Xác định hàm lượng vitamin c trong viên c sủi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc/dad

Xác định hàm lượng vitamin c trong viên c sủi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc/dad

GVGD: TS Lê Đình Vũ SVTH:

BÁO CÁO ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG

VIÊN C SỦI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO HPLC/DAD

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Lớp: ĐHPT7

MSSV: 11050991

1

3 Kết quả và thảo luận

Thực nghiệm xác định hàm lượng vitamin C trong viên C sủi bằng HPLC/DAD

2

1 Tổng quan lý thuyết

1.1 Tổng quan về vitamin C

Định nghĩa: Vitamin C, còn

được gọi là acid ascorbic, là một

acid hòa tan trong nước trong

chất dinh dưỡng được tìm thấy

trong một số loại thực phẩm Trong cơ thể, nó hoạt động như một chất chống oxy hóa, giúp bảo vệ các tế bào khỏi những thiệt hại gây

ra bởi các gốc tự do

Nguồn gốc: Vitamin C có nhiều trong các loại rau quả tươi như

nước cam, chanh, quít, và có hàm lượng cao trong rau xanh, đặc biệt

là bông cải xanh, tiêu, khoai tây, cải brussel, rau cải, cà chua, xoong cam, quýt, chanh Trong công nghiệp, các sản phẩm chứa vitamin C chủ yếu được tổng hợp bằng phương pháp hóa học đi từ D-glucose

3

Tính chất vật lý:

 Khối lượng phân tử: 176,13 g/mol

 Có dạng: bột màu trắng đến vàng nhạt (khan), không mùi, vị chua

 Nhiệt độ nóng chảy: 193oC (phân hủy)

 Khả năng hòa tan trong nước: cao

 Khó tan trong rượu, không tan trong các dung môi hữu cơ

 Acid ascorbic có khả năng hấp thu ánh sáng tử ngoại, UVmax = 254

nm, tại pH = 2, UVmax = 265 nm tại pH = 6.4

Tính chất hóa học:

 Tính acid

Do hiệu ứng liên hợp của nhóm carboxyl, nên

nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl ở vị trí

số 3 trở nên rất linh động, làm cho vitamin C

có tính acid mạnh

O

OH HO

CH CH2OH

HO

O :

• Có thể định lượng acid ascorbic bằng phương pháp đo kiềm, chỉ thị phenolphtalein, dung môi là nước

• Người ta điều chế muối ascorbat natri để pha dung dịch tiêm có nồng độ cao và trung tính

3

NaHCO FeCl3; FeSO4

O HO

OH 2

CH CH

OH

O

Fe2+

 Tính khử

• Việc oxy hoá acid ascorbic xảy ra ở hai mức độ khác nhau:

+ Sự oxy hoá khử thuận nghịch acid ascorbic thành acid dehydroascorbic

 

Tính chất này vô cùng quan trọng đối với tác dụng sinh học của acid ascorbic, nó tham gia vào các hệ enzym xúc tác các quá trình oxy hoá khử xảy ra trong cơ thể

O H

O CH

CH2OH HO

O O

O

+ Sự oxy hoá bất thuận nghịch acid ascorbic:

Quá trình oxy hoá này tạo ra các sản phẩm như acid diceto gulonic (1), acid dehydroascorbic, furfurol (2), và các sản phẩm không có hoạt tính enzym

2,3-Trong dung dịch, acid ascorbic dễ dàng bị oxy hoá bởi oxy không khí; Độ bền vững của dung dịch acid ascorbic giảm tỷ lệ thuận với nồng độ của nó và tỷ lệ nghịch với pH của dung dịch

(1) (2)

C C C CH2OH OH OH O O

H H

O

OH HO

C OH

Lợi ích của vitamin C đối với sức khỏe con người:

• Tham gia tạo colagen và một số thành phần tạo nên các mô liên kết

ở cơ, da xương, mạch máu

• Tham gia vào các quá trình chuyển hóa của cơ thể như protid, lipid, glucid, tăng tỉ lệ hấp thu canxi vào cơ thể

• Tham gia vào quá trình tổng hợp một số chất như catecholamin, hormon vỏ thượng thận, tăng mật độ xương cột sống và xương đùi

• Chống stress nên giúp tăng sức đề kháng cho cơ thể

• Kết hợp với vitamin A, vitamin E chống ôxy hóa bằng cách trung hòa các gốc tự do sản sinh ra từ các phản ứng chuyển hóa, nhờ đó bảo vệ được tính toàn vẹn của màng tế bào

• Hỗ trợ rất lớn giúp hấp thu sắt của cơ thể, vì khi vào trong cơ thể chỉ có sắt hóa trị 2 dễ dàng được hấp thu sắt hóa trị 2, còn sắt hóa trị 3 muốn được hấp thu phải được chuyển thành hóa trị 2, mà quá trình chuyển này cần có sự xúc tác của vitamin C nên nếu thiếu vitamin C sẽ dễ gây thiếu máu do thiếu sắt, do vậy khi uống viên sắt cần uống kèm với vitamin C

Mobile phase (Pha động)

 Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất.

 Dựa trên 2 quá trình:

Hấp phụGiải hấp phụ

 Xảy ra liên tục giữa 2 pha:

Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng, giữ chất phân tích

Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất), hòa tan

và di chuyển chất phân tích

- Sắc ký lỏng chia thành 2 nhóm

Sắc ký lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)Sắc ký lỏng áp suất cao (Sắc ký lỏng hiệu năng cao: HPLC)

Phân loại:

Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký, HPLC chia thành:

HPLC

SK ghép cặp ion

SK phân

thường

SK pha đảo

Sk trao đổi ion

Khi nối với đầu dò (detector), HPLC cho phép:

- Định tính: dựa vào thời gian lưu

- Định lượng: dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak

CẤU TẠO MÁY HPLC

(1) Bì nh đựng dung môi

- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường

dung môi vào đầu bơm cao áp Cho phép

chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi

cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong

muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường

là 100 %

- Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta

ít khi sử dụng 04 đường dung môi cùng

một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 3

và 2 đường để cho hệ pha động luôn được

pha trộn đồng nhất hơn,hệ pha độüng đơn

giản hơn để quá trình rửa giải ổn định

- Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ

yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi

theo thời gian và công tác xây dựng tiêu

chuẩn

NGUỒN CUNG CẤP PHA ĐỘNG (MOBILE PHASE): LÀ BÌNH ĐỰNG DUNG MÔI HOẶC DUNG MÔI CHẠY MÁY

HỆ THỐNG ĐIỀU KHIỂN ÁP SUẤT

HOẶC TỐC ĐỌ DÒNG PHA ĐỘNG,

CÒN GỌI LÀ HỆ THỐNG CUNG CẤP

DUNG MÔI: LC PUMP

( 3) Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung môi)

- Bơm pha động vào cột tách

- Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất của pha động

- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar (1at = 0.98Bar) Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút

(4) Bộ phận tiêm mẫu ( injection valve)

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với dung tích của l bóp là 5 - 100l

Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample)

BƠM MẪU BẰNG TAY

BƠM MẪU TỰ ĐỘNG (AUTO SAMPLE)

LÒ CỘT (COLUME OVEN): DÙNG

ĐỂ ĐIỀU KHIỂN NHIỆT ĐỘ CỘT

TÁCH

CỘT TÁCH: LÀ NƠI XẢY RA CÁC QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT, GỒM CỘT PHÂN TÍCH VÀ CỘT BẢO VỆ

5 Cột tách (Colume)

- Cột tách có kích cỡ khác nhau

- Chiều dài: 10 – 25cm

- Đường kính: 2 – 5mm

- Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký

- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận)

hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha đảo ) , ngoài ra người ta còng dùng các loại hạt khác như : Nhôm Oxit,Polyme xốp,chất trao đổi ion

* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column)

(6) Đầu dò (detector)

Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy vào mục đích phân tích

Dùng để phát hiện chất và định lượng: UV-Vis, DAD, huỳnh quang, độ dẫn, điện hóa, khối phổ,…

(7) Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu (interface, software, PC): Dùng để thu thập và tính toán các kết quả

III NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG MÁY HPLC

- Mẫu chất lỏng được đưa vào buồng bơm mẫu sau đó được bơm tự động vào cột tách

- Dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

- Các quá trình tách trong sắc ký lỏng:

 Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký

 Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký

 Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất phân tích từ đầu cột đến cuối cột

 Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định

 Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động

 Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp chất phức tạp

• Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký

column

Vật liệu nhồi cột 3- 5m

Hỗn hợp chất tách khỏi

nhau thế nào ?

Pha tĩnh Flow

- Sau khi các cấu tử tách ra khỏi nhau sẽ lần lượt đi vào detector, tại

đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuyếch đại rồi chuyển sang bộ ghi Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả

- Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là peak Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng (định tính) cho chất cần tách Còn diện tích peak là thước đo định lượng cho chất cần phân tích

-Thời gian chất phân tích bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu) quyết định

bởi:

 Bản chất của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của chất phân tích

 Bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh)

         

- Ghi lại toàn bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp chất phân tích  sắc ký đồ gồm nhiều peak.

- Đặc điểm của peak phân tích :

 Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn

 Chập nhau một phần

 Chập nhau hoàn toàn

- Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay không tốt

• Tách tốt: hỗn hợp có bao nhiêu chất  có bấy nhiêu peak riêng biệt không chập nhau

• Chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng, chất lưu giữ kém sẽ ra trước

• Tuỳ từng chất cần nghiên cứu và các điều kiện phân tích để chọn các detector khác nhau

ƯU ĐIỂM CỦA HPLC

- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

- Không cần làm bay hơi mẫu

- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

- Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò

- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)

2 Thực nghiệm xác định hàm lượng vitamin C trong viên C sủi bằng phương pháp HPLC/DAD

Yêu cầu chung

•Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng phải là nước cất hai lần khử ion hoặc loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696)

Hóa chất

•Kali dihydro phosphate, w(KH2PO4) ≥ 99.0 %

•Acetonitrile, (loại dùng cho HPLC), w(CH3CN) ≥ 99.0 %

Pha động cho HPLC

•Hòa tan 13.6 g kali dihydro phosphate trong 900 ml nước đựng trong cốc có mỏ Lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0.45 µm (dung dịch A)

• 100 ml acetonitrile được lọc qua bộ lọc 0.45 µm (dung dịch B)

• Khử khí dung dịch trước khi sử dụng, nếu cần

Chất chuẩn

• Axit ascorbic, w(C6H8O6) ≥ 99.7 %

Dung dịch gốc

• Dung dịch gốc axit ascorbic, ρ(C6H8O6) ≈ 1 mg/ml (1000 ppm)

• Hòa tan một lượng axit ascorbic đã được cân chính xác đến 0,1

mg Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng

Lấy mẫu và xử lý sơ bộ

• Trước khi đo cần lọc dung dịch qua màng lọc 0.45 µm

• Cân chính xác đến 0.1 mg khoảng 0.5 g mẫu viên sủi vitamin C sau đó hòa tan hoàn toàn vào nước, cho vào bình định mức 50

ml sau đó định mức đến vạch, hút 1 ml dung dịch từ bình định mức này cho vào bịnh định mức 100 ml sau đó định mức bằng nước tới vạch, ta được dung dịch mẫu thử

Các điều kiện chạy máy

 Pha tĩnh: Cột pha đảo C18, cỡ hạt 0.5 µm, kích thước 250 mm × 4.0 mm

 Pha động: Dung dịch A : Dung dịch B tỉ lệ 9 : 1

 Tốc độ dòng: 0.3 ml/min

 Detector: DAD bước sóng 265 nm

 Axit ascorbic: tlưu = 3.638 min

Tiến hành xác định

•Sau khi đã khảo sát và chọn ra được tốc độ dòng và tỉ lệ dung môi tối ưu ta tiến hành đo chuẩn và đo mẫu đễ xác định hàm lượng vitamin C có trong mẫu Đo lần lượt các dung dịch chuẩn có nồng

độ 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm sau đó pha dung dịch chuẩn có nồng

độ ước lượng trong khoảng 10 – 40 ppm rồi tiến hành đo với cùng điều kiện như đo các dung dịch chuẩn, hàm lượng vitamin C trong mẫu sẽ được xác định bằng phương pháp so sánh ngoại chuẩn

3 Kết quả và thảo luận

Sắc ký đồ đo mẫu chuẩn 10 ppm

Sắc ký đồ mẫu chuẩn 20 ppm.

Sắc ký đồ đo mẫu chuẩn 40 ppm.

Nồng độ (ppm) 10 20 40

Diện tích peak

(mAU*s)

895.9473 2071.55054 6566.98730Kết quả đo dãy chuẩn vitamin C

Sắc kỹ đồ mẫu cần xác định

Nồng độ tính được (ppm) bằng phương pháp so sánh 2 chuẩn với

C10ppm và

C40ppm

Nồng độ tính được (ppm) bằng phương pháp so sánh 2 chuẩn với

C20ppm và

C40ppm

Nồng độ trung bình của mẫu (ppm)

Hàm lượng acid arcorbic ban đầu

(%)

0.535 4198.41846 27.47 29.46 28.47 26.61

Kết quả đo mẫu và xác định hàm lượng mẫu

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Phạm Luận (2013),.Phương pháp phân tích sắc ký và chiết

tách, NXB Bách Khoa Hà Nội

[2] Phan Hiền Lương (2004), Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng

cao, NXB Khoa học và Kỹ thuật.

[3] Douglas RM, Chalker EB, Treacy B Vitamin C for preventing and treating the common cold Cochrane Database Syst Rev 2000;(2):CD000980

[4] TCVN 8977: 2011

[5] http://vi.wikipedia.org/wiki/vitamin_C

2.5 Xác định hàm lượng Cl2 hữu hiệu và xút dư trong mẫu Javel.

2.4 Xác định hàm lượng NaClO3 trong mẫu nước muối cấp điện giải.

2.3 Xác định Cl2 trong mẫu nước muối nghèo.

2.2 Xác định hàm lượng NaOH và Na2CO3 đồng thời trong mẫu muối tinh chế.

2.1 Xác định hàm lượng Na2O, SiO2, Modul Silicat trong thành phẩm

Natri Silicat ( Thủy tinh lỏng)

2 Phân tích 10 chỉ tiêu trong hóa chất cơ bản

2.6 Xác định hàm lượng NaCl trong mẫu nước muối nghèo

2.7 Phân tích hàm lượng Na2SO3 trong nước muối nghèo

2.8 Xác định hàm lượng HCl trong mẫu acid HCl

2.9 Xác định hàm lượng Clo tự do trong mẫu acid HCl

2.10 Xác định hàm lượng NaOH trong mẫu sản phẩm cuối NaOH giao hàng 5

2.1 Xác định hàm lượng Na2O – SiO2 - Modul Silicat trong thành phẩm Natri Silicat ( Thủy tinh lỏng)

• Tiêu chuẩn này áp dụng cho Natri Silicat dạng lỏng sản xuất từ xút và cát thạch anh, dung để sản xuất xà phòng, kem giặt, bột giặt tổng hợp

và các mục đích khác.

Nguyên tắc xác định

• Dựa trên phản ứng chuẩn độ axit- bazo để xác định % Na2O, chuẩn

độ ngược để xác định % SiO2 và tính được modul silicat có trong mẫu Natri Silicat theo % Na2O, % SiO2.

Cân 1,5-2g mẫu

Tráng cốc 500

mL

Định mức

500 mL

Hút 50 mL

2-3 giọt Bromthymol xanh

Tiến hành chuẩ n độ

HCl 0,2N

Dừng

chuẩn

độ

Lưu ý: Các dụng cụ trong quy trình đều bằng nhựa

phẩm Natri Silicat ( Thủy tinh lỏng)

7

Dừng

chuẩn

Vàng Xanh dương

phẩm Natri Silicat ( Thủy tinh lỏng)

Lưu ý: Các dụng cụ trong quy trình đều bằng nhựa 8

Xác định hàm lượng Na2O - SiO2 - Modul Silicat

trong thành phẩm Natri Silicat ( Thủy tinh lỏng)

1 % Na 2 O = 2.% SiO 2 =

- Thể tích chuẩn HCl (V1) ml - Thể tích chính xác HCl (V) ml

- Nồng độ HCl (N1) - Thể tích chuẩn NaOH (V2) ml

- Trọng lượng mẫu (m) g - Nồng độ NaOH (N2)

3 Modul (Hiệu suất silic): Modul =

0

% 

9

Xác định hàm lượng Na2O – SiO2 - Modul Silicat

trong thành phẩm Natri Silicat ( Thủy tinh lỏng)

Với C HCl = 0,2032( N), C NaOH = 0,1088( N),

V HCl = 25ml, m(g) = 1,5 ÷ 2 (± 0,2g) BẢNG KẾT QUẢ

STT Ngày thực hiện Chỉ tiêu V(1) HCl V(2) NaOH m(g) Kết quả

Xác định hàm lượng Na2O – SiO2 - Modul Silicat trong thành phẩm Natri Silicat ( Thủy tinh lỏng)

• Tất cả mẫu được tiến

theo Kiểm tra thử

nghiệm của nhà máy

hóa chất Vicaco

NHẬN XÉT

Tên tiêu chuẩn Mức và yêu cầu

1 Trạng thái bên ngoài

Chất lỏng đồng nhất, sánh, trong suốt cho phép có màu trắng đục hoặc vàng.

2 Hàm lượng Na2O, tính theo % trong khoảng

Min 10

3 Hàm lượng SiO2, tính theo % trong khoảng

Min 26

11

Dựa trên chuẩn độ acid – bazơ để xác định chỉ tiêu này, dùng dung dịch chuẩn HCl

trực tiếp xuống mẫu phân tích và lần lượt dùng 2 chỉ thị acid và bazơ sau:

Bước 1: Dùng chỉ thị PP, tại điểm tương đương dung dịch mất màu hồng, ghi nhận

thể tích dung dịch chuẩn HCl tiêu tốn (V1) để trung hòa NaOH và chuyển CO3

-thành HCO3-

Bước 2: Cho tiếp chỉ thị MO vào, chuẩn tiếp bằng HCl, tại điểm tương đương dung

dịch chuyển từ màu vàng sang da cam Ghi nhận thể tích dung dịch chuẩn HCl tiêu tốn (V2) để trung hòa HCO3- sinh ra phản ứng trên