XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

Vì vậy, dựa vào tài liệu tham khảo kết hợp với điều kiện thực tế của Trung Tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert Control Cần Thơ, đề tài “Xác định hàm lượng vitamin D 3 trong sữa bằng phươ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa Học – Khoa Sư Phạm

đã trực tiếp hướng dẫn, dành thời gian quý báu tận tình chỉ dạy, quan tâm, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp Xin cảm ơn tất cả các quý Thầy Cô trường Đại học Cần Thơ nói chung,

bộ môn Hóa khoa Khoa Học Tự Nhiên nói riêng đã truyền dạy những kiến thức, kỹ năng quý báu cũng như đã tạo điều kiện cho chúng em có được môi trường học tập tốt nhất

Đặc biệt cô Tôn Nữ Liên Hương, cô Lê Thị Bạch cố vấn lớp Hóa Dược 1 K38 đã dẫn dắt, định hướng, quan tâm và giúp đỡ chúng em tận tình trong suốt những năm học qua

Chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert Control Cần Thơ đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất để em hoàn thành luận văn

Anh La Văn Thái - trưởng phòng Trung Tâm Phân Tích – Giám Định Vinacert Control Cần Thơ, chị Võ Thị Thúy An, anh Nguyễn Hoài Thương và các anh chị trong trung tâm, đặc biệt là anh chị trong phòng sắc ký đã nhiệt tình hướng dẫn, chia sẻ cho em những kinh nghiệm bổ ích

Cuối cùng, cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, yêu thương, tạo điều kiện cho con hoàn thành luận văn cũng như chương trình học của mình Cảm ơn tập thể Hóa dược 1 K38 đặc biệt là những người bạn

đã luôn bên cạnh ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ mình trong thời gian qua Xin chân thành cảm ơn!

ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

2 Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D 3 TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ

(LC/MS/MS)

3 Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477

Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015 Cán bộ hướng dẫn

Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

iii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1

1 Cán bộ phản biện 1: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi

2 Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D 3 TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ

(LC/MS/MS)

3 Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477

Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015

Cán bộ phản biện 1

Ths Nguyễn Thị Diệp Chi

iv

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2

1 Cán bộ phản biện 2: Ths Dương Thị Phương Liên

2 Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮ BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ

(LC/MS/MS)

3 Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477

Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung

chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

v

TÓM TẮT

Vitamin D 3 là một trong các loại vitamin thiết yếu, có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sức khỏe xương Ngày nay, rất nhiều các sản phẩm dinh

người mà thông dụng nhất là các loại sữa Tuy nhiên việc nghiên cứu phương

nhiều Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin D 3

trong các loại sữa bột nhằm đánh giá đúng chất lượng của các sản phẩm này Sau khi tham khảo, thử nghiệm nhiều nghiên cứu, đề tài đã lựa chọn quy trình sử dụng phương pháp xà phòng hóa, chiết lỏng-lỏng để trích ly mẫu và phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ LC/MS/MS để phân tích định lượng Tiến hành đánh giá phương pháp thông qua một số các chỉ tiêu thẩm định cơ bản, kết quả đều phù hợp các tiêu chuẩn phân tích Đề tài phân tích

có chứa vitamin D 3 , hàm lượng trung bình là 76,89 ppb, mặc dù vẫn có sự chênh lệch giữa hàm lượng phân tích được với thông tin có trên bao bì sản phẩm nhưng sự chênh lệch này là không quá lớn Điều này chứng tỏ phương pháp phân tích có độ chính xác tương đối, có thể được áp dụng vào trong phân tích thực tiễn

Từ Khóa: vitamin D 3 , sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ, LC/MS/MS, sữa bột

vi

CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả

nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất

cứ luận văn cùng cấp nào khác

Phạm Khánh Ngọc Ngày: 01/12/2015

vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT v

CAM ĐOAN vi

DANH SÁCH BẢNG x

DANH SÁCH HÌNH xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về vitamin 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Đặc điểm 3

2.1.3 Phân loại 3

2.1.4 Vai trò 4

2.2 Tổng quan về vitamin D 5

2.2.1 Lịch sử phát hiện 6

2.2.2 Phân loại 6

2.3 Tổng quan về vitamin D3 8

2.3.1 Đặc điểm 8

2.3.2 Tính chất 9

2.3.3 Hấp thu và chuyển hóa 10

2.3.4 Vai trò sinh lý 12

viii

2.3.5 Nhu cầu 14

2.3.6 Nguồn cung cấp 15

2.3.7 Ứng dụng 16

2.4 Tổng quan về các phương pháp chuẩn bị mẫu 17

2.4.1 Phương pháp xà phòng hóa 17

2.4.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng 18

2.5 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS) 19

2.5.1 Tổng quan về LC/MS/MS 19

2.5.2 Cấu tạo hệ thống LC/MS/MS 20

2.5.3 Nguyên tắc hoạt động 27

2.5.4 Một số kỹ thuật quét khối phổ MS/MS 27

2.5.5 Định tính, định lượng 28

2.5.6 Các thông số đánh giá phương pháp 30

2.5.7 Ưu, nhược điểm 33

2.5.8 Ứng dụng 33

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1 Phương tiện nghiên cứu 35

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 35

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 35

3.1.3 Hóa chất 35

3.2 Phương pháp nghiên cứu 36

3.2.1 Phương pháp thu mẫu 36

3.2.2 Phương pháp phân tích 37

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Sắc ký đồ của chuẩn vitamin D3 45

4.2 Khoảng tuyến tính 45

4.2.1 Kết quả đo các điểm chuẩn khảo sát 45

ix

4.2.2 Đồ thị các điểm chuẩn 46

4.2.3 Kết luận khoảng tuyến tính 48

4.3 LOD và LOQ của phương pháp 48

4.4 Hiệu suất thu hồi 49

4.5 Độ lặp lại 50

4.6 Đường chuẩn 51

4.6.1 Đường chuẩn 51

4.6.2 Phương trình hồi quy tuyến tính 51

4.7 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin D3 trên các mẫu sữa 51

4.8 Độ chệch 53

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 59

x

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại các vitamin theo khả năng hòa tan 4

Bảng 2.2 Vai trò của một số vitamin 5

Bảng 2.3 Nhu cầu vitamin D3 được khuyến nghị trong khẩu phần dinh dưỡng hằng ngày do Viện Dinh Dưỡng đề nghị năm 2008 14

Bảng 2.4 Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin D3 15

Bảng 3.1 Thông tin của các loại sữa bột được sử dụng trong đề tài 37

Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 43

Bảng 3.3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 44

Bảng 4.1 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitamin D3 46 Bảng 4.2 Hiệu suất thu hồi của Vitamin D3 50

Bảng 4.3 Độ lặp lại của phương pháp 50

Bảng 4.4 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin D3 trên các mẫu sữa 52

Bảng 4.5 Độ chệch của phương pháp 53

xi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Bảng phân loại các dạng vitamin D 7

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử vitamin D2 và vitamin D3 7

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của cholecalciferol (vitamin D3) 9

Hình 2.7 Các phản ứng chuyển hóa vitamin D3 trong cơ thể 11

Hình 2.8 Sự chuyển hóa – hấp thu của vitamin D3 trong cơ thể con người 12

Hình 2.9 Sự điều hòa calci bởi vitamin D3 trong cơ thể con người 13

Hình 2.10 Các chế phẩm vitamin D3 trên thị trường 16

Hình 2.12 Các loại thực phẩm được bổ sung vitamin D3 trên thị trường 17

Hình 2.13 Hệ thống LC/MS/MS điển hình 19

Hình 2.14 Sơ đồ cấu tạo hệ thống LC/MS/MS 20

Hình 2.15 Hệ thống LC/MS/MS AB Sciex QTRAP4500 20

Hình 2.16 Sơ đồ phác họa một hệ thống HPLC cơ bản 21

Hình 2.17 Phác họa cấu tạo một bình chứa pha động thông thường 21

Hình 2.18 Sơ đồ cấu tạo cơ bản của hệ thống đầu dò khối phổ ba tứ cực 24

Hình 2.19 Phác họa phương pháp ion hóa phun điện ESI 25

Hình 2.20 Sơ đồ phác họa cấu tạo một tứ cực 26

Hình 2.21 Đồ thị tương quan diện tích hoặc chiều cao peak với nồng độ 29

Hình 2.22 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc 31

Hình 4.1 Sắc ký đồ của chuẩn vitamin D3 nồng độ 100 ppb trong methanol 45 Hình 4.2 Đường chuẩn 20 ppb – 120 ppb 46

Hình 4.3 Đường chuẩn 20 ppb – 140 ppb 47

Hình 4.4 Đường chuẩn 20 ppb – 160 ppb 47

Hình 4.5 Đường chuẩn 20 ppb – 180 ppb 48

xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AES Atomic Absorption Spectroscopy

AOAC Association Of Analytical Communities

ESI ElectroSpray Ionization

HPLC High Performance Liquid Chromatography ICH International Conference on Harmonisation

ppb parts per billion

SPE Solid Phase Extraction

SPME Solid Phase Micro Extraction

USFDA United States Food and Drug Administration USP United States Pharmacopeia

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề [1-4]

Vitamin D là một nhóm các secosteroid tan được trong chất béo, có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người Vitamin D tồn tại ở một số dạng khác nhau, trong đó quan trọng nhất là vitamin D3 (cholecalciferol) Chức năng quan trọng nhất của vitamin D là duy trì nồng độ calci và phosphate ở mức ổn định trong huyết tương Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy, vitamin D còn có vai trò trong sự điều hòa hoạt động tế bào và hệ miễn dịch Thiếu vitamin D thường gây nên hai tình trạng bệnh, đó là còi xương (ở trẻ em) và loãng xương (ở người lớn tuổi)

Trước đây, còi xương được coi là bệnh phổ biến ở châu Âu, nhưng gần đây nó là một vấn đề sức khỏe cộng đồng ở nhiều quốc gia, ngay cả ở nước nhiệt đới có nhiều ánh sáng mặt trời như Việt Nam Theo số liệu thống kê tại Viện Dinh dưỡng năm 2007 thì bệnh còi xương của trẻ em chiếm tỷ lệ 45,5%, năm 2010, tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi bị còi xương chiếm tới 29% nghĩa là trung bình

cứ 3 trẻ sẽ có 1 trẻ em bị mắc bệnh còi xương Kết quả nghiên cứu cho thấy, tại Việt Nam đang có tỷ lệ thiếu vitamin D ở trẻ từ 1-6 tháng tuổi tương đối cao so với các nước khác trong khu vực Tỷ lệ trẻ có lượng vitamin D thấp là 40%, và gần 24% trẻ thiếu vitamin D, trong đó số trẻ thiếu nặng là 9%

Tình trạng bệnh thứ hai là loãng xương (còn được gọi là xốp xương), nó

là một vấn đề đang được thế giới rất quan tâm, vì có quy mô lớn và gây hệ quả nghiêm trọng trong cộng đồng Theo thống kê năm 2008 trên thế giới, ở nhóm người trên 60 tuổi, tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ vào khoảng 20% và nam giới là 10% Tại Việt Nam một nghiên cứu dịch tễ ở Hà Nội vào năm 2008 cho thấy

tỷ lệ loãng xương ở nữ giới là 15,4%

Nguyên nhân chính của những thực trạng này là do sự thiếu hụt vitamin

D mà chủ yếu là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, do rối loạn chuyển hóa hay do nhu cầu cao ở phụ nữ có thai và cho con bú…

Mặt khác, việc dùng vitamin D quá liều sẽ gây ngộ độc thuốc, làm tăng calci trong máu, dẫn đến các biểu hiện: mệt mỏi, chán ăn, nôn, tiêu chảy, đau nhức xương khớp… hơn nữa còn có thể gây tổn thương thận và tăng huyết áp

Do đó, việc cung cấp cho cơ thể một lượng vitamin D vừa đủ và đều đặn mỗi ngày là một việc làm rất cần thiết

Vitamin D3 là dạng vitamin D chủ yếu mà cơ thể con người hấp thu và chuyển hóa Có hai nguồn tiếp nhận vitamin D3, đó là tổng hợp ở da dưới tác dụng của bức xạ tia cực tím trong ánh sáng mặt trời và từ các loại thực phẩm

2

như dầu cá, gan động vật, lòng đỏ trứng gà, sữa… Tuy nhiên, thực phẩm hằng ngày thường không cung cấp đủ lượng vitamin D3 cần thiết cho cơ thể, do đó người ta sử dụng thêm các loại sản phẩm dinh dưỡng bổ sung mà chủ yếu là các loại sữa

Chính vì thế, việc tìm hiểu, nghiên cứu các phương pháp để xác định hàm lượng vitamin D3 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng bổ sung là hết sức cần thiết Trên thế giới, nhiều nhà phân tích hóa học đã có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề trên Các phương pháp khác nhau đã được áp dụng để xác định hàm lượng vitamin D3 trong thực phẩm như LC, HPLC, LC/MS, LC/MS/MS Trong số các phương pháp nêu trên, LC/MS/MS được xem là một trong những phương pháp đơn giản, có tính ưu việt, tính chọn lọc cũng như có độ nhạy, độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp thích hợp để phân tích vi lượng

Trên thị trường Việt Nam hiện nay có rất nhiều loại sản phẩm sữa được

bổ sung thêm vitamin D3 với hàm lượng khác nhau nhưng việc nghiên cứu về chúng chưa được tiến hành nhiều Vì vậy, dựa vào tài liệu tham khảo kết hợp với điều kiện thực tế của Trung Tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert

Control Cần Thơ, đề tài “Xác định hàm lượng vitamin D 3 trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS)” được tiến

hành nghiên cứu, thực hiện trên một số loại sữa trên thị trường nhằm đánh giá đúng chất lượng, giá trị dinh dưỡng thực của các sản phẩm này

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài “Xác định hàm lượng vitamin D3 trong sữa bằng phương pháp sắc

ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS)” mong muốn đạt được các mục tiêu sau:

- Chọn lựa quy trình phân tích hàm lượng vitamin D3 trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS)

- Xác định hàm lượng vitamin D3 trong 20 sản phẩm sữa bột trên thị trường thành phố Cần Thơ

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Tìm hiểu các quy trình phân tích hàm lượng vitamin D3 trong sữa bằng LC/MS/MS, chọn lựa quy trình phân tích

- Điều chỉnh các điều kiện xử lý mẫu và điều kiện định lượng

- Đánh giá quy trình phân tích

- Định lượng vitamin D3 trong một số sản phẩm sữa bổ sung dạng bột trên thị trường TP Cần thơ

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vitamin [1-9]

2.1.1 Khái niệm

Vitamin là những hợp chất hữu cơ mà tế bào con người và động vật không thể tự tổng hợp được (trừ vitamin D), có mặt trong thức ăn với hàm lượng rất nhỏ, cấu trúc hoàn toàn khác với glucid, protid và lipid nhưng rất cần thiết cho một số phản ứng chuyển hóa giúp duy trì sự phát triển và sự sống bình thường, khi thiếu hụt sẽ gây nên các bệnh lý đặc hiệu

Khác với enzyme và hormone, cơ thể con người và gia súc không thể hoặc có rất ít khả năng tự tổng hợp được vitamin, vitamin hàng ngày được đưa vào cơ thể theo thức ăn dưới dạng hoàn chỉnh (vitamin) hoặc dạng gần hoàn chỉnh gọi là tiền vitamin (provitamin)

Một số loại vitamin (B6, B12, acid pantotenic, acid folic ) được hệ

vi khuẩn ở ruột tổng hợp hoặc tạo ra trong cơ thể (ví dụ acid nicotinic được tổng hợp từ tryptophan), tuy vậy các phản ứng này không đủ cung cấp cho nhu cầu của cơ thể

Nhu cầu vitamin không lớn, chỉ cần với số lượng rất nhỏ cũng đủ

để duy trì sự hoạt động bình thường của cơ thể nhưng chúng không thể thiếu được đối với sự sống Lượng cần thiết hàng ngày thay đổi tuỳ theo từng loại vitamin (ví dụ: D: 0,025 mg; C: 75 mg)

2.1.3 Phân loại

Có rất nhiều cách khác nhau để phân loại các vitamin Dựa trên khả năng hòa tan, các loại vitamin được phân chia thành 2 nhóm chính, đó là nhóm các vitamin tan trong dầu và các vitamin tan trong nước

4

Bảng 2.1 Phân loại các vitamin theo khả năng hòa tan

Vitamin tan trong dầu Vitamin tan trong nước

(Folic acid)

Vitamin B12 (Cyanocobalamin) Vitamin B15 (Pangamic acid)

Vitamin C (Ascorbic acid)

Vitamin H

(p-aminobenzoic acid) Vitamin I (inositol) Vitamin P (Flavonoids) Vitamin U (S-methyl-methionine)

Acid lipoic

2.1.4 Vai trò

Vitamin đóng vai trò là chất xúc tác trong các phản ứng sinh hóa, từ quá trình trao đổi chất, đến xây dựng hệ thống miễn dịch trong cơ thể Vitamin có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc sản sinh năng lượng, duy trì các hoạt động sống của cơ thể Mỗi loại vi chất có những công dụng riêng và đều chứa trong nguồn thực phẩm hàng ngày Vitamin giúp chuyển hóa tối đa chất dinh dưỡng thành năng lượng sống cho cơ thể, tăng cường sức đề kháng, bảo vệ cơ thể Vai trò của một số vitamin được tóm tắt trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Vai trò của một số vitamin

Vitamin Chức năng chuyển hóa

A Đồng phân hóa, điều tiết các con đường liên quan đến thị giác

D Điều hòa chuyển hóa Calci và Phospho, đặc biệt ở xương

K Điều tiết sự biến đổi protein trong quá trình đông máu

B1 Chuyển aldehyde, loại carboxyl trong quá trình lên men rượu

và chu trình acid citric B2 Phản ứng oxy hóa khử, đặc biệt trong chu trình acid citric và

5

vận chuyển điện tử B5 Phản ứng oxy hóa khử ở nhiều con đường chuyển hóa

B6 Phản ứng chuyển nhóm amino, đặc biệt ở các acid amin

B7 Phản ứng carboxyl hóa trong chuyển hóa carbohydrate và lipid

Bc Chuyển nhóm một carbon, đặc biệt ở các hợp chất chứa N

B3 Chuyển acyl ở nhiều con đường chuyển hóa

Acid lipoic Chuyển acyl, phản ứng oxy hóa khử

C Hydroxyl hóa collagen

Khi cơ thể thiếu hoặc thừa một hay nhiều loại vitamin sẽ gây nên một số bệnh lý đặc trưng Một số bệnh lý điển hình khi thiếu các loại vitamin tương ứng được tóm tắt trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 Các bệnh lý điển hình khi thiếu các loại vitamin

Vitamin Bệnh lý điển hình

A Khô mắt, phù đại giác mạc, quáng gà, tăng sừng da

D Còi xương, loãng xương, yếu cơ

E Các rối loại về sinh sản, lão hóa

K Các rối loạn về đông máu

B1 Bệnh tê phù, bệnh viêm thần kinh

B2 Viêm giác mạc, viêm da

B5 Triệu chứng Burning-Feet, viêm mũi – miệng

B6 Bệnh động kinh, viêm da, môi, lưỡi

Bc Hồng cầu khổng lồ, thiếu máu

B3 Bệnh thiếu vitamin PP (pellagra)

B12 Thiếu máu ác tính

C Bệnh thiếu vitamin C (scurvy)

Các vitamin tan trong dầu như vitamin A, D và E cần lưu ý không được

sử dụng quá liều Khi sử dụng quá liều các vitamin này sẽ gây độc, đặc biệt là vitamin A, do chúng tích tụ trong mô mỡ Các vitamin tan trong nước không gây độc khi sử dụng quá liều

Năm 1782, bác sĩ Dale Percval đã cho những đứa trẻ uống dầu cá và đã chữa trị thành công bệnh còi xương

Năm 1790, ngoài chức năng chữa bệnh bằng dầu cá, ông còn phát hiện chức năng chữa lành bệnh khi cho tiếp xúc với ánh nắng mặt trời

Năm 1865, bác sĩ Armand Trousseau đề nghị dùng liệu pháp chữa bệnh bằng dầu cá và ánh sáng mặt trời

Năm 1919, Maccollum và Mellanbourg phát hiện ra dầu cá chứa vitamin

A và vitamin D

Năm 1928, Windaus – nhà hóa học người Đức nhận giải Nobel Hóa Học

vì đã phân lập được vitamin D từ nguồn thực vật và động vật là dầu cá ngừ

2.2.2 Phân loại

Vitamin D tồn tại ở nhiều dạng (vitamer) khác nhau Chúng bao gồm vitamin D1, vitamin D2, vitamin D3, vitamin D4, vitamin D5… Trong đó hai dạng chính là vitamin D2 (còn gọi là ergocalciferol) và vitamin D3

(cholecalciferol) Vitamin D được viết không kèm theo chỉ số được hiểu là D2

hoặc D3 hoặc cả hai, chúng được gọi chung là calciferol Cấu trúc hóa học của vitamin D2 được xác định lần đầu vào năm 1931 Vào năm 1935, cấu trúc hóa học của vitamin D3 được xác định và chứng minh là nó được tạo thành từ quá trình biến đổi của 7-dehydrocholesterol dưới tác động của tia cực tím

Trong hóa học, các dạng khác nhau của vitamin D là những secosteroid – steroid bị gãy một trong những liên kết trong các vòng steroid

7

Hình 2.1 Bảng phân loại các dạng vitamin D

Sự khác biệt về cấu trúc của vitamin D2 và vitamin D3 nằm ở các chuỗi bên của chúng Chuỗi bên của vitamin D2 chứa một liên kết đôi giữa carbon

22 và 23 và một nhóm methyl trên carbon 24

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử vitamin D2 và vitamin D3

Vitamin D2 là một dẫn xuất của ergosterol, một sterol có trong màng tế bào của nấm cựa gà Sterol này cũng có trong một số loài thực vật phù

du, động vật không xương sống, nấm men, và nấm lớn Vitamin D2 được sản

8

xuất từ ergosterol trong cơ thể của các sinh vật này, dưới sự tác kích của tia cực tím Cũng giống như tất cả các loại vitamin D khác, không thể tạo ra vitamin D2 nếu không có bức xạ cực tím Các thực vật có diệp lục và động vật

có xương sống không thể tự sản xuất vitamin D2, vì cơ thể chúng không có tiền chất ergosterol

Hình 2.3 Phản ứng tổng hợp Vitamin D2

Vitamin D3 được tổng hợp từ tác động của bức xạ tia cực tím (UV) trên tiền chất 7-dehydrocholesterol của nó Da tạo ra vitamin D3 và cung cấp khoảng 90% nhu cầu vitamin D cho cơ thể Phân tử này tự xuất hiện trong da động vật và trong sữa Vitamin D3 có thể được tạo ra bằng cách cho da hoặc phơi sữa (một phương thức thương mại) tiếp xúc trực tiếp với tia cực tím Vitamin D3 cũng được tìm thấy trong cá béo và dầu gan cá tuyết

2.3 Tổng quan về vitamin D 3 [1-11]

2.3.1 Đặc điểm

Vitamin D3 còn được gọi là cholecalciferol là một trong năm dạng (vitamer) của vitamin D Vitamin D3 cùng với vitamin D2 (ergocalciferol) là hai dạng phổ biến nhất Trong đó vitamin D3 dễ dàng được hấp thu và phát huy tác dụng tốt hơn vì vitamin D2 phải trải qua một quá trình chuyển hoá nhất định thì mới trở thành dạng có hoạt tính được

Vitamin D3 là một secostreoid, cấu trúc là steroid có một vòng mở Vitamin D3 có ở các loại cá béo (cá hồi, cá thu…), dầu gan cá, sữa, lòng đỏ trứng, bơ với lượng rất thấp Vitamin D3 là một vitamin D tự nhiên vì cơ thể con người có thể tổng hợp được ở da từ 7-dehydro cholesterol dưới tác dụng của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời

Vitamin D3 không có hoạt tính sinh học, nó được chuyển đổi thành dạng

có hoạt tính thông qua các quá trình chuyển hóa trong cơ thể

9

Vitamin D3 được xem như một hormone vì nó được tổng hợp ở dưới da

đi vào máu đến cơ quan đích tạo nên tác dụng thông qua receptor đặc hiệu Hoạt tính enzyme hydroxylase xúc tác cho quá trình chuyển hóa vitamin D3

thành chất có hoạt tính được điều hòa theo cơ chế điều khiển ngược thông qua nồng độ ion calci trong máu

2.3.2 Tính chất

2.3.2.1 Tính chất vật lý

Vitamin D3 không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như petrolium ether, alcohol, methanol, chloroform…

Là tinh thể hình kim, màu trắng Không mùi

Nhiệt độ nóng chảy ở 83 - 86◦C, nhiệt độ sôi 496,4◦C

Vitamin D3 khá bền với nhiệt, môi trường acid (hữu cơ), kiềm và các tác nhân khử

Đơn vị: IU, 1 IU = 0,025 µg vitamin D3

Bị hấp thụ cực đại (trong alcohol hay hexane) ở bước sóng 264,5 nm

2.3.2.2 Tính chất hóa học

Tên IUPAC: (3β,5Z,7E)-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol

Công thức phân tử: C27 H44 O

Công thức cấu tạo:

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của cholecalciferol (vitamin D3)

Khối lượng phân tử: 384,64 g/mol

Được tổng hợp từ provitamin 7-dehydrocholesterol có sẵn trong da người

và động vật dưới tác dụng của tia cực tím có bước sóng từ: 270- 290 nm

Hình 2.6 Phản ứng hydroxyl hóa vitamin D3

2.3.3 Hấp thu và chuyển hóa

Sự chuyển hóa vitamin D3 trong cơ thể gồm các quá trình chính như sau:

- Phản ứng vòng hóa electron: 7-dehydrocholesterol có ở dưới da bị quang phân bởi tác dụng của bức xạ UV trong ánh nắng mặt trời

- Bị biến đổi thành calcitroic acid có hoạt tính sinh học thông qua các phản ứng dị hóa tại các mô đích

Hình 2.7 Các phản ứng chuyển hóa vitamin D3 trong cơ thể

Vitamin D3 được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, mật rất cần thiết cho sự hấp thụ ở ruột non

Vì vitamin D3 tan trong lipid nên được tập trung trong vi thể dưỡng chấp

và được hấp thu theo hệ bạch huyết, trong máu chúng liên kết với alpha glubomin đặc hiệu Thời gian bán hủy trong huyết tương là 19-25 giờ nhưng lại được lưu trữ lâu dài trong các mô mỡ

và tham gia vào quá trình calci hóa sụn nên rất cần cho sự phát triển xương ở trẻ em Lượng vitamin D đầy đủ trong cơ thể là điều kiện thiết yếu để canlci

và phosphate được gắn trong mô xương

Vitamin D là một chất quan trọng giúp điều hoà cân bằng nội môi của calci và phosphate trong cơ thể Oxy hóa citrate giúp cho sự hòa tan phức hợp calci và phối hợp với hormone cận giáp giúp điều hòa nồng độ calci trong máu

13

Hình 2.9 Sự điều hòa calci bởi vitamin D3 trong cơ thể con người

Vitamin D cũng đóng vai trò trong quá trình phân chia tế bào, bài tiết và chuyển hoá các hormone, bao gồm hormone tuyến cận giáp và insulin VitaminD cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự biệt hoá một số tế bào ung thư như ung thư da, xương, và các tế bào ung thư vú Tình trạng đủ vitamin D có liên quan đến giảm nguy cơ phát triển ung thư vú, đại tràng và tuyến tiền liệt Khi thiếu vitamin D, ruột không hấp thu đủ calci và phosphate làm nồng

độ calci trong máu giảm, gây hậu quả trẻ em chậm lớn, còi xương chân vòng kiềng, chậm biết đi, chậm kín thóp, người lớn bị loãng xương, xốp xương, xương thưa dễ gãy, phụ nữ có thai thiếu vitamin D3 dễ sinh trẻ bị khuyết tật ở xương

Nhìn chung, vitamin D3 và các dẫn xuất được chỉ định trong các trường hợp:

- Phòng và điều trị còi xương ở trẻ em, loãng xương, nhuyễn xương ở người lớn

- Điều trị hội chứng Fanconi

- Phòng và điều trị co giật trong suy cận giáp

Vitamin D3 gây ngộ độc khi dùng quá liều:

> 400 IU/ngày đối với trẻ dưới 1 tuổi

15

>1000 IU/ngày đối với trẻ trên 1 tuổi

>50.000 IU/ngày với cả trẻ em và người lớn

Khi ngộ độc có biểu hiện tăng calci máu, chán ăn, mệt mỏi, tiểu nhiều, khát nước, nôn, tiêu chảy, rối loạn tâm thần Tăng calci máu kéo dài gây calci hóa các tạng và có thể gặp suy thận

Bảng 2.4 Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin D3

Ngoài ra, còn có thể bổ sung lượng vitamin D3 cần thiết bằng các loại thuốc, viên uống bổ sung, thực phẩm chức năng… Tuy nhiên, cần tham khảo ý kiến bác sĩ trước khi sử dụng vì đa phần hàm lượng vitamin D3 trong các sản phẩm này rất cao

16

2.3.6.2 Nội sinh

Đây là nguồn cung cấp vitamin D3 chủ yếu cho cơ thể, vì vậy nên tiếp xúc với ánh nắng mặt trời một cách thích hợp Riêng với trẻ em cần cho trẻ chơi ngoài trời với thời gian thích hợp, cho trẻ tắm nắng vào buổi sáng sớm, ngồi chỗ có ánh nắng mặt trời, không có gió lùa, bỏ bớt quần áo và tả lót và cho trẻ tiếp xúc với ánh nắng ngay từ tháng đầu sau khi sinh để cơ thể trẻ tự tổng hợp vitamin D3

2.3.7 Ứng dụng

Trong y học, người ta dùng các chế phẩm vitamin D3dưới nhiều dạng khác nhau như dạng viên nén hoặc dạng hòa tan trong dầu để điều trị các bệnh thiếu vitamin D

Hình 2.10 Các chế phẩm vitamin D3 trên thị trường

Ngoài ra, vitamin D3 còn được thêm vào trong các loại viên uống bổ sung hay thực phẩm chức năng đảm bảo cung cấp đủ lượng vitamin D3 cơ thể cần

Hình 2.11 Các loại thực phẩm chức năng bổ sung vitamin D3 trên thị trường

Chất không xà phòng hóa bao gồm các lipit có nguồn gốc tự nhiên như sterol, các hydrocarbon có mạch carbon cao, các loại alcohol, alcohol bão hòa, alcohol terpenic… được chiết bằng dung môi và không bay hơi ở 103oC Vitamin D3 là một secosteroid, một lipid có nguồn gốc tự nhiên (sterol) nên không bị xà phòng hóa Phương pháp này được áp dụng để loại các chất béo khác vitamin D3 có trong mẫu

18

2.4.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng [13]

Nguyên tắc: nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng-lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số cân bằng

K

𝐾 =𝐶𝑎

𝐶𝑏Trong đó:

𝐶𝑎: Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng

𝐶𝑏: Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng Mục đích chính của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ tinh chế hóa một hợp chất nào đó Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này có hằng số phân bố lớn còn các chất tạp bẩn cũng như các chất khác có cấu trúc hóa học không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó

Hằng số phân bố của những chất tan tương đối ít thay đổi theo nhiệt độ hoặc nồng độ của chất tan đó có trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên hằng số này thay đổi nhiều tùy vào dung môi (độ phân cực, đặc tính ái nước của dung môi) và dung dịch nước (pH, lực ion) Riêng với dung dịch nước, pH của dung dịch có những ảnh hưởng quan trọng, nhất là ở pH acid yếu và pH base yếu Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó chất phân tích ban đầu được hoà tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu

cơ, loại không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi)

Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: ether dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate, buthanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các

sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp Khi dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương có thể sử dụng một đũa thủy tinh dài đưa vào trong bình lóng, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp, cũng có thể phá nhũ bằng cách ly tâm dung dịch; ngoài ra, có thể thêm dung dịch NaCl bão hòa hoặc acetonitrile vào hỗn hợp đang tạo nhũ, khi đó hỗn hợp

sẽ tách thành hai lớp rõ rệt

2.5 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS) [11-16]

2.5.1 Tổng quan về LC/MS/MS [13-18]

LC/MS/MS là phương pháp sắc ký lỏng ghép với hệ thống máy khối phổ

2 lần liên tiếp Việc ghép máy sắc ký lỏng vào máy khối phổ không thể được thực hiện trực tiếp vì muốn đo khối phổ cần phải tạo ra các ion ở thể khí, trong khi sắc ký lỏng được áp dụng cho những trường hợp chất ít bay hơi.Vấn đề còn phức tạp thêm ở việc khi hợp chất đi ra khỏi cột sắc ký lỏng, hợp chất đó đang ở trong pha động lỏng, cần phải loại bỏ dung môi trước khi đưa hợp chất khảo sát vào máy khối phổ

Hình 2.13 Hệ thống LC/MS/MS điển hình

Những sự không tương thích cơ bản giữa hai loại máy là:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao hoạt động trong điều kiện: áp suất cao, nhiệt độ tương đối thấp, các chất khảo sát ở thể lỏng, vận tốc dòng chảy lớn (vài mL/phút)

20

- Máy khối phổ hoạt động trong điều kiện: chân không sâu, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ (vài µL/phút)

Để khắc phục những khó khăn trên trong việc ghép hai loại máy lại với nhau, cần phải có một trung gian là giao diện Có nhiều loại giao diện khác nhau như: chùm tia hạt (PB), bắn phá nhanh nguyên tử dòng liên tục (CF – FAB), tia nhiệt (TSP), ion hóa bằng cách phun ion (ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)… Tùy thuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính của hợp chất khảo sát mà có thể lựa chọn các giao diện khác nhau

2.5.2 Cấu tạo hệ thống LC/MS/MS

Một hệ thống LC/MS/MS cơ bản bao gồm 3 bộ phận chính: Hệ thống LC (hay HPLC), hệ thống phân tích khối phổ MS/MS và bộ phận hiển thị kết quả

Hình 2.14 Sơ đồ cấu tạo hệ thống LC/MS/MS

Hệ thống được sử dụng trong đề tài là LC/MS/MS AB Sciex QTRAP4500 với đầu dò ba tứ cực

21

áp, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt Detector, hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu, điều khiển hệ thống HPLC và in dữ liệu

Hình 2.16 Sơ đồ phác họa một hệ thống HPLC cơ bản

Hệ thống trang bị của HPLC bao gồm các bộ phận chính:

a) Bình chứa pha động

Hình 2.17 Phác họa cấu tạo một bình chứa pha động thông thường

Hệ dung môi giải ly cột được hút ra từ các bình chứa dung môi Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh Bình luôn luôn có nắp bảo vệ, nắp có lỗ hở để thông với không khí Trong bình có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, ở đầu này có gắn một nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng Trước khi lắp một bình dung môi vào vị trí hoạt động, cần phải loại

bỏ (khử) bọt khí vì chúng làm máy bơm và detector hoạt động kém hiệu quả Hiện tại, các máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao

áp Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%

22

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 3 hay 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định

b) Bộ khử khí (Degasses)

Mục đích của bộ khử khí là nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

- Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

c) Bơm cao áp (Pump)

Loại bơm của máy HPLC là loại bơm đặc biệt với áp suất rất cao lên đến 7.000 psi (48,3 MPa) để bơm pha động vào cột tách, đi xuyên ngang qua một pha tĩnh (được nhồi thật chặt bởi những hạt thật mịn) với một vận tốc không đổi (thường vào khoảng 0,5-4,0 mL/phút), thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký Bơm được cấu tạo bằng chất liệu chịu được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm

Cột HPLC được làm bằng thép không gỉ, thường dài từ 10-25 cm và có đường kính bên trong 2,1-4,6 mm Cột sắc ký được nhồi thật chặt bởi những hạt nhỏ đường kính ≤ 5µm, đạt tiêu chuẩn >10.000 mâm lý thuyết/mét Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thuận)hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxide, polymer xốp, chất trao đổi ion

23

Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường Chúng được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha đảo RP C18 (ODS), cột pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường

Cột C18 được sử dụng trong đề tài là Zorbax Eclipse XDB – C18, XDB (eXtra Densely Bonded) ưu điểm là có tốc độ phân tích và độ phân giải cao, khoảng pH cho phân tích tốt là từ 2-9, loại cột hạn chế tối đa sự tạo thành silanol

Trước khi pha động đi vào cột phân tích, nó phải được cho đi ngang một cột bảo vệ, sử dụng để lọc bỏ những chất tạp bẩn còn sót lại.Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (oven column)

f) Detector (đầu dò)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

A = k.C Trong đó:

A: là tín hiệu đo được

C: Nồng độ chất phân tích

K: là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại detector sau:

- Detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS

- Detector hấp thu phổ nguyên tử AES hay AAS

- Detector phổ huỳnh quang

- Detector điện hóa (đo vòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng)

24

- Detector chiết suất

- Detector đo độ dẫn nhiệt

- Detector diode phát quang và diode mảng

- Detector đo khối lượng (khối phổ MS)

Tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp nhằm đạt được độ nhạy cao, định lượng chính xác Hệ thống LC/MS/MS cơ bản là một hệ thống HPLC đầu dò khối phổ MS

g) Trang bị chỉ thị kết quả

Có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các peak của các chất, rồi đến bộ phân tích kế (intergrator), sau đó là máy tính và máy in kèm theo để xử lý và in kết quả

Ngoài ra, các hệ thống HPLC hiện đại còn được trang bị thêm các bộ phận như:

- Bộ chương trình gradient dung môi (pha động)

- Bộ gia nhiệt và ổn định nhiệt độ cho cột sắc ký

- Máy tính và các phần mềm điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC, xử lý

và in kết quả tách hay bộ tách phân kế

25

- Tia nhiệt (TSP)

- Ion hóa bằng cách phun ion (ESI)

- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)…

Tùy thuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính (phân cực – không phân cực) của hợp chất khảo sát mà có thể sử dụng máy LC-MS với các nguồn tạo ion khác nhau Hệ thống LC/MS/MS sử dụng trong đề tài được tích hợp cả hai nguồn tạo ion là ESI và APCI, tuy nhiên kỹ thuật ESI được sử dụng vì đơn giản và cho hiệu quả tốt hơn

Phương pháp ion hóa phun điện (ESI)

26

Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch để phun sương Dung môi phù hợp để phun sương là ethanol, methanol, isopropanol, acetonitrile, acetone, chloroform…

- Ứng dụng: được ứng dụng để ion hóa những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), ESI được xem là kỹ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide, vitamin…

b) Hệ máy khối phổ thứ nhất (tứ cực Q1)

Cấu tạo: Được cấu tạo bởi bốn thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Hai cặp thanh điện cực đối nhau sẽ tích dòng điện một chiều trái nhau cùng với tần số vô tuyến luôn biến đổi Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng điện một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF)

Hình 2.20 Sơ đồ phác họa cấu tạo một tứ cực

Nguyên tắc: sau khi ra khỏi buồng ion hóa, các ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào hệ MS1, tại đây tứ cực 1

sẽ quét phân tích và chọn lọc ra ion mẹ (precursorion) Khi các ion phân tích đi vào vùng tứ cực (Q1) sẽ di chuyển theo hình sin do tác dụng của dòng điện một chiều tích điện trên các thanh tứ cực và sự quét tín hiệu tần số vô tuyến Mỗi ion có khối lượng khác nhau và có một tần số quét khác nhau Các ion có cùng tần số với tần số quét sẽ đi ra ngoài, các ion còn lại sẽ tiếp tục đi vào vùng va chạm Q2 Các ion con được chọn sẽ đi tiếp vào detector

c) Buồng va chạm (tứ cực Q2)