xác định melamine trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

xác định melamine trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

LỜI MỞ ĐẦU

Có lẽ ai trong chúng ta cũng đã từng uống sữa và cũng biết được những lợiích mà việc uống sữa mang lại cho sức khỏe của con người Sữa đáp ứng nhu cầucủa cơ thể về acid amin không thay thế, acid béo không no, khoáng (đặc biệt làcanxi và phốt pho) và vitamin Sữa không những bổ dưỡng mà còn có tác dụnggiải độc Trong số các thức ăn tự nhiên của con người, không có sản phẩm nào màcác chất cần thiết cho cơ thể lại được phối hợp một cách hiệu quả như sữa

Chính nhờ giá trị dinh dưỡng cùng với sự tiện lợi mà sữa được hầu nhưmọi người ưa chuộng và sử dụng hằng ngày Nhưng gần đây, dư luận trong vàngoài nước xôn xao về nhiều loại sữa bột có nguồn gốc từ Trung Quốc có chấtmelamine gây độc hại cho cơ thể Vậy melamine là chất gì? Tác hại của nó nhưthế nào? Và làm sao để xác định được sự có mặt của melamine trong sữa? Chúngtôi sẽ giải đáp những thắc mắc đó cũng như giới thiệu đến mọi người một phươngpháp xác định melamine trong sữa sử dụng phổ biến nhất hiện nay – đó là phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

M C L C ỤC LỤC ỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1: Tổng quan về chất Melamine 3

1.1 Melamine là gì? 3

1.2 Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melamine 5

1.3 Tại sao melamine lại được cho vào sữa tươi và sữa bột trẻ em? 5

1.4 Ảnh hưởng của melamine đến sức khỏe? 6

1.5 Triệu chứng của nhiễm độc melamine? 8

1.6 Liều lượng dung nạp melamine an toàn cho một người 8

1.7 Nồng độ an toàn cho sữa và thực phẩm 9

CHƯƠNG 2: Phương pháp xác định melamine trong sữa bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC 10

2.1 Các phương pháp xác định melamine trong sữa 10

2.2 Sơ lược về hệ thống HPLC 10

2.3 Xác định melamine trong sữa bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC 15

2.3.1 Hóa chất và thuốc thử 15

2.3.2 Hệ thống sắc ký - detector 15

2.3.3 Pha dung dịch 15

2.3.4 Quá trình tiến hành 17

Chương 3: Các biện pháp khắc phục khi sữa bị nhiễm melamine 19

Kết luận 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

Chương 1: Tổng quan về chất Melamine

Melamine tan ít trong nước, có khả năng giải phóng N khi gặp nhiệt độ cao

và được sử dụng làm chất chống cháy Melamine còn là dẫn chất của thuốc trừ sâucyromazine và có thể được hình thành trong cơ thể động vật có vú từ cyromazine

Có nghiên cứu cho rằng melamine cũng được hình thành từ cyromazine khicyromazine có mặt trong mô thực vật

Melamine được tổng hợp từ chất urê - một chất có thành phần nitrogen cao

- là chất rắn màu trắng, chịu nhiệt cao đến 350OC Melamine là thành phần chínhcủa công nghệ sản xuất các vật dụng gia đình (chén đĩa), formica (dùng trong côngnghệ bàn ghế, tấm vách ), bao bì, nhựa, melamine dùng làm chất keo dán

Hình 1.1: melamine được sử dụng trong sản xuất đồ nhựa

Melamine có độc tính qua thử nghiệm: gây ngộ độc cấp trên chuột với liềuchết (LD50), qua đường uống là trên 3.000mg cho mỗi kg

Một nghiên cứu ở Liên Xô trước đây, vào những năm 1980, cho rằng chấtmuối sinh ra khi melamine kết hợp với acid cyanuric là cyanurat melamine, dùngsản xuất chất chống cháy, có thể độc hại hơn nhiều lần so với melamine dùng đơnđộc hay acid cyanuric dùng đơn độc

Một nghiên cứu khác về ngộ độc học nêu lên rằng trong thức ăn của các vậtnuôi trong nhà (chó, mèo) có nhiễm hỗn hợp hai chất melamine và acid cyanuric

sẽ gây ra suy thận cấp

Hình 1.2: công thức cấu tạo của melamine C3H6N6

Hình 1.3: công thức khai triển của melamine

1.2. Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melamine

Nhà hóa học người Đức tên Justus von Liebig là người đầu tiên tổng hợpmelamine vào năm 1834 Trong phương pháp tổng hợp của Justus von Liebig,calcium cyanamide (CaCN2) được chuyển thành dicyandiamide sau đó được nungnóng để tạo melamine Ngày nay urê được sử dụng trong công nghiệp để sản xuấtmelamine Phương trình hóa học như sau:

Quy trình kết tinh và rửa melamine làm sản sinh một lượng lớn nước thải

có hại nếu chúng được xả trực tiếp vào môi trường Thông thường nước thải được

cô thành dạng rắn (có thể chứa đến 75% melamine) nhưng thuận tiện và an toànhơn trong cho quản lý và xử lý.

1.3. Tại sao melamine lại được cho vào sữa tươi và sữa bột trẻ em?

Đối với nhà sản xuất, melamine và cả với acid cyanuric, là hai chất giúplàm tăng “nồng độ đạm” trong sản phẩm dù nồng độ đạm thật trong đó chả có baonhiêu!

Vì lợi nhuận, nhà sản xuất thực phẩm đã đánh lừa nhà kiểm định bằng cáchcho melamine vào thực phẩm Do lòng tham không đáy, một số nhà sản xuất còncho vào cả hai chất melamine và acid cyanuric Thế là gây ra thảm họa ngộ độchàng loạt Acid cyanuric rẻ hơn melamine nhiều, đó cũng là lý do có thể có sựhiện diện cả đôi trong thực phẩm dẫn tới gây độc mà người ta không ngờ đến

Hình 1.4: sữa nhiễm melamine bị tiêu hủy

1.4. Ảnh hưởng của melamine đến sức khỏe?

Chưa có nghiên cứu nào về tác động của melamine đối với sức khỏe Thếnhưng, tình trạng của trẻ em Trung Quốc dùng sữa nhiễm melamine đã cho thấytác động của hóa chất này lên con người gần giống với kết quả thử nghiệm trênsúc vật

Đặc biệt, Bản thân melamine không có tính độc ở liều thấp nhưng khi kếthợp với axit cyanuric (cũng có trong sữa bột) sẽ tạo thành muối tinh thể đóngtrong các ống thận nhỏ gây bít tắc, sỏi thận, ảnh hưởng đến sự tạo nước tiểu vàgây suy thận, tử vong Một số nghiên cứu trên súc vật cho thấy melamine có khảnăng gây ung thư

Nghiên cứu còn cho thấy melamine có khả năng hủy hoại hệ thống miễndịch của con người

Hình 1.5: Melamine (màu xanh) dễ dàng kết hợp với axít cyanuric (màu đỏ) qua

liên kết hydro tạo kiểu liên kết phân tử hình mái ngói, lắng đọng và gây sỏi thận

Hình 1.6: Melamine gây sỏi thận

Melamine thường gây ngộ độc mãn tính do khó tan trong nước và cần thờigian dài để thải trừ Tổn thương hệ sinh sản, sỏi bàng quang, sỏi thận và ung thưbàng quang là những hậu quả của việc sử dụng melamine trong thời gian dài

Hình 1.7: melamine ảnh hưởng đến sức khỏe trẻ nhỏ

1.5. Triệu chứng của nhiễm độc melamine?

Bị kích thích ở da, mắt, hô hấp, tiểu ra máu, tiểu ít, tiểu khó hoặc khôngtiểu được, có dấu hiệu nhiễm trùng tiểu (sốt, đau lưng, tiểu gắt, tiểu giắt), huyết áptăng là các dấu hiệu cần cảnh giác sau khi sử dụng sản phẩm

1.6. Liều lượng dung nạp melamine an toàn cho một người

Nhiều hàng hóa lưu hành trên thị trường đều hàm chứa một ít melamine Điều này cũng dễ hiểu, bởi vì hóa chất này được sử dụng trong các quy trình sảnxuất giấy và bao bì cho nhiều loại hàng hóa gia dụng Do đó, không có gì đángngạc nhiên khi tìm thấy melamine trong các vật gia dụng này

Vấn đề là liều lượng melamine cỡ nào có thể gây tác hại đến sức khỏe chocon người Câu hỏi này khó có câu trả lời dứt khoát, bởi vì phần lớn dữ liệu về táchại của melamine trong quá khứ được thu thập qua thí nghiệm trên chuột, chó vàmèo, chứ không phải trên người (và cũng chẳng có nhà khoa học nào dám làm thínghiệm trên người)

Tuy nhiên, sau khi các chuyên gia về an toàn thực phẩm trên thế giới thảoluận, họ nhất trí rằng nồng độ melamine dung nạp hàng ngày có thể chấp nhậnđược (tiếng Anh là tolerable daily intake hay TDI) là 0.5 mg/kg cân nặng Ở Mĩ,Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm (FDA) đề nghị TDI 0.63 mg/kg cân nặng

Khái quát hóa từ tiêu chuẩn trên, chúng ta có thể nói cứ mỗi kg cân nặng,một người có thể hấp thu 0.5 mg melamine mỗi ngày Chẳng hạn như một em bécân nặng 20 kg thì liều lượng melamine an toàn là 10 mg/ngày; hay một người lớnnặng 60 kg thì có thể dùng 30 mg/ngày mà không gây tác hại đến sức khỏe

1.7. Nồng độ an toàn cho sữa và thực phẩm

Theo tiêu chuẩn mới về an toàn thực phẩm, hàm lượng an toàn melamine tối đa là 0,15 mg/kg với sữa nước dành cho trẻ em, 1 mg/kg với sữa bột dành cho trẻ em và 2,5 mg/kg với thức ăn cho động vật và các thực phẩm khác.

Đó là tiêu chuẩn mới do Ủy ban luật quốc tế về chất lượng và an toàn thựcphẩm của LHQ (CAC) công bố ngày 5/7/2012

CHƯƠNG 2: Phương pháp xác định melamine trong sữa bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC

2.1 Các phương pháp xác định melamine trong sữa

 Dùng máy sắc ký khí khối phổ GC/MS để kiểm nghiệm melamine

 Phương pháp Dumas

 Phương pháp Kjedal

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Tại sao lại chọn Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC?

Vì sắc lỏng kí hiệu năng cao là phương pháp rất thuận lợi để định lượng mộtchất trong hỗn hợp vì chất đó tách ra khỏi chất khác HPLC được sử dụng rộng rãihơn cả trong phân tích lương thực thực phẩm như xác định các hóa chất bị cấm,các chất tồn dư và kiểm soát chất lượng, nó mang lại độ chính xác cao cũng nhưthời gian tiến hành ngắn và thỏa mãn các tiêu chí:

 Not labor intensive – không tốn lao động

 Efficient – hiệu quả

 Cheap – giá rẻ

 Low detection limit - Giới hạn phát hiện thấp

 Simple method – phương pháp đơn giản

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phépchúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mongmuốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.

Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng mộtlúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộnđồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải

Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sửdùng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đềuphải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích

Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễuđường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích

 Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký.Bơm phải đạt được áp suất cao khoảng 250-600bar và tạo dòng liên tục Lưulượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút

 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động(autosamper)

Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệunăng cao.

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…

Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký

 Detector - Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghitrên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chấtphân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp

Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ,cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các loại đầu dò sau:

- Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV

- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiệncác chất hấp thụ quang Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất

- Đầu dò hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang

tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang

- Đầu dò DAD (Diod Array Detector) có khả năng quét chồng phổ để địnhtính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất

- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường

- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn

- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…

Có một số cách phát hiện khi một chất đã đi qua cột Một phương pháp phổbiến là dễ dàng để giải thích sử dụng đầu dò tử ngoại

Nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ ánh sáng tia cực tím bước sóng khác nhau.Nếu bạn có một chùm ánh sáng tia cực tím chiếu sáng qua các dòng chất lỏng đi rakhỏi cột, và một đầu dò tử ngoại ở phía đối diện của dòng, bạn có thể đọc trực tiếpánh sáng được hấp thụ

Lượng ánh sáng hấp thụ phụ thuộc vào số lượng của một hợp chất đặc biệt

đó đi qua chùm tia vào thời điểm đó

Bạn có thể tự hỏi tại sao các dung môi được sử dụng không hấp thụ ánhsáng UV Chúng có, tuy nhiên, các hợp chất khác nhau hấp thụ mạnh mẽ nhất ởcác bộ phận khác nhau của quang phổ tia cực tím.

Ví dụ, Methanol hấp thụ ở bước sóng dưới 205 nm, và nước dưới 190 nm.Nếu bạn đang sử dụng một hỗn hợp methanol-nước là dung môi, do đó bạn

sẽ phải sử dụng một bước sóng lớn hơn 205 nm để tránh đọc sai từ các dung môi

 Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện

Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệthống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak nhưtính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý các thông số liên quanđến kết quả phân tích

 In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máytính có cài phần mềm điều khiển

Hình 2.2: Hình ảnh thực tế của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Dung môi: Methanol

Dung môi rửa giải: Trifluoroacetic và Methanol

Mẫu thử (sữa dạng bột hoặc lỏng)

Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động và pha loãng được lọc bằng hệ thống pod Millipore

Dung dịch chuẩn Melamine

Cân chính xác 100mg melamine vào bình định mức 100mL, hòa tan với Methanol50% bằng cách rung trong bể rung siêu âm 30 phút Lên thể tích 100 mL thu đượcdung dịch có nồng độ melamine 1000 µgmL-1

Pha loãng 5mL melamine trên (1000 µgmL-1)bằng 50 ml 50% methanol để đượcnồng độ melamine 100 µgmL-1

Pha loãng tiếp 5mL melamine 100 µgmL-1 bằng 50 ml methanol 50% để đượcnồng độ melamine 10 µgmL-1

Cho dung dịch mẫu thu được vào ống ly tâm và ly tâm ( ≥ 3200 rpm) rồi lấy phầndung dịch phía trên ống (5 ml) chuyển sang bình định mức 50ml, và lên thể tích 50

ml bằng dung dịch methanol 50% Mẫu được lọc qua bộ lọc 0.45 µm (màngNylon) Nghiên cứu về dịch lọc chỉ ra rằng các bộ lọc hấp thụ melamine tại cácmức sau: 22% (cho 1ml ban đầu), 10% (2 mL), <1% (3, 5 và 7ml) Như vậy, 3mlban đầu của dịch lọc bị loại bỏ phần lọc còn lại được bổ sung vào một lọ HPLC đểphân tích

Các thông số cài đặt

HPLC là phương pháp xét nghiệm melamine trong thực phẩm được sử dụng phổbiến trên thế giới từ khá lâu, các trung tâm xét nghiệm melamine ở Việt Nam cũngđang sử dụng phương pháp này

Nồng độ có thể phát hiện: theo các báo cáo phương pháp này phát hiện melamine

với nồng độ khoảng vài chục ppb (parts per billion - 1 phần tỉ).

Các tham số khi dùng HPLC (Theo tiêu chuẩn của FDA):

Nguyên tắc hoạt động : pha động sau khi bài khí được bơm đưa vào hệ

thống sắc kí, hệ thống sẽ tự động bơm mẫu vào cột Pha động khi đi ngang qua sẽcuốn theo mẫu cần phân tích đi theo Khi vào trong cột sắc kí, chất nào có ái lựcmạnh với pha động sẽ theo pha động đi ra trước, chất nào có ái lực yếu hơn sẽ đi

ra sau Đầu dò detector phát hiện các cấu tử đi ra khỏi cột chuyển tín hiệu cho máyghi kết quả

Hình 2.3: Sơ đồ lí thuyết quá trình tiến hành

Trong quá trình này ta cần lưu ý một số điểm sau:

Đưa mẫu vào: bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào khá cao

Thời gian lưu mẫu: là khoảng thời gian đưa mẫu vào đến khi đỉnh (peak) hiển thị

rõ nét Bị chi phối bởi các yếu tố:

Áp suất đầu vào

Tính chất của pha tĩnh ( hợp chất, kích thước hạt )

Thành phần dung môi

Nhiệt độ cột

Máy dò (detector ): các hợp chất hữu cơ thường hấp thu tia UV, mỗi chấthấp thụ mạnh nhất đối với một bước sóng nhất định Chiếu tia UV xuyên qua dònghỗn hợp ở đầu ra, ở phía đối diện đặt một máy dò ta có thể đo được mức độ hấpthụ tia UV Từ đó có thể tính được nồng độ các chất Nên nhớ dung môi cũng hấpthụ tia UV nên lựa chọn các bước sóng thích hợp

Dịch kết quả từ máy dò: Kết quả thường gồm một dãy peak, mỗi peak đại diện chomột hợp chất trong hỗn hợp đi qua cột hấp phụ và hấp thụ tia UV Ta có thể điềukhiển điều kiện của cột hấp phụ và thời gian lưu để xác định sự có mặt của cáchợp chất Những tham số điều khiển này đã được đo trước với các mẫu thử