫu nước sông Chợ Đệm khi có thêm chuẩn các hợp chất

Phenol

Hình 2.24: Sắc kí đồ mẫu nước sông Chợ Đệm khi không thêm chuẩn các hợp

chất Phenol Dung môi rửa tạp là 5 ml Nước cất 2 lần

Hình 2.25: Sắc kí đồ mẫu nước sông Chợ Đệm khi không thêm chuẩn các hợp

chất Phenol Dung môi rửa tạp là 5 ml hỗn hợp dung môi Nước cất 2 lần: Methanol ( 95: 5, v: v )

Hình 2.26: Sắc kí đồ mẫu nước sông Chợ Đệm khi không thêm chuẩn các hợp

chất Phenol Dung môi rửa tạp là 5 ml hỗn hợp dung môi Nước cất 2 lần: Methanol ( 90: 10, v: v )

Hình 2.27: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi theo loại dung môi rửa tạp

Hình 2.28: Sắc kí đồ của mẫu nước thải KCN Lê Minh Xuân

Hình 2.29: Sắc kí đồ mẫu nước thải KCN Lê Minh Xuân khi có thêm chuẩn các

hợp chất Phenol

Hình 2.30: Sắc kí đồ của mẫu nước thải KCN Biên Hoà II

Hình 2.31: Sắc kí đồ mẫu nước thải KCN Biên Hoà II khi có thêm chuẩn các hợp

chất Phenol

PHẦN TỔNG QUAN

CHƯƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN

1.1- Giới thiệu các hợp chầt Phenol và dẫn xuất.

Phenol có nhiều dẫn xuất phụ thuộc vào nhóm thế gắn lên vòng hương phương của Phenol Các dẫn xuất họ Phenol vừa do các phản ứng phân huỷ của thực vật, các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên , vừa do hoạt động sản suất của các nhà máy tạo ra

Theo Tổ chức bảo vệ môi trường của Mỹ - ( EPA ) [ 24] hiện có 11 hợp chất Phenol gây ô nhiễm môi trường chủ yếu hiện nay là: 4-Cloro-3-Methylphenol, 2-Clorophenol, 2,4-Diclorophenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,4-Dinitrophenol, 2-Methyl-4,6-Dinitrophenol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Pentaclorophenol, 2,4,6-Triclorophenol và Phenol

Ngoài ra, còn nhiều dẫn xuất họ Phenol khác như : Pyrocatechol, Resorcinol, 3-NitroPhenol, 1,3-Diclorophenol, 2,3,4,6-Tetraclorophenol … Các dẫn xuất họ Phenol đều rất độc, chỉ một lượng rất nhỏ trong nước ( > 1 ppb ) cũng đã ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ của con người cũng như các loài sinh vật sống trong môi trường nước Khi nồng độ của Phenol và các dẫn xuất nhỏ hơn 1 ppb tuy có độc tính thấp cũng ảnh hưởng nhiều đến mùi vị, màu sắc của nước và đời sống của các loài sinh vật trong nước

1.1.1- Tính chất vật lí và tính chất hóa học của các hợp chất Phenol [1-2,24]

1.1.1.1- Tính chất vật lí của các hợp chất Phenol

Phenol có công thức phân tử là C6H5OH Đa số các hợp chất Phenol tồn tại dạng rắn ở nhiệt độ phòng như Phenol, Nitrophenol, các dẫn xuất Clorophenol ( gồm 2 nhóm thế –Cl trở lên) …, một số hợp chất Phenol khác tồn tại ở dạng lỏng như Cresol, mono-Clorophenol ( gồm chỉ một nhóm thế –Cl )

Bảng 1.1: Tính chất vật lí của một vài hợp chất Phenol

STT Công thức

phân tử

Khối lượng phân

tử

Trạng thái vật lý Điểm

chảy

Điểm sôi

Tính tan trong nước (20oC)

1.1.1.2- Tính Chất Hoá Học Của Các Hợp Chất Phenol

Phenol là dẫn xuất của Hydrocarbon thơm do sự thế một nguyên tử -H trong nhân bằng một nhóm -OH Tuỳ theo các nhóm thế gắn lên vòng hương phương của Phenol mà có các dẫn xuất khác nhau Hầu hết các hợp chất Phenol đều có tính acid

Các nhóm thế thường được gắn lên vòng hương phương của Phenol là: nhóm –Nitro, nhóm – Methyl hoặc nhóm –Cloro … Vòng hương phương của Phenol có thể gắn đồng thời nhiều nhóm thế giống nhau hoặc khác nhau

Một vài loại phản ứng mà các hợp chất Phenol thường tham gia :

- Phản ứng Eter hoá

- Phản ứng Ester hoá

- Phản ứng tạo thành muối trong môi trường kiềm

- Phản ứng trên vòng hương phương như phản ứng Nitro hoá, Halogen hoá, Alkil hoá, Sulfon hóa …

Phản ứng Nitro hoá: MonoNitro hóa Phenol có thể thực hiện với acid Nitric loãng tại nhiệt độ phòng

Với acid Nitric đậm đặc, sự đa Nitro hóa Phenol tạo thành Trinitrophenol

2,4,6-Phản ứng Halogen hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng trí hoán với nước brom

ở vị trí orto và para để tạo trầm hiện màu trắng là 2,4,6-Tribromophenol Đây cũng

là phản ứng biểu tánh thông dụng để nhận biết Phenol

Phản ứng Alkil hoá: Phenol phản ứng với halogenur alkil với xúc tác là

Phản ứng Sulfon hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng sulfon hoá tạo thành sản

phẩm trí hoán orto hoặc para Sản phẩm chính tuỳ thuộc vào điều kiện nhiệt độ

Phenol

2,4,6-TribromophenolAlCl3 hoặc AlBr3

o-Sulfonphenol

p-Sulfonphenol Phenol

Phản ứng Oxid hoá Các hợp chất Phenol dễ bị Oxid hoá tạo thành các hợp chất Quinon như Benzoquinon Tác nhân Oxid hoá có thể là Oxi trong không khí

1.1.2- Nguồn gốc, độc tính, ảnh hưởng, liều lượng cho phép của Phenol

và dẫn xuất trong môi trường nước [9 – 10, 23 – 28, 38 ]

1.1.2.1- Nguồn gốc, độc tính và ảnh hưởng của các hợp chất Phenol và dẫn xuất

Phenol và dẫn xuất có trong các ngành công nghiệp như dệt, nhuộm, nhựa, thuốc, thuốc trừ sâu, chất chống oxi hoá, giấy, công nghệ dầu hoả … Ngoài ra, hợp chất Phenol cũng được sinh ra tự nhiên như sự phân hủy của thực vật, các hợp chất hữu cơ … Hầu hết các hợp chất Phenol khi được thải rửa từ các nhà máy đều đi vào môi trường nước Chúng không những gây ô nhiễm môi trường sinh thái mà còn gây hại đến con người và các loài sinh vật sống trong nước Con người nếu tiếp xúc trong thời gian dài với các hợp chất Phenol có thể bị bệnh ung thư

Các kết quả nghiên cứu [ 38 ] cho thấy Phenol và dẫn xuất có độc tính cao Giá trị LC50 ( nồng độ gây chết 50 % số cơ thể người hay động vật khi cơ thể đó được đưa vào một lượng nhất định chất độc ) và EC50 ( nồng độ gây hại 50 % quần thể trong điều kiện thực nghiệm quan sát rõ ràng ) đối với giáp xác và cá vào khoảng 3 – 7 mg/l Những ảnh hưởng chính đến cơ thể con người gồm tác động đến tim, gây đau hệ hô hấp, gây nhiễm acid trong quá trình trao đổi chất, hỏng thận, sự tuần hoàn máu, ảnh hưởng hệ thần kinh… Liều thấp nhất có thể gây tử vong bằng đường tiêu hoá là khoảng 4.8 g và trong thời gian không quá 19 phút Những triệu chứng do hít phải Phenol như chán ăn, giảm cân, nhức đầu, chóng mặt…

Các hợp chất Phenol rất dễ bị phân hủy khi để ở nhiệt độ phòng, trong môi trường tự nhiên ( từ vài ngày đến một tuần ) và phân huỷ rất nhanh dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời Do vậy, trong quá trình xác định hay cất trữ, các hợp chất

Phenol cần được bảo quản trong bình chứa xẫm màu, để trong môi trường kín và có

nhiệt độ nhỏ hơn 4oC

1.1.2.2- Hàm lượng cho phép của Phenol và dẫn xuất trong nước

Bảng 1.2: Giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ Phenol và dẫn xuất

(mg/l)

nghiệp và nuôi trồng thủy sản

0.02 mg/l

Đổ vào các khu vực dùng làm nguồn nước cấp cho sinh hoạt

≤ 1 mg/l

Dùng làm nguồn nước tưới tiêu, bơi lội, nuôi trồng thủy sản

≤ 2 mg/l Nước thải

Không được phép đổ ra

Theo điều luật 80/778/EC do cộng đồng Châu Âu ban hành thì hàm lượng

Phenol tổng cộng được phép hiện diện trong nước uống là 0.5 μg/l và 0.1 μg/l cho

phần đơn giản và định lượng từng chất

Dựa vào ái lực của các cấu tử với pha động và pha tĩnh Pha động có thể là

chất lỏng hoặc khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký

có chứa pha tĩnh Pha tĩnh là chất được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất cần phân tích ở lại

Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động Sự tác động này đối với từng chất khác nhau do đó chất cần phân tích có thể ra nhanh hay chậm Ngoài ra cột sắc ký phải đủ dài để sự tiếp xúc giữa chất cần xác định và pha tĩnh được lặp lại nhiều lần Quá trình di chuyển của pha động bên trong cột sắc ký gọi là quá trình rửa giải

1.2.1.2- Phương pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ (GC-MS)

Dẫn xuất t-butyldimethylsilyl giữa các chất họ Phenol với butyldimethylsilyl) - N- methyl-trifluoroacetamid được xác định bằng phương pháp

N-(t-sắc ký khí với đầu dò khối phổ bẫy ion (IT-MS) Ở chế độ tiêm không chia dòng, 2μL mẫu xác định được cho vào cột DB-5 MS 30 m × 0.25 μm cùng với chương trình nhiệt thích hợp cho phép xác định 11 hợp chất Phenol trong nước sông và nước biển ở giới hạn phát hiện từ 0.010 μg/l đến 0.045 μg/l Tuy nhiên, phương pháp này không cho phép xác định 2,4-Dinitrophenol và hợp chất methyl Phenol ở hàm lượng vết

1.2.1.3- Phương pháp sắc ký lỏng với dầu dò khối phổ (LC-MS)

Các hợp chất Phenol thường được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế sắc ký phân bố pha đảo 15 hợp chất họ Phenol trong nước và bùn được xác định bằng phương pháp LC-MS ở chế độ ion hóa hóa học tại

áp suất thường (APCI) dưới dạng ion âm Với chương trình gradient dòng thích hợp cho pha động gồm Metanol, Acetonitrin, acid Acetic 0.005%, việc tách và định lượng đồng thời 15 hợp chất Phenol được tiến hành ở chế độ quét chọn lọc ion (SIM) Phương pháp này có ưu điểm là cho phép nhận danh chính xác các hợp chất Phenol nhờ đầu dò khối phổ, giới hạn phát hiện thấp trong khoảng từ 10-50 ng/l Tuy nhiên thiết bị phân tích lại đắc tiền

1.2.1.4- Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò UV

o-Cresol, m-Cresol, Phenol, Resorcinol, Cathechol và Hidroquinon trong nước tham gia phản ứng tạo dẫn xuất với Benzoyl clorua trong vòng 15 phút Các dẫn xuất Benzoyl này được chiết bằng dung môi Diethylether, sau đó được xác định

bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo ở bước sóng 232 nm với pha động gồm Acetonitrin-Tetrahydrofuran-nước (54:6:40,v:v:v) Phương pháp đơn giản này cho phép xác định hàm lượng Phenol trong rượu và nước uống với giới hạn phát hiện từ 0.05 đến 0.50 μg/l, hiệu suất thu hồi trong khoảng 81 - 94%, độ lập lại của phương pháp cao, thời gian phân tích ngắn

1.2.1.5- Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò điện hóa

Đầu dò điện hóa là một trong những đầu dò rất chọn lọc do mỗi chất có khả năng oxi hóa hoặc khử tại mỗi thế khác nhau

Đầu dò điện hóa được ứng dụng rộng rãi vì chúng đơn giản, không đắt tiền Tuy nhiên chúng có khuyết điểm là khó sử dụng, thời gian cân bằng rất dài, nhạy đối với tốc độ dòng và pH Bề mặt điện cực dễ bị nhiễm bẩn nên cần hoạt hóa lại điện cực sau một thời gian ngắn sử dụng

Nguyên tắc hoạt động của đầu dò điện hóa là tại một giá trị thế áp thích hợp, quá trình oxi hóa hay khử của chất điện hoạt tại bề mặt điện cực làm việc sẽ sinh ra dòng điện Dòng điện đó được sử dụng như tín hiệu phân tích và tín hiệu tỷ lệ trực tiếp với nồng độ chất điện hoạt đi qua đầu dò Dòng điện sinh ra trong pin điện hóa được tính theo định luật Faraday: Q = nFN

Q: Số Coulomb

n: số điện tử bị mất đi hoặc nhận được

N: số phân tử chất phân tích

F: 96500 C / 1 mol electron

Đầu dò điện hóa có gồm ba điện cực: điện cực chỉ thị, điện cực so sánh và

điện cực hỗ trợ Thế làm việc được đo giữa điện cực chỉ thị và điện cực so sánh

Nhờ vào hoạt tính điện cực của các hợp chất Phenol, phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 và đầu dò điện hóa thường được sử dụng để xác định hàm lượng vết các chất họ Phenol bằng các loại điện cực khác nhau Với thành phần pha động gồm dung dịch đệm có pH thích hợp và Acetonitrin hoặc Metanol, giá trị thế

áp ở điện cực làm việc lớn hơn +1V, cho phép xác định hàm lượng vết của các hợp chất Phenol trong nước và trong thực phẩm Các phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao và ít chất gây nhiễu

1.2.2-Phương pháp quang [ 5, 11, 13 ]

Phương pháp Trắc quang [ 13 ]: các hợp chất Phenol được cho phản ứng với Aminoantipyrin ở pH = 10 với sự hiện diện của Kali Hexacyanoferat (III) để tạo phẩm màu Antipyrin Đo độ hấp thu của dung dịch phẩm màu này trong pha nước ở bước sóng 510 nm, qua đó xác định được nồng độ của các hợp chất Phenol Phương pháp này có giới hạn phát hiện trong khoảng từ 2 μg/l đến 10 μg/l

Phương pháp Hoá phát quang [ 5 ]: các hợp chất Phenol làm giảm sự phát quang hoá học của p-Chlorobenzen Diazonium Fluoroborat ( p-CBDA ) khi có mặt

H2O2 trong môi trường kiềm Phản ứng giữa p-CBDA và H2O2 tạo ra hoá phát quang mạnh trong môi trường kiềm Các hợp chất Phenol có thể làm giảm cường độ hoá phát quang của phản ứng này và khi nồng độ các hợp chất Phenol tăng lên, cường độ hoá phát quang cũng giảm theo một cách tuyến tính Qua đó xác định được hàm lượng của các hợp chất Phenol có trong mẫu phân tích Giới hạn phát hiện của phương pháp này có thể đạt đến 1 μg/l

Phương pháp Huỳng quang [ 11 ]: các hợp chất Phenol bị kích thích và chuyển lên trạng thái năng lượng cao hơn Ở trạng thái kích thích, điện tử kém bền, chỉ tồn tại trong khoảng thời gian rất ngắn từ 10-13 đến 10-8 giây và có xu hướng giải phóng năng lượng đã hấp thu để trở về trạng thái cơ bản ban đầu Quá trình giải phóng năng lượng sẽ phát ra ánh sáng Đo lượng ánh sáng phát ra, qua đó xác định được hàm lượng của các hợp chất Phenol có trong mẫu phân tích Phương pháp huỳnh quang có khoảng tuyến tính từ 0.05 μg/l đến 18 μg/l và có giới hạn phát hiện

là 0.02 μg/l

1.2.3-Phương pháp cực phổ xung vi phân [ 28 ]

Trong dung dịch nền CaCl2, với sự hiện diện của các cation kim loại nặng như Chì và Cadimi, hàm lượng các hợp chất nitrophenol, dinitrophenol và các dẫn xuất nitrophenol khác trong mẫu nước sông và nước thải công nghiệp được xác định đồng thời bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với điện cực thủy ngân Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, độ nhạy cao, cho phép xác định đồng thời các kim loại nặng thường hiện diện trong nước thải Tuy nhiên việc sử dụng điện cực thủy ngân độc hại lại là một hạn chế đáng kể của phương pháp

1.3- Giới thiệu sơ lược về hệ thống sắc kí lỏng[ 3 - 4, 8, 17 – 23 ]

Sắc kí lỏng được dùng để tách hỗn hợp các chất có trong mẫu phân tích thành từng chất riêng biệt, qua đó định tính và định lượng được từng chất có trong mẫu Quá trình tách các chất dựa trên ái lực giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động Trong sắc kí lỏng, pha tĩnh và pha động đóng vai trò rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích

1.3.1- Một vài thông số quan trọng được sử dụng trong định tính và định lượng các chất phân tích

- Thời gian lưu TR: là thời gian từ lúc bắt đầu cho mẫu vào cột đến lúc mũi xuất hiện trong một điều kiện phân tích nhất định ( pha tĩnh, pha động, tốc độ dòng

… ) Một chất có thời gian lưu cố định và không phụ thuộc vào các thành phần khác

có trong mẫu Do vậy, thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho mỗi chất và được dùng để định danh trong kỹ thuật sắc kí

- Hệ số phân bố K : là tỷ số giữa nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh và nồng độ chất đó trong pha động

K = CS/CM

CS: Nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

CM: Nồng độ chất phân tích trong pha động

K càng lớn, chất phân tích càng có ái lực với pha tĩnh

- Hệ số dung lượng K’:

K’ = K x VS/VM

VS: Thể tích chiếm trong pha tĩnh

VM: Thể tích chiếm trong pha động

Nếu K’ > 20, thời gian rửa giải lâu, mũi bị bành rộng

Nếu K’ < 1, thời gian rửa giải nhanh, các mũi bị chập

- Số đĩa lý thuyết N: là tỷ số giữa chiều dài cột sắc kí với chiều cao đĩa lý thuyết

N = L / H L: Chiều dài cột sắc kí

H: Chiều cao đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao Ngoài ra, số đĩa lý thuyết còn được tính dựa trên sắc lí đồ

N = 16 x ( TR/WB )2

TR: Thời gian lưu của mũi sắc kí

WB: Bề rộng đáy của mũi sắc kí

- Độ phân giải RS: biểu thị khả năng tách của hai mũi trên sắc kí đồ

Với

TR,A , TR,B : Thời gian lưu của chất A và chất B ( phút )

WA, WB: Bề rộng đáy của mũi A và mũi B ( phút )

: 2 mũi tách được

: 2 mũi không tách được

Hai mũi tách hoàn toàn khi Rs > 1.5

Khi WA = WB và K’A - K’B

Với:

N: Số đĩa lý thuyết trung bình của 2 mũi A và B kế cận nhau

K’: Hệ số chứa trung bình của 2 mũi A và B kế cận nhau

Để tăng hệ số phân giải, cần phải thay đổi lần lượt 3 yếu tố:

Tăng hệ số chọn lọc " bằng cách chọn pha tĩnh thích hợp hoặc thay đổi thành phần pha động

Giảm hệ số chứa K’ bằng cách thay đổi khả năng rửa giải của dung môi

2

, ,

A B

A R B

R

T T

T − < +

N K

' 1

4 1

Tăng số đĩa lý thuyết N bằng cách tăng chiều dài cột ( chủ yếu dùng trong sắc kí khí ) hoặc giảm chiều cao đĩa lý thuyết

1.3.2- Các thiết bị trong hệ thống sắc kí lỏng được sử dụng để xác định Phenol và dẫn xuất

1.3.2.1- Hệ thống pha động

Dung môi pha động gồm một hoặc nhiều dung môi khác nhau để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột Có thể sử dụng chế độ đẳng dòng để rửa giải các chất trong quá trình phân tích Tuy nhiên, đối với hỗn hợp có nhiều chất phân tích bị chập và nhiều chất có thời gian lưu dài khi dùng chế độ đẳng dòng, ta có thể dùng chế độ gradient dòng để tách các chất phân tích bị chập và rút ngắn thời gian lưu của các mũi ra sau

Yêu cầu đối với pha động được dùng:

Dung môi chuyên dùng cho HPLC và được đuổi khí thật kĩ trước khi sử dụng

Không tương tác hoá học với pha tĩnh và làm thay đổi đặc tính của pha tĩnh

Không gây ảnh hưởng trong quá trình thu tín hiệu các chất phân tích

1.3.2.2- Hệ thống bơm

Bơm được dùng để cung cấp áp lực cần thiết giúp pha động di chuyển trong

hệ thống Bơm được sử dụng cho hệ thống HPLC để xác định các hợp chất Phenol

là bơm vừa hút vừa đẩy hai piston vì bơm này đạt một số yêu cầu sau:

Dòng chảy được loại bỏ xung

Tốc độ dòng chảy linh hoạt, thông thường từ 0.1 đến 10 ml/phút

Điều khiển tốc độ dòng chảy đúng

Có thể tạo ra áp suất cao (6000 psi )

Được làm từ chất liệu chống ăn mòn và chống dung môi

1.3.2.3- Bộ phận tiêm mẫu

Bộ phận tiêm mẫu bằng tay gồm 6 cổng và hai vị trí van bao gồm vòng Loop mẫu từ 20 đến 100 :l

Hình 1.1: Hệ thống vòng Loop tiêm mẫu

Có hai vị trí tiêm mẫu là vị trí A và vị trí B Vị trí A là vị trí trước khi tiêm mẫu Sau khi tiêm mẫu, van được chuyển sang vị trí B và pha động sẽ đưa mẫu vào cột Hệ thống tiêm mẫu này được dùng phổ biến hiện nay trong hệ thống sắc kí lỏng

vì thể tích mẫu tiêm vào có độ lặp lại cao

1.3.2.4- Cột sắc kí pha đảo

Trong HPLC, việc tách hỗn hợp các chất có trong mẫu phân tích thành từng chất riêng biệt được thực hiện bởi ái lực tương đối khác nhau giữa các hợp chất có trong mẫu phân tích với pha tĩnh của cột và pha động rửa giải

Hiện nay, cột sắc kí phân bố pha đảo thường được dùng trong hệ thống sắc kí lỏng để tách các chất phân tích Cột pha đảo có pha tĩnh là chất lỏng được gắn lên chất mang rắn Pha tĩnh được cấu tạo gồm một mạch alkyl ( -CH2-CH2-CH2-CH3 )

gắn lên một chất mang rắn, thường là silica

Hình 1.2: Cấu tạo của pha tĩnh dùng trong cột pha đảo

Có 3 loại mạch alkyl thường được dùng là C4, C8 và C18 Trong đó, C4

thường được dùng cho protein, C8 và C18 được dùng cho các phân tử nhỏ

1.3.2.5- Đầu dò điện hóa (ECD )

Đầu dò được dùng để xác định các hợp chất có trong mẫu phân tích khi ra khỏi cột Khi rửa giải, một hợp chất có trong mẫu sẽ thực hiện một phản ứng oxi-hoá hay phản ứng khử tại bề mặt điện cực chỉ thị và được xác định như một mũi trong sắc kí đồ

Thời gian lưu của mũi trong điều kiện nhất định được dùng để nhận danh hợp chất Chiều cao, diện tích mũi tương ứng với lượng hợp chất có trong mẫu Một đầu dò lý tưởng phải có những đặc tính sau: độ nhạy, độ ổn định, độ đáp ứng cao, khoảng tuyến tính rộng, thời gian đáp ứng ngắn, dễ hoạt động… Và điện cực Glassy carbon có thể đáp ứng các điều kiện này Ngoài ra, điện cực Glassy carbon cho tín hiệu cao tại thế làm việc thấp, khoảng thế làm việc rộng, bền cơ học và khả năng chịu dung môi cao

Để chất phân tích trong dung dịch đến thực hiện một phản ứng oxi-hoá hay phản ứng khử tại bề mặt điện cực chỉ thị, nó phải hoàn tất một quá trình gồm 3 bước sau:

Bước 1: Chất phân tích khuếch tán đến bề mặt điện cực chỉ thị: sự khuếch tán trong chất lỏng tại nhiệt độ phòng tương đối chậm, do vậy nhiệt độ đầu dò thường được duy trì ở mức cao hơn 5 độ C so với nhiệt độ phòng Hệ số khuếch tán pha lỏng có giá trị từ 1 đến 10x10-6 cm/sec2

Bước 2: Chất phân tích thực hiện một phản ứng oxi-hoá hoặc phản ứng khử trên bề mặt điện cực chỉ thị

Bước 3: Chất phân tích khuếch tán ra khỏi bề mặt điện cực chỉ thị

Khi vận tốc pha động và độ dày lớp khuếch tán không đổi, dòng điện sẽ tỷ lệ với nồng độ chất phân tích Khi hệ số phân bố K, hệ số dung lượng K’ và độ phân giải RS của cột không đổi, chiều cao và diện tích mũi tương ứng với nồng độ chất phân tích được tiêm vào cột

- Phản ứng của Phenol trên điện cực chỉ thị và các yếu tố ảnh hưởng

Các hợp chất Phenol dễ bị oxi hóa Tại một thế thích hợp trên điện cực chỉ thị, các hợp chất Phenol bị oxi hóa thành các gốc tự do Phenoxy [ 23 ] và được khuếch tán ra khỏi bề mặt điện cực

Hình 1.3

Gốc tự do Phenoxy

: Phản ứng của Phenol trên điện cực chỉ thị Glassy carbon Đầu dò Điện hóa có độ chọn lọc cao, chỉ những hợp chất có khả năng điện hoạt mới phản ứng trên trên điện cực chỉ thị, do đó khả năng gây ảnh hưởng lên quá trình xác định các hợp chất Phenol sẽ giảm đi Trong mẫu xác định không được chứa các muối vô cơ vì các muối này sẽ phản ứng tạo thành kim loại rắn và bám lên

bề mặt điện cực chỉ thị, khi đó sẽ làm giảm độ nhạy trong quá trình phân tích

- Một số lưu ý khi dùng đầu dò điện hoá

Khi sử dụng đầu dò điện hoá, một số vấn đề sau cần làm và cần tránh để không làm hư điện cực trong quá trình sử dụng:

Dung môi động phải được đuổi khí Oxi thật kỹ bằng máy đuổi khí chuyên dụng vì trong dung môi động có khí Oxi và sẽ làm hư điện cực trong quá trình sử dụng

Trong dung dịch pha động luôn chứa ion Cl- với nồng độ nhất định, phù hợp với điều kiện làm việc Nếu không sẽ làm hư điện cực so sánh

Rửa điện cực khi thấy độ nhạy bị giảm xuống Quá trình rửa điện cực được thực hiện như sau:

- Rửa và làm sạch bề mặt điện cực bằng dung dịch kim cương ( diamond slury ) và bộ rửa chuyên dụng

- Tạo kết tủa AgCl trên điện cực so sánh bằng dung dịch chuyên dụng

- Điện cực tiếp tục được rửa bằng acid Nitric 10-2 M tại tốc độ dòng là 0.2 ml/phút

- Quét thế để làm sạch bề mặt điện cực Thế quét từ (-) 500 mV đến(+)1.2 V

- Rửa lại bằng nước cất hai lần đến trung tính

Quá trình làm sạch điện cực như trên đã cho kết quả phân tích có độ lặp lại tốt ( độ lệch nhỏ hơn 5 % ) giữa ba lần rửa điện cực Thời gian sử dụng điện cực trước khi làm sạch khoảng 300 giờ

Đầu dò Điện hoá có thời gian để ổn định dài Thông thường, để đầu dò Điện hoá ổn định phải mất từ 90 đến 120 phút

1.4- Giới thiệu sơ lược về chiết pha rắn SPE [ 28 - 37 ]

Kỹ thuật chiết pha rắn đã được phát triển mạnh trong thời gian gần đây để tách làm giàu trước khi xác định các chất ô nhiễm hữu cơ độc hại trong môi trường

Cơ sở lý thuyết của kỹ thuật chiết pha rắn chính là sự kết hợp giữa chiết lỏng và tách sắc ký

Khi nồng độ chất phân tích trong mẫu thật nhỏ, việc làm giàu là rất quan trọng Kỹ thuật SPE có ưu điểm so với phương pháp chiết lỏng-lỏng cổ điển là ít tiêu tốn dung môi, qui trình chiết nhanh, đơn giản, hiệu suất chiết cao, độ chọn lọc tốt hơn

Để đảm bảo quá trình chiết pha rắn cho kết quả phân tích tốt, quá trình chuẩn

bị chiết pha rắn cần được thực hiện qua 5 giai đoạn cơ bản sau:

Tính chất của chất phân tích như độ phân cực, kích thước phân tử … cần phải được biết rõ để lựa cho cột chiết pha rắn phù hợp

Chất phân tích tồn tại trong môi trường: nước, dung môi hữu cơ hay một môi trường khác để lựa cho cột chiết phù hợp

Cột chiết pha rắn được hoạt hoá bằng một dung môi hữu cơ phân cực và được cân bằng bằng nước hay đệm Sau đó, cho dung dịch mẫu cần phân tích qua cột

Rửa tạp chất có trong mẫu bằng nước, đệm hay dung môi hữu cơ phân cực Rửa giải chất phân tích bằng dung môi hữu cơ phân cực hay không phân cực

Trong cột chiết pha đảo, nước là dung môi rửa giải yếu nhất Một số dung

môi hữu cơ thường được dùng để rửa giải là: Methylenchloride, EthylAcetate,

Acetonitril, Methanol…

Hiện nay có 2 cách làm giàu trên cột chiết pha rắn là làm giàu trực tiếp và

làm giàu gián tiếp

1.4.1- Kỹ thuật chiết pha rắn gián tiếp

Các hợp chất phenol phân cực trong nước thường được chiết và làm giàu

trên pha tĩnh các loại pha tĩnh khác nhau như C18, Carbopack, Polydivinylbenzen,

Polydivinylbezen-N-vinylpyrolidon HLB Oasis [ 26 ], hoặc trên pha tĩnh Polyme

Styren-divinylbezen như EnviChrom P, LiChrolut EN… [ 27- 29] Gần đây, việc

nghiên cứu chế tạo các pha tĩnh mới như Polystyren-divinylbenzen có bổ sung

nhóm phân cực carboxylic nhằm nâng cao hiệu suất chiết các chất Phenol có độ

phân cực cao [34] Sau khi rửa giải với dung môi thích hợp như Acetonitril,

Methanol, Dicloromethan, các hợp chất Phenol định lượng bằng phương pháp sắc

ký với đầu dò UV, khối phổ, điện hóa…

1.4.2- Kỹ thuật chiết pha rắn trực tiếp

Kỹ thuật này cho phép làm giàu trực tiếp và xác định đồng thời các hợp chất

phenol trong quá trình phân tích Mẫu sau khi được làm giàu trên pha tĩnh SPE, pha

động rửa giải và vận chuyển các chất này đến cột phân tích để tách và định lượng

các chất cần phân tích bằng đầu dò thích hợp Phương pháp này có ưu điểm hơn so

với phương pháp chiết pha rắn thông thường là ít tiêu tốn dung môi, đơn giản và

việc phân tích có thể tiến hành hoàn toàn tự động Tuy nhiên, kỹ thuật này có thể

dẫn đến sự bành rộng của các mũi phân tích trên sắc ký đồ nếu pha tĩnh dùng trong

SPE có tính chất khác với pha tĩnh dùng để chế tạo cột phân tích Gần đây việc chế

tạo pha tĩnh thích hợp cho kỹ thuật này là một lĩnh vực nghiên cứu rất được quan

tâm Pha tĩnh polyme có bổ sung nhóm Benzoyl [31-32] được dùng để làm giàu và xác

định trực tiếp hàm lượng vết các hợp chất Phenol cũng như thuốc trừ sâu trong

nước

PHẦN THỰC NGHIỆM

+ Đầu dò điện hoá ECD Waters 2465

+ Cột sắc kí pha đảo Phenominex C18 Kích thước cột: 150 x 2.00

mm, kích thước pha tĩnh: 5 micron

- Cột chiết SPE Strata C18 500 mg, 6 ml

- Máy bơm chân không

- Máy siêu âm và đuổi khí

- MethylenCloride ( PA, Labscan, Ireland )

- Dietyl Eter (PA, Labscan, Ireland )

- n-Hexan (PA, Labscan, Ireland )

- Acid Acetic, Sodium Acetate (PA, Labscan, Ireland )

- Potasium cloride KCl ( Paranitrophenol, Mersk, Đức )

- Muối Na2SO3 (PA, Labscan, Ireland )

- Khí N2 99% dùng để đuổi dung môi hữu cơ

- Nước cất hai lần

- Đệm Acetate được chuẩn bị bằng cách cân 2.0407 g

CH3COONa.3H2O, pha trong 500 ml nước cất 2 lần rồi chỉnh về pH 5 bằng Acid Acetic, sau đó cho qua giấy lọc 0.45 :m

- Dung dịch KCl 0.5 M được chuẩn bị bằng cách cân 18.625 g KCl hòa tan trong 500 ml nước cất 2 lần, sau đó cho qua giấy lọc 0.45 :m

- Các chất chuẩn gốc Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, p-Nitrophenol, 2-Clorophenol, o-Nitrophenol có nồng độ 500 µg/ml được chuẩn bị bằng cách cân một lượng chính xác chất chuẩn rồi hòa tan trong 100 ml hỗn hợp dung môi Nước : Acetonitril ( 1:1 / v:v ) Dung dịch khảo sát được pha lõang từ dung dịch gốc với Nước : Acetonitril ( 1:1 / v:v ) đến nồng độ cần sử dụng

Trong quá trình thực nghiệm, nồng độ ( µg/ml ) các hợp chất Phenol chuẩn được

sử dụng là 5.0, 2.0, 1.2, 0.9 … µg/ml Đây là các nồng độ gần đúng, nồng độ đúng của các hợp chất Phenol được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1: Giá trị nồng độ đúng của các hợp chất Phenol chuẩn

Nồng độ

Resorcinol 0.1004 0.0502 0.01004 0.00502 0.002008 0.001004Pyrocatechol 0.0992 0.0496 0.00992 0.00496 0.001984 0.000992Phenol 0.0996 0.0498 0.00996 0.00498 0.001992 0.000996ParaNitroPhenol 0.1014 0.0507 0.01014 0.00507 0.002028 0.0010142-cloroPhenol 0.1 0.05 0.01 0.005 0.002 0.001 OrtoNitroPhenol 0.1026 0.0513 0.01026 0.00513 0.002052 0.001026

2.1.3- Nội dung nghiên cứu

Khảo sát và tối ưu thành phần pha động

Khảo sát và tối ưu hoá các thông số vận hành máy

Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Khảo sát tối ưu quy trình chiết và làm giàu các hợp chất Phenol

Ứng dụng quy trình xác định các hợp chất Phenol trong mẫu nước

2.1.4- Phương pháp nghiên cứu

Nhờ vào hoạt tính điện hoạt của các hợp chất Phenol, phương pháp sắc kí phân bố pha đảo với đầu dò điện hoá sử dụng điện cực Glassy Carbon vừa phát huy được thế mạnh của phương pháp cực phổ và sắc kí lỏng, vừa giảm được tính độc hại của phương pháp cực phổ cổ điển Ngoài ra phương pháp này còn có ưu điểm so với phương pháp sắc kí khí với đầu dò khối phổ thường được dùng để xác định các hợp chất Phenol là thiết bị dùng để phân tích đơn giản và rẻ tiền hơn

2.2- Kết quả và thảo luận

2.2.1- Phương pháp sắc kí phân bố pha đảo với chế độ đẳng dòng

2.2.1.1- Khảo sát và tối ưu hoá tỉ lệ thành phần pha động

Các hợp chất Phenol thường được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao theo cơ chế sắc kí phân bố pha đảo Thời gian lưu của các hợp chất phụ thuộc chủ yếu vào sự tương tác ái dầu giữa mạch carbon của pha tĩnh và dây carbon của chất cần xác định Thời gian lưu tăng theo tính ái dầu của chất phân tích Mặt khác, khả năng phân ly của chất phân tích cũng có ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu Các hợp chất phân ly thành ion sẽ được rửa giải trước các hợp chất trung tính

Do đó, dung dịch nghiên cứu trong phần khảo sát này gồm các hợp chất Phenol có

độ phân cực khác nhau như Phenol, p-Nitrophenol, 2,4,6-triclorophenol, 2,3,5,6- Tetraclorophenol Việc tối ưu hoá thành phần pha động trên cơ sở đảm bảo khả năng tách của mũi Phenol và p-Nitrophenol nhưng thời gian lưu của 2,4,6- Triclorophenol và 2,3,5,6-Tetraclorophenol không quá dài

Thứ tự rửa giải của các hợp chất trên sắc kí đồ và độ chọn lọc của phương pháp sắc kí thay đổi theo thành phần pha động trong sắc kí phân bố pha đảo, pha động thường là hỗn hợp dung dịch đệm và các dung môi hữu cơ như Acetonitril ( ACN ) hoặc Methanol ( MeOH ) Để tối ưu thành phần pha động, một số hỗn hợp dung môi có thành phần được nêu ở Bảng 2.2 đã được khảo sát Kết quả khảo sát được biễu diễn trên các Hình 2.1, 2.2, 2.3, 2.4

Bảng 2.2: Thành phần các pha động được khảo sát

Thành phần pha động STT

Hình 2.1: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l Mũi 1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Triclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol Pha động: H2SO4 (ở các nồng độ khác nhau)-MeOH (60:40,v/v) Tốc độ dòng: 0.2ml/phút Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V

Hình 2.2: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l Mũi1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Nriclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol Pha động:

H2SO4 5mM-dung môi (MeOH hoặc ACN) (60:40,v/v) Tốc độ dòng: 0.2ml/phút Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V

Hình 2.3: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l Mũi1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Triclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol Pha động: Đệm (ở các pH khác nhau)-ACN (55:45,v/v) Tốc độ dòng: 0.2ml/phút Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V

Hình 2.4: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l Mũi1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Triclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol Pha động: đệm pH5:ACN:MeOH (55:40:5,v/v/v)) Tốc độ dòng: 0.2ml/phút Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V

Kết quả khảo sát cho thấy:

Khi pha động có thành phần gồm Methanol và H2SO4, nồng độ acid cao hơn

có thời gian lưu của các hợp chất Clorophenol dài hơn (> 3000 giây) đồng thời các mũi này bị bành rộng, do đó độ nhạy cũng kém hơn so với kết quả thu được từ pha động có môi trường pH cao (Hình 2.1)

Dựa vào kết quả khảo sát trên, pha động có pH cao hơn được chọn Tuy nhiên các mũi đều có thời gian lưu tương đối dài Do đó acid H2SO4 có nồng độ 5mM, đệm Acetate ở pH 4, 5 và Acetonitril ( Acetonitril thay cho Methanol để tăng khả năng rửa giải của dung môi pha động do có độ phân cực thấp hơn Methanol ) được chọn cho những khảo sát tiếp theo (Hình 2.1, 2.2, 2.3) Kết quả thực nghiệm cho thấy khả năng tách tốt, thời gian lưu của các mũi ngắn hơn, độ nhạy của tín hiệu thu được tốt với thành phần pha động gồm Acetonitril và đệm Acetate ở pH 5 Tuy nhiên, hai mũi Phenol và p-Nitrophenol bị chập với nhau (Hình 2.3) Do đó, khả năng rửa giải của dung môi pha động cần được giảm lại bằng cách thay một phần Acetonitril bằng Methanol

Bảng 2.2 cho thấy thành phần pha động gồm hỗn hợp dung môi Acetonitril, Methanol và đệm Acetate pH 5 cho kết quả thu được tối ưu Thời gian lưu của các hợp chất Clorophenol không quá dài, độ nhạy của các mũi vẫn đảm bảo và hai mũi Phenol và p-Nitrophenol tách được với nhau (Hình 2.4)

Sau đó, thành phần pha động gồm đệm Acetate pH 5 / Acetonitril / Methanol tiếp tục được tối ưu hoá bằng cách thay đổi tỷ lệ trong hỗn hợp pha động đồng thời tăng số lượng các hợp chất Phenol để đảm bảo dung môi pha động tách tốt các mũi với nhau

Dung dịch nghiên cứu gồm Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, p-Nitrophenol, o-Nitrophenol, 2,4,6-Triclorophenol, 7: 2,3,5,6-Tetraclorophenol với pha động gồm Acetonitril, Methanol và Đệm Acetat pH 5 được khảo sát ở nhiều tỉ lệ khác nhau với độ phân cực tăng dần Kết quả khảo sát được biểu diễn ở Bảng 2.3 và các Hình 2.5, 2.6, 2.7

Bảng 2.3: Tỉ lệ các pha động khảo sát

Thành phần pha động (v/v/v) STT

Hình 2.5: Sắc ký đồ của hợp chất Phenol 1mg/l Mũi1: Resorcinol, 2: Pyrocatechol , 3: Phenol, 4: p-Nitrophenol, 5 : o-Nitrophenol, 6: 2,4,6-Triclorophenol, 7: 2,3,5,6-Tetraclorophenol Pha động (A): đệm pH5:ACN:MeOH (55:40:5, v/v/v), pha động (B): đệm pH5:ACN:MeOH (55:35:10,v/v/v) Tốc độ dòng: 0.2ml/phút Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V

Do vậy, độ phân cực của dung môi pha động được tăng lên bằng cách thay thế một phần dung môi Acetonitril bằng đệm Acetate pH 5 Hỗn hợp đệm pH5:ACN:MeOH (65:25:10,v/v/v) được khảo sát Tuy nhiên hai mũi Resorcinol và Pyrocatechol vẫn chưa tách được với nhau Tiếp tục thay một phần dung môi Methanol bằng đệm Acetate pH 5, với pha động gồm đệm pH5:ACN:MeOH (70:25:5,v/v/v) các hợp chất Phenol được tách tốt với nhau Kết quả được biễu diễn trên Hình 2.6

Hình 2.6: Sắc ký đồ của hợp chất phenol 1mg/l Mũi1: Resorcinol, 2: Pyrocatechol , 3: Phenol, 4: p-Nitrophenol, 5 : o-Nitrophenol, 6: 2,4,6-Triclorophenol, 7: 2,3,5,6-Tetraclorophenol Pha động (A): đệm pH5:ACN:MeOH (65:25:10, v/v/v), pha động (B): đệm pH5:ACN:MeOH (70:25:5,v/v/v) Tốc độ dòng: 0.2ml/phút Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V

Bảng 2.4 cho thấy hỗn hợp dung môi pha động gồm đệm Acetate

pH5:ACN:MeOH ( 70:25:5,v/v/v ) có độ phân giải của các hợp chất Phenol là tốt

nhất, các mũi đều tách tốt với nhau ( hai mũi tách tốt khi có độ phân giải lớn hơn

1.2 )

Bảng 2.4: Độ phân giải Rs với các pha động khác nhau

Kết quả thực nghiệm cho thấy thành phần pha động gồm đệm pH5:ACN:MeOH theo tỉ lệ 70:25:5 (v/v/v) là phù hợp nhất Kết luận trên này được minh chứng bằng sắc ký đồ Hình 2.7 biểu diễn khả năng tách của 11 hợp chất Phenol

Do đó, pha động gồm đệm Acetate pH5:ACN:MeOH theo tỉ lệ 70:25:5 (v/v/v) được chọn làm pha động tối ưu cho tất cả các khảo sát tiếp theo

2.2.1.2- Khảo sát các thông số vận hành máy

Theo tài liệu [31,34 ], khi chạy chương trình Gradient dòng, độ ồn của đường nền cao, độ nhạy của các mũi bị giảm dần trong quá trình phân tích và mất nhiều thời gian cho lần chạy tiếp theo Điều này do một số nguyên nhân sau:

Do tốc độ dòng của dung môi pha động nhỏ nên bất kì sự thay đổi nào trong thành phần pha động, dù nhỏ, cũng làm ảnh hưởng đến phản ứng trên bề mặt của điện cực chỉ thị Khi đó sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định, độ ồn của đường nền và độ nhạy của điện cực chỉ thị Khi chạy chương trình Gradient dòng với thành phần pha động luôn thay đổi sẽ làm tăng độ ồn, làm giảm độ ổn định của đường nền và độ nhạy của điện cực chỉ thị Điều này làm ảnh hưởng đến tuổi thọ của đầu dò Điện hoá trong quá trình sử dụng

Để phản ứng trên bề mặt điện cực chỉ thị ổn định sau khi áp thế phải mất từ 90 đến 120 phút trong điều kiện thành phần pha động không đổi hoặc thay đổi rất ít Trong chương trình Gradient dòng, sau mỗi lần phân tích, thành phần pha động được trả về tỷ lệ ban đầu, khi đó sẽ mất nhiều thời gian cho lần phân tích tiếp theo

Do vậy chúng tôi không áp dụng chế độ Gradient dòng trong các quá trình khảo sát tiếp theo mà chỉ thực hiện với chế độ đẳng dòng

- Khảo sát tốc độ dòng

Sự thay đổi của tốc độ dòng ảnh hưởng đến áp suất áp vào cột, thời gian lưu

và bề rộng đáy của mũi sắc kí Tốc độ dòng nhỏ làm tăng thời gian lưu và bề rộng đáy của mũi sắc kí Tốc độ dòng lớn làm tăng áp suất trên cột và do đó làm giảm tuổi thọ của cột phân tích Việc chọn tốc độ dòng thích hợp sẽ giúp tách tốt các chất phân tích trong thời gian tối ưu và tăng tuổi thọ của cột Kết quả khảo sát tốc độ

dòng trên Resorcinol nồng độ 1 mg/l được biểu diễn trên Bảng 2.5, Hình 2.8 và Hình 2.9

Bảng 2.5: Kết quả khảo sát tốc độ dòng trên Resorcinol nồng độ 1 mg/l

Tốc độ

dòng

( ml/phút)

Thời gian lưu ( giây )

Bề rộng đáy ( giây )

Chiều cao mũi (Vôn )

Diện tích mũi ( ĐVDT )

Ap suất cột ( Psi )

0 100

Kết luận: Tăng tốc độ dòng làm giảm thời gian lưu và độ bành rộng của peak đồng thời làm tăng áp suất trên cột Chọn tốc độ dòng tối ưu ở 0.2 ml/phút Đây cũng là tốc độ dòng tối đa của nhà sản xuất cho phép khi sử dụng cột

- Khảo sát thế điện cực Glassy carbon

Giá trị của thế cao nhất cho phép sử dụng trên điện cực Glassy carbon là 1.3V Bên cạnh đó, giá trị thế sử dụng có ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy của phép xác định Giá trị thế thấp sẽ làm giảm độ nhạy do cường độ tín hiệu đo giảm nhưng nếu thế sử dụng quá cao sẽ làm tăng tín hiệu nền và dẫn tới tỉ lệ S/N giảm Kết quả khoảng thế điện cực khảo sát từ 0.9V đến 1.1V cho các hợp chất Phenol nồng độ 1mg/l được biểu diễn ở Bảng 2.6, Hình 2.10

Bảng 2.6: Kết quả khảo sát khoảng thế áp đến diện tích của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1 mg/l

: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thế áp đến diện tích mũi của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1 mg/l Pha động: đệm Acetate pH 5 / ACN / MeOH ( 70/25/5, v/v/v ) Tốc độ dòng 0.2 ml/phút

Kết luận: Từ kết quả thu được, ta thấy các hợp chất Phenol có diện tích mũi cao nhất ở thế áp +1.1V Do đó +1.1V được chọn làm thế áp tối ưu cho các khảo sát tiếp theo