Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin c trong giấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

1 LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường Đại H ọc Công Nghiệp Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em đ ược h ọc t ập, nghiên cứu hồn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân thành sâu sắc tới th ầy giáo Ths.Nguyễn Mạnh Hà – thầy người trực tiếp giao đề tài tận tình bảo hướng dẫn giúp đỡ em thời gian làm khóa luận Và th ầy giáo mơn hóa phân tích khoa Cơng Nghệ Hóa tr ường Đ ại H ọc Cơng Nghiệp Hà Nội tận tình bảo em suốt trình h ọc t ập trường Trong trình làm báo cáo, thời gian nghiên cứu h ạn ch ế nên em tránh khỏi thiếu sót.Vì vậy, em mong nhận đ ược ý kiến đóng góp thầy giáo, anh chị bạn để báo cáo c em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội,Tháng năm 019 Sinh viên MỤC LỤC Danh mục hình ản Hình 1.1 Hình ảnh chuối 16 Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng có 100g chuối 17 Hình 1.3 Hình ảnh chuối 19 Hình 1.4: Viên sủi chứa vitamin C 26 Hình 1.5: Thời gian lưu HPLC .29 Hình 1.6: Giản đồ tách hai pic sắc ký A B 32 Hình 1.7: Sơ đồ thể ảnh hưởng lực rửa giải 33 Hình 1.8: Quá trình tách sắc ký chất 34 Hình 1.9: Sơ đồ hệ thống HPLC .34 Kí hiệu, chữ viết tắt AOAC Hiệp hội nhà báo phân tích th ức (Acconciation of Official Analytical Chemists) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam ISO Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế (Iternational Standars Organization) C Nồng độ H Chiều cao pic S Diện tích pic W Chiều rộng pic HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao RP- HPLC Sắc kí hấp thụ pha đảo STT Số thứ tự Thời gian lưu UV Tử ngoại V Thể tích VIS Khả kiến m Khối lượng LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường Đại H ọc Công Nghiệp Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em đ ược h ọc t ập, nghiên cứu hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân thành sâu sắc tới th ầy giáo Ths.Nguyễn Mạnh Hà – thầy người trực tiếp giao đề tài tận tình bảo hướng dẫn giúp đỡ em thời gian làm khóa luận Và th ầy giáo mơn hóa phân tích khoa Cơng Nghệ Hóa tr ường Đ ại H ọc Công Nghiệp Hà Nội tận tình bảo em suốt trình h ọc t ập trường Trong trình làm báo cáo, thời gian nghiên cứu h ạn ch ế nên em tránh khỏi thiếu sót.Vì vậy, em mong nhận đ ược ý kiến đóng góp thầy giáo, anh chị bạn để báo cáo c em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội,Tháng năm 019 Sinh viên MỞ ĐẦU 1.Lí chọn đề tài: Trong loại thực phẩm lên men, giấm loại gia vị phổ biến nh ất, có mặt thường xuyên bữa ăn hàng ngày Trong công nghi ệp thực phẩm, giấm dùng làm chất điều vị tạo hương bảo quản Trong y học, giấm sử dụng loại đồ uống hỗ trợ điều trị bệnh sử dụng làm chất tiệt trùng, tác nhân làm sạch,… Giấm đ ược s ản xuất từ ngun liệu có nguồn gốc nơng, nghiệp phù h ợp, có ch ứa tinh bột, đường tinh bột đường trình lên men đôi, t ạo c ồn axit axetic Giấm loại gia vị truyền thống có tính acid, đ ược s ản xu ất rộng rãi từ gạo, mạch nha, táo,chuối, dạng rượu vang khác vật liệu nông nghiệp Giấm sản xuất từ hoa lên men cách tự nhiên, có ưu điểm ngồi thành phần chủ yếu axit axetic có thêm thành ph ần chất dinh dưỡng khác như: đường, axit hữu cơ, acidamin, vitamin, muối vô cơ,các nguyên tố vi lượng,… tốt cho sức khỏe người tiêu dùng Giấm hoa có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, t ốt cho s ức khỏe, có tác dụng làm đẹp Nước ta nước nơng nghiệp, có nguồn sản ph ẩm nông nghiệp dồn táo, chuối ,… Tuy nhiên, đầu c s ản ph ẩm hoa chưa giải Phần lớn hoa nước ta chủ yếu để phục vụ nhu cầu ăn uống người tiêu dùng Nh ằm góp ph ần làm phong phú, đa dạng sản phẩm dấmvà m ột h ướng tiêu th ụ, giải đầu cho sản phẩm hoa sản xuất gi ấm t loại hoa 10 Trong chuối chứa nhiều chất dinh dưỡng nh ư: ch ất x ơ, chất chống oxy hóa dinh dưỡng thực vật Chuối chứa số vitamin, acid amin khoáng chất với số lượng lớn bao gồm: kali, mangan, vitamin B6 vitamin C Bên cạnh chuối chứa ch ất béo bão hòa, cholesterol natri, tốt cho tim mạch Nên sản xuất giấm hoa từ nguyên liệu chuối Lợi sản phẩm có nguồn nguyên liệu dồi phong phú, giải đượcvấn đề đầu cho sản ph ẩm hoa quả, tạo công ăn việc làm cho người dân Sản phẩm gi ấm hoa qu ả tạo giàu chất dinh dưỡng, tốt cho sức khỏe người tiêu dùng, mùi v ị thơm ngon, có hương vị đặc trưng chuối Chính th ị trường xuất thêm nhiều thương hiệu giấm khác nhu cầu sử dụng người tiêu dùng ngày tăng Do đ ể tăng l nhuận số nhà sản xuất việc sản xuất giấm t nh ững quy trình lên men tự nhiên có sản phẩm pha chế từ axit acetic… gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Vì em chọn đề tài “Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin C giấm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao” Mục đích nhiên cứu, đối tượng phạm vi nghiên cứu, ý nghĩa đề tài - Mục đích nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin C giấm - Đối tượng nghiên cứu: Chuối sử dụng để chuy ển đổi glucose thành rượu ethylic Lên men acetic bước q trình lên men, phân tử rượu oxy hóa thành acid acetic tác động vi khuẩn Acetobacter acetic tạo hương vị giấm đặc trưng - Phạm vi nghiên cứu: Trong phòng thí nghiệm - Ý nghĩa khoa học: 41 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HĨA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 2.1.1 Hóa chất 2.1.1.1 Chất chuẩn Vitamin c - Nhà sản xuất: Bệnh viện kiểm nghiệm Trung ương 2.1.1.2 Dung môi Nước cất- Nhà sản xuất: Merk KGAaA Đức- Tiêu chuẩn: dùng cho HPLC 2.1.1.3 Các hóa chất khác Axit Photphoric- Nhà sản xuất: Merk KGAaA Đức - Tiêu chuẩn: dùng cho HPLC Kali đihrrophotphat- Nhà sản xuất: Merk KGAaA Đức - Tiêu chuẩn dùng cho HPLC 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 2.2.2.1 Dụng cụ - Bình định mức: 10, 25, 500, 1000 (ml) - Micropipet: 10-100 (µl) - Cốc thủy tinh: 50, 100 (ml) - Bình tia, giấy đo pH - Giấy bạc 42 2.2.2.2 Thiết bị - Máy sắc kí lỏng hiệu cao Agilent Technologies 1260 InfinityXuất xứ: Mỹ - Cột sắc kí ZORBAX Eclipse XDB- C18- Xuất xứ: Mỹ - Tủ sấy Memmert UN110- Xuất xứ: Đức - Cân phân tích Sartorius TE214S- Xuất xứ: Đức - Máy rung siêu âm Elmasonic S300H- Xuất xứ: Đức Hình 2.1: Máy sắc kí lỏng hiệu cao Agilent Technologies 1260 Infinity 2.2 THỰC NGHIỆM 2.2.1 Dựng đường chuẩn định lượng vitamin C Lập đường chuẩn thơng qua mẫu vitamin C chuẩn có nồng độ 0,05 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,4 mg/ml;0,8 mg/ml; mg/ml Tiến hành pha dãy chuẩn sau:  Pha dung dịch vitamin C chuẩn có nồng độ 100 mg/l : cân 1g vitamin C chuẩn pha 100 ml hệ dung môi ( 100% đệm photphat 43 pH= 2,5), hòa tan hồn tồn định mức thành 100ml Lọc dung dịch qua đầu lọc mẫu 0,45 µm dung dịch  Pha loãng dung dịch thành nồng độ : Thể tích hút 0,005 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 dd (ml) V định mức 10 10 10 10 10 10 10 (ml) Nồng độ 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 (mg/ml) Sau đem chạy HPLC thu diện tích pic tương ứng Từ xây dựng đường chuẩn - mối quan hệ diện tích pic với nồng độ 2.2.2: Xác định độ (độ thu hồi) phương pháp Trong nhiều trường hợp tìm áp dụng ph ương pháp tiêu chuẩn để so sánh kết quả, dễ dàng có mẫu chuẩn mẫu chuẩn chứng nhận phù h ợp v ới phương pháp Việc xác định độ có th ể th ực thơng qua xác định độ thu hồi (còn gọi độ tìm lại) ph ương pháp Thêm lượng chất chuẩn xác định vào mẫu th mẫu tr ắng, phân tích mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo cơng th ức sau đây: Đối với mẫu thử, độ thu hồi (R): Trong đó: R: độ thu hồi (%) : nồng độ chất phân tích mẫu thêm chuẩn : nồng độ chất phân tích mẫu thử : nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Kết xác định độ thu hồi so sánh với tiêu chuẩn AOAC 44 2.2.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Nếu có phương trình đường chuẩn: y = ax+b, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) xác định sau  Giới hạn phát (LOD): Giới hạn phát nồng độ mà giá trị xác định lớn độ không đảm bảo đo phương pháp [16] Là nồng độ thấp chất phân tích mẫu phát khơng thiết xác định hàm lượng điều kiện thí nghiệm LOD = Trong đó: (11) SD: Độ lệch chuẩn tín hiệu theo b α : hệ số góc phương trình hồi quy  Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ nồng độ thấp chất phân tích mẫu định lượng với độ chụm độ chấp nhận điều kiện tiến hành phân tích LOQ = Trong đó: (12) SD: Độ lệch chuẩn tín hiệu theo b α: hệ số góc phương trình hồi quy  Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Độ lệch chuẩn (s) n s � x i 1 i  x n 1 (13) Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) RSD  s x (14) 45 2.2.3 Chuẩn bị mẫu, chạy sắc ký HPLC  Tất mẫu đem pha loãng mẫu đệm kali hidrophotphat  Hút xác ml mẫu pha lỗng cho vào bình định mức 10ml thêm pha động đến vạch Lọc lấy dung dịch qua đầu lọc 0,45 µm, dung dịch thu đem phân tích phương pháp HPLC Dựa vào đường chuẩn diện tích pic thu sắc ký đồ mẫu thử để tính hàm lượng vitamin C thực tế tổng hợp 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 CÁC THƠNG SỐ CHẠY HPLC Tiến hành chạy sắc kí dung dịch m ẫu theo chương trình quy định sau: - Cột tách: cột C18 - Pha động: Đệm photphat pH=2,5 - Tốc độ pha động: 1ml/phút - Detector DAD:  =254 nm - Thể tích tiêm: 20  l Hình 3.1: Sắc ký đồ chất chuẩn Vitamin C Trên sắc ký đồ cho thấy pic Vitamin C xuất thời gian lưu 2,339phút 47 3.2 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN Lập đường chuẩn thông qua mẫu vitamin C chu ẩn có n ồng độ tăng dần sau: 0,05mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,6mg/ml; 0,8 mg/ml; mg/ml Kết xác định khoảng tuyến tính bảng 3.1 hình 3.2: Bảng 3.1: Sự phụ thuộc diện tích pic sắc kí vào nồng độ vitamin C C(mg/ml) 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 Diện tích pic (S) 16.8 41.63 78.25 152.05 229.14 305.69 374.87 48 Hình 3.2: Đường chuẩn Vitamin C Mối quan hệ diện tích pic (y) nồng độ Vitamin C(x) thể qua phương trình: y = 376,21x + 1,9106 Hệ số tương quan R2 = 0,9996 3.3 XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (LOQ) Sau xử lý số liệu phần mềm Excel, kết th ể bảng 3.2: Bảng 3.2 Kết tính độ lệch chuẩn đường chuẩn S (mAU.s) 337,786 661,609 CLT (mg/ml) CTT (mg/ml) CTT  CLT 0,100 0,200 0,094 0,194 0,006 0,006 49 1389,082 3274,786 0,400 0,417 1,000 0,995 SD Đường chuẩn chấp nhận [16]: 0,002 0,005 0,002 - Hệ số hồi quy tuyến tính (R) phải đạt theo yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ Hay 0,99 ≤ R2 ≤ Như so sánh với tiêu chuẩn trên, đường chuẩn xây d ựng đạt độ xác cao, hồn tồn sử dụng để xác đ ịnh hàm l ượng chất phân tích có mẫu Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) xác định theo phương pháp đường chuẩn với giá trị độ lệch chuẩn SD = 0,002 - Giới hạn phát (LOD): LOD = = = 2,02.10-6 (mg/ml) - Giới hạn định lượng (LOQ): LOQ = = = 6,13.10-6 (mg/ml) Vậy LOD= 2,02.10-6 mg/ml nồng độ nhỏ chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu LOQ = 6,13.10-6 mg/ml nồng độ nhỏ chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu 3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ LỆCH CHUẨN TƯƠNG ĐỐI (RSD) Tiến hành chạy sắc ký lặp lần liên tiếp mẫu chuẩn có nồng độ 0,4 mg/ml, kết bảng 3.3: 50 Bảng 3.3: Phân tích mẫu chuẩn Felodipine có nồng độ 0,4 mg/ml S TT tR Diện tích pic Chiều cao Chiều rộng (phút) 4,42 (S) 1579,379 pic (H) 192,1 pic (W) 0,1259 4,42 1576,757 191,6 0,126 4,43 1574,306 191,4 0,1259 4,43 1575,776 191,8 0,1259 4,43 1580,471 191,8 0,1281 Xử lý số liệu phần mềm Excel, ta thu kết sau: Giá trị trung bình diện tích pic (mAU) Độ lệch chuẩn diện tích pic (s) Độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic (RSD) 1577,338 6,488 0,411 (%) 3.5 ĐỊNH LƯỢNG MẪU Chuẩn bị mẫu phân tích mẫu M1, M2, M3, M4 điều ki ện chạy HPLC Xử lý mẫu theo mục 2.2.3 Bảng 3.4: Kết mẫu phân tích Mẫu M1 M2 M3 M4 Diện tích pic (mAU.s) 810,934 919,417 962,083 1570,775 Nồng độ (mg/ml) 0,239 0,273 0,286 0,473 51 DAD1A,Sig=254,4Ref=360,100(06042018\MAUA22000008.D) 4.558 m AU 180 160 140 3.766 120 100 80 7.391 5.984 3.564 5.069 2.334 20 2.563 2.715 1.621 1.728 1.853 1.994 2.121 2.970 40 5.572 60 Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu M4 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài : ‘Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin C giấm chuối phương pháp HPLC’, em thu đ ược số kết sau : Xây dựng đường chuẩn để định lượng vitamin C phương pháp HPLC với thông số : - Cột tách: Cột C18 - Pha động: Đệm photphat pH=2,5 - Tốc độ pha động: ml/phút - Detector DAD:  = 254 nm - Thể tích tiêm: l  Phương trình đường chuẩn y = 3260,7x + 30,084 (R = 0,9992)  Giới hạn phát (LOD): 2,02.10-6 (mg/ml) m in 52  Giới hạn định lượng (LOQ): 6,13.10-6 (mg/ml)  Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 0,411 % Định lượng mẫu khác ta thấy mẫu M4 có nồng độ cao 0,473 (mg/ml) 53 Tài liệu tham khảo I.Tiếng việt Kiều Hữu Ảnh (199), Vi sinh vật công nghiệp, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Trần Thanh Bảo (2007), Nghiên cứu công nghệ chế biến dấm từ dịch ép trái điều, Đề tài tốt nghiệp, Trường ĐH Cơng Nghệ sài Gòn TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thành Đạt (1953), Nguyễn Duy Thảo, Vi sinh vật học, NXB Mir Nguyễn Thế Dũng (2006), Khảo sát công nghệ lên men từ số dịch trái vùng nhiệt đới, Luận văn thạc sĩ sinh học ĐHSP TPHCM 5.Bộ Y tế, “ Kiểm nghiệm dược phẩm” NXB, Y học , 2005 6.Nguyễn Lê Vân Anh(2002), Khảo sát cơng nghệ sản xuất acetic acid cơng nghiệp, Khóa luận cử nhân sinh học – Chuyên ngành sinh hóa ĐH Khoa Học Tự Nhiên TpHCM Nguyễn Lân Dũng tác giả (1977), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 2), NXB KH & KT Nguyễn Hữu Hiếu, 2004, Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid acetic phương pháp sinh học, Luận văn thạc sĩ, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Vũ Thị Hồng (2000), Chọn khảo sát vài đặc điểm phân loại, ứng dụng vi khuẩn acetic, Luận án thạc sỹ khoa học, chuyên ngành vi sinh Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 54 10 Nguyễn Đức Lương (2002), Công nghệ vi sinh tập 1, Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại Học Quốc gia TP HCM 11 Nguyễn Đức Lương (2002), Công nghệ vi sinh tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại Học Quốc gia TP HCM II Tiếng Anh 12.Kersters, K.,Lisdiyanti, P., Komagata, K and Swings, J (2006), The family Acetobacteraceae: the genera Acetobacter, Acidomonas, Asaia 13.Gillis and Delley (1997), In Accetobacteraceae 14 Boehringer Mannheim, Acetic acid – Enzymeatic BioAnalysinFood Analysis – UV Methed, 1997 15.Asai, T.(1935), Taxonomic studies on acetic and bacteria and allied oxidative bacteria isolated from fruits A new classification of oxidative bacteria, J.Agric.Chem.Soc.Japan 16.De Ley, J (1961), Comparative carbohydrate metabolism and a propsal for a phylogenetic relationship of the acetic acid bacterial, J Gen Microbio 17.Dutta, D and Gachhui, R (2006), Novel nitrogen – fixing Acetobacter nitogenifigens sp Now, isolated from Kombucha tea, Int J Syst Evol Microbiol 55 ... nhiên c sản phẩm pha chế từ axit acetic… gây ảnh hưởng đến s c khỏe người tiêu dùng Vì em chọn đề tài Nghiên c u x c định hàm lượng vitamin C giấm phương pháp s c kí lỏng hiệu cao M c đích nhiên... h c: 11 + Nắm sở khoa h c, phương pháp nội dung nghiên c ứu quy trình x c định hàm lượng vitamin C giấm + Bư c đầu tiếp c n nghiên c u khoa h c + Cung c p thêm thông tin khoa h c + Kết nghiên c u. .. nhiên c u, đối tượng phạm vi nghiên c u, ý nghĩa đề tài - M c đích nghiên c u x c định hàm lượng vitamin C giấm - Đối tượng nghiên c u: Chuối sử dụng để chuy ển đổi glucose thành rượu ethylic Lên