XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TÓM TẮT Để đảm bảo sự cân bằng giữa các amino acid trong sản phẩm thức ăn chăn nuôi cần tiến hành phân tích xác định hàm lượng các amino acid bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

2 Tên đề tài: Xác định hàm lượng lysine, methionine và threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3 Sinh viên thực hiện:Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424

Lớp: Hóa Dược – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

 Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp

 Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

Những vấn đề còn hạn chế:

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424

Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

 Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp

 Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

Những vấn đề còn hạn chế:

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

Cán bộ phản biện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Năm học 2015 – 2016

Đề tài: “XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINETRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LỜI CAM ĐOAN

Em tên: Nguyễn Thị Ngọc Châm tác giả của luận văn này, em xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của riêng

em, các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác và đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng chấm bảo vệ luận văn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2015

Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

LỜI CẢM ƠN 

Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại Trường Đại học Cần Thơ cùng với quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, dưới sự quan tâm, giúp đỡ và tận tình chỉ dẫn từ quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè, em đã học hỏi được rất nhiều kiến thức từ sách vỡ, cũng như kinh nghiệm thực tiễn rất bổ ích cho bản thân Để có được thành quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Khoa Khoa học

tự nhiên cùng tất cả quý Thầy Cô đã giảng dạy những kiến thức quý báu cho

em trong suốt quá trình học tập của mình

Ban lãnh đạo Trung tâm Phân Tích và Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về hóa chất, thiết bị, dụng cụ để giúp em hoàn thành tốt nhất luận văn này

Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ts Nguyễn Thị Thu Thủy

Cảm ơn cô đã truyền dạy những kiến thức sâu rộng của mình, tận tình hướng dẫn cùng với sự quan tâm ân cần, âm thầm hỗ trợ và động viên tinh thần, cô đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em vượt qua mọi khó khăn và hoàn thành luận văn của mình Xin gửi đến cô lời cảm ơn sâu sắc nhất!

Xin gửi lời cảm ơn đến Ts Tôn Nữ Liên Hương, đã dẫn dắt em và lớp

Cử nhân Hóa Dược Khóa 38 trong suốt 4 năm học tại trường Cảm ơn cô đã truyền lại những kiến thức quý báu về chuyên ngành cũng như sự quan tâm sâu sắc và tận tụy, giúp chúng em vượt qua mọi rào cản khó khăn trong học tập

Cảm ơn CN La Văn Thái – Trưởng phòng thí nghiệm Trung tâm Phân Tích và Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, CN Bùi Thị Quỳnh Hoa –

kiểm nghiệm viên phòng phân tích sắc ký và các anh chị tại công ty, đã nhiệt tình hướng dẫn, chia sẽ kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại đây

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã yêu thương, chăm sóc và hỗ trợ con trong suốt quãng thời gian học tập, là chỗ dựa tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống, tạo mọi điều kiện

để con hoàn thành chương trình học của mình Cám ơn bạn bè và mọi người xung quanh đã luôn đồng hành, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

TÓM TẮT

Để đảm bảo sự cân bằng giữa các amino acid trong sản phẩm thức ăn chăn nuôi cần tiến hành phân tích xác định hàm lượng các amino acid bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao , đề tài tiến hành phân tích

định lượng lysine, methionine và threonine là các amino acid thiết yếu

thường được phối trộn trong thức ăn chăn nuôi nhằm tăng tốc độ sinh trưởng

và năng suất sản xuất của vật nuôi, phương pháp ứng dụng phân tích bằng máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Mẫu thức ăn chăn nuôi được thủy phân với dung dịch HCl 6M (103 ◦ C trong 24 giờ) và tạo dẫn xuất tiền cột với ortho-phthaladehyde với sự có mặt của tác chất 3-mercaptopropanoic acid tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang mạnh, quá trình tạo dẫn xuất tiền cột được tự động hóa với thiết bị bơm và lấy mẫu tự động (autosampler), sự phân tách được thực hiện trên cột Agilent Zorbax Eclipse- AAA (4,6 150 mm, 5 m) và được phát hiện bằng detector DAD ở bước sóng

( 338nm

Phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao (sự sai khác về thời gian lưu trên mẫu thử và mẫu chuẩn nhỏ hơn 4 %), khoảng tuyến tính rộng (3 - 150 ppm, R 2 > 0,995), phương pháp có độ chụm đạt (RSD = 2,6 % với lysine, 2,5

% với methionine, 0,8 % với threonine ) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp (Lysine: LOD = 1,131 ppm; LOQ = 3,392 ppm, Methionine: LOD

= 1,343 ppm; LOQ = 4,029 ppm, Threonine: LOD = 1,593 ppm; LOQ = 4,779 ppm) Kết quả phân tích độ đúng trên mẫu thử có kết quả khá chính xác với độ lệch chuẩn tương đối của mẫu nguyên liệu lysine đạt (RSD = 1,03 %),

độ chệch (bias) đạt -1,43 % Kết quả phân tích thu được hàm lượng phù hợp với tỉ lệ phối trộn trong thức ăn chăn nuôi với hàm lượng lysine khoảng 0,53 – 1,89 %, methionine 0,25 – 0,52 % và threonine 0,32 – 1,44 %

Từ khóa: amino acid, thức ăn chăn nuôi, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tạo dẫn xuất tiền cột với OPA

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 2

1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Khái quát về amino acid 4

2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid 4

2.1.2 Phân loại amino acid 4

2.1.3 Tính chất vật lý 8

2.1.4 Tính chất hóa học 9

2.2 Lysine 11

2.2.1 Giới thiệu về lysine 11

2.2.2 Tác dụng của Lysine 12

2.3 Methionine 13

2.3.1 Giới thiệu về Methionine 13

2.3.2 Tác dụng của methionine 13

2.4 Threonine 14

2.4.1 Giới thiệu về threonine 14

2.4.2 Tác dụng của threonine 15

2.5 Một số phương pháp định lượng amino acid 15

2.5.1 Phương pháp sắc ký giấy 15

2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17

2.5.3 Phương pháp sắc ký khí 17

2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 17

2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 18

2.6.1 Khái niệm 18

2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký 18

2.6.3 Phân loại 19

2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20

2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định 22

2.8 Thủy phân protein 23

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 25

3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm 25

3.1.1 Địa điểm thí nghiệm 25

3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm 25

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 25

3.1.4 Hóa chất 25

3.1.5 Đối tượng thí nghiệm 26

3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.2.1 Chuẩn bị mẫu 26

3.2.2 Khảo sát thời gian lưu 26

3.2.3 Xây dựng đường chuẩn dựa trên khoảng tuyến tính 27

3.2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện 29

3.2.5 Khảo sát giới hạn định lượng 30

3.2.6 Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) 31

3.3 Thực nghiệm 36

3.3.1 Quy trình xử lý mẫu và phân tích trên HPLC 36

3.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, pha động và dung dịch phân tích 36

3.3.3 Điều kiện chạy máy HPLC 39

3.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lưu của mẫu chuẩn lysine, methionine và threonine 40

3.3.5 Xây dựng đường chuẩn 40

3.3.6 Xác định giới hạn phát hiện 40

3.3.7 Xác định giới hạn định lượng 40

3.3.8 Thí nghiệm khảo sát độ chính xác của phương pháp 40

3.3.9 Tiến hành thí nghiệm trên mẫu 41

3.3.10 Công thức tính toán kết quả 41

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Kết quả khảo sát thời gian lưu 42

4.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn 42

4.3 Giới hạn phát hiện 44

4.4 Giới hạn định lượng 44

4.5 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp 44

4.5.1 Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp 44

4.5.2 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 45

4.6 Kết quả tiến hành trên mẫu thử 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp 7

Bảng 3.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 33

Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 35

Bảng 3.3 Quy định về độ thu hồi của Hội đồng châu Âu 35

Bảng 3.4 Điều kiện điều chỉnh máy HPLC trong quá trình phân tích 39

Bảng 3.5 Xây dựng dãy chuẩn lysine, methionine và threonine 40

Bảng 4.1 Thời gian lưu của mẫu chuẩn của 3 loại amino acid 42

Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính 42

Bảng 4.3 RSD (%) của hàm lượng methionine trong thức ăn chăn nuôi 44

Bảng 4.4 RSD (%) của hàm lượng lysine trong thức ăn chăn nuôi 45

Bảng 4.5 RSD (%) của hàm lượng threonine trong thức ăn chăn nuôi 45

Bảng 4.6 Hàm lượng lysine trong mẫu nguyên liệu 45

Bảng 4.7 Độ chệch của phương pháp dựa trên độ chệch của hàm lượng mẫu nguyên liệu 46

Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi 46

Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid 4

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I 5

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II 5

Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III 6

Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV 6

Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V 6

Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid 9

Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid 9

Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid 10

Hình 2.10 Phản ứng Sorensen 10

Hình 2.11 Phản ứng màu Biure 11

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein 11

Hình 2.13 Công thức các dạng đồng phân lập thể của lysine 12

Hình 2.14 Công thức các dạng đồng phân lập thể của methionine 13

Hình 2.15 Công thức các dạng đồng phân lập thể của threonine 14

Hình 2.16 Mô tả sắc ký giấy đi lên 16

Hình 2.17 Sơ đồ bể sắc ký giấy một chiều đi lên 16

Hình 2.18 Hệ thống máy sắc ký HPLC tại các phòng thí nghiệm 18

Hình 2.19 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 20

Hình 2.20 Công thức cấu tạo của OPA 22

Hình 2.21 Phương trình tạo dẫn xuất với thuốc thử OPA 23

Hình 3.1 Thời gian lưu trên sắc ký đồ 27

Hình 3.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc 28

Hình 3.3 Minh họa tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu 30

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu và phân tích amino acid trên HPLC 36

Hình 4.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn của lysine 42

Hình 4.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn của methionine 43

Hình 4.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của threonine 43

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

3-MPA 3 – Mercaptopropanoic acid

AOAC Association of analytical comunities

AQC 6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate HPLC High perfomance liquid chromatography

DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, chăn nuôi đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp hiện đại ở nước ta Trong năm 2014, ngành chăn nuôi đạt 24,5% trong tổng giá trị sản xuất nông nghiệp, là một trong hai nguồn cung cấp lương thực – thực phẩm chủ yếu cho đời sống người dân bên cạnh ngành trồng trọt Chăn nuôi cũng là một mắt xích quan trọng trong sản xuất nông nghiệp bền vững, góp phần tạo việc làm, tăng thu nhập cho người dân Như chúng ta đã biết, ngành chăn nuôi là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho con người, các sản phẩm chăn nuôi có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp protein và có hàm lượng cao hơn các thức ăn có nguồn gốc thực vật Vì vậy, thực phẩm từ chăn nuôi có giá trị dinh dưỡng cao đối với đời sống con người Để đáp ứng nhu cầu đó, đối với ngành chăn nuôi ngoài yếu tố cần có chất lượng con giống tốt, chúng ta cũng cần đảm bảo các yếu tố dinh dưỡng cho vật nuôi bằng việc cung cấp đầy đủ thức ăn và cân bằng giữa các yếu tố dinh dưỡng Thị trường thức ăn chăn nuôi hiện nay ở nước ta rất đa dạng, các nhà sản xuất đã nghiên cứu và phát triển ra những dòng sản phẩm thức ăn chăn nuôi bổ sung đầy đủ các thành phần như: protein, amino acid, carbohydrate và các thành phần quan trọng khác như: vitamin, khoáng đa lượng và vi lượng, Trong đó, việc bổ sung và cân đối hàm lượng amino acid là rất quan trọng Vì amino acid là nhân tố không thể thiếu trong thức ăn chăn nuôi, nó giữ vai trò quan trọng đối với cơ thể gia súc, gia cầm Thêm vào đó, amino acid là một trong những dưỡng chất quan trọng trong quá trình sinh trưởng, tạo ra sản phẩm và nâng cao hiệu quả, hiệu suất sử dụng thức ăn của vật nuôi, giúp nâng cao tốc độ tăng trưởng và chất lượng thịt của gia súc, gia cầm mà không dùng đến các chất kích thích tăng trọng họ β – agonist bị cấm sử dụng trong chăn nuôi

Đối với gia súc và gia cầm, các loại amino acid đặc biệt quan trọng cần cung cấp hằng ngày gồm: methionine, lysine, threonine Trong đó, methionine, lysine, threonine là các loại amino acid thiết yếu mà cơ thể động vật không thể tự tổng hợp được, phải lấy từ thức ăn bên ngoài Do vậy, cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng và amino acid trong khẩu phần ăn theo đúng nhu cầu cho từng loại vật nuôi nhằm tăng khả năng sinh trưởng, phát triển và chất lượng thịt của gia súc và gia cầm

Để xác định hàm lượng và đảm bảo cân bằng tỉ lệ các thành phần dinh dưỡng nói chung và amino acid nói riêng, bằng các phương pháp phân tích hóa học hiện đại, ta có thể định lượng và đánh giá thành phần các amino acid trong thức ăn chăn nuôi một cách dễ dàng mà vô cùng chính xác

Do vậy, đề tài “Xác định hàm lượng lysine, methionine và threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” nhằm khảo sát quy trình định lượng các loại amino acid nói chung

và lysine, methionine, threonine nói riêng, góp phần xác định thành phần dinh dưỡng và đánh giá chất lượng các sản phẩm thức ăn chăn nuôi bằng một phương pháp phổ biến, có độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp Từ đó,

có thể ứng dụng vào thực tiễn để làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về nhu cầu protein, amino acid của người và động vật, cũng như góp phần làm hoàn thiện các phương pháp phân tích protein

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm điều kiện tối ưu về quy trình xử lý mẫu, quy trình định lượng lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Áp dụng và ổn định phương pháp phân tích amino acid trong thức ăn chăn nuôi từ đó đánh giá được chất lượng một số loại thức ăn chăn nuôi được bán trên thị trường ở thành phố Cần Thơ

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân tích định tính: lysine, methionine, threonine dựa vào thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử từ kết quả phân tích trên HPLC

Phân tích định lượng: Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lệch chuẩn (RSD), độ chính xác của phương pháp

Tiến hành phân tích định lượng lysine, methionine, threonine trên mẫu thức ăn chăn nuôi tại địa bàn Thành phố Cần Thơ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về amino acid

2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein, hormone và enzyme,…là hợp chất hữu cơ mà trong phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxylic (–COOH)

và một nhóm amine (–NH2) trừ proline chỉ có nhóm NH (được gọi là imino acid) Trong phân tử amino acid đều có các nhóm –NH2 và –COOH gắn với carbon ở vị trí

Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid

Trong tự nhiên có khoảng 150 loại amino acid khác nhau nhưng chỉ có 20 loại trong số chúng tham gia cấu tạo nên phân tử protein Hầu hết các protein khi thủy phân đều thu được dưới dạng L-α-amino acid Như vậy các amino

acid chỉ khác nhau ở mạch nhánh hay còn gọi là chuỗi bên (Kí hiệu: R)

2.1.2 Phân loại amino acid [1]

Có nhiều cách để phân loại amino acid, mỗi loại đều có ý nghĩa và mục đích riêng Tuy nhiên, có thể phân loại amino acid một cách chung nhất theo

hai quan điểm: quan điểm hóa học và quan điểm sinh vật học

- Quan điểm hóa học (xét về cấu tạo phân tử, hóa tính): có thể chia amino acid ra thành các nhóm

 Amino acid mạch thẳng: Dựa vào số lượng nhóm –NH2 và –COOH

Ngoài ra, dựa vào tính chất của gốc R người ta còn phân loại amino acid thành 5 nhóm: nhóm không phân cực (nhóm kỵ nước), nhóm phân cực nhưng không tích điện, nhóm tích điện dương, nhóm tích điện âm và nhóm R là nhân thơm

 Nhóm I Gồm 7 amino acid có gốc R không phân cực kỵ nước: glycine, alanine, proline, leucine, isoleucine, valine, methionine

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I

 Nhóm II Gồm 3 amino acid có R là nhân thơm: phenylalanine, tyrosine, tryptophan

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II

 Nhóm III Gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: serine, threonine, aspargine, cystein, glutamine

Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III

 Nhóm IV Gồm 3 amino acid có gốc R tích điện dương: lysine, histindine, arginine

Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV

 Nhóm V Gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate, glutamate

Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V

- Quan điểm sinh vật học (xét về tầm quan trọng đối với dinh dưỡng động vật) được chia thành 2 loại:

 Amino acid không thay thế được hay còn gọi là amino acid thiết yếu: đây là amino acid rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể

động vật Cơ thể động vật không thể tự tổng hợp được loại amino acid này mà phải bổ sung vào cơ thể hằng ngày bằng thức ăn

 Đối với người trưởng thành có 8 loại amino acid thiết yếu: lysine, valine, methionine, threonine, tryptophan, leucine, isoleucine, phenylalanine

 Đối với trẻ em, do quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể chưa hoàn chỉnh nên ngoài 8 amino acid thiết yếu trên còn cần thêm 2 amino acid là arginine và histidine

 Amino acid thay thế được hay còn gọi là amino acid không thiết yếu: là amino acid mà cơ thể động vật có thể tự tổng hợp được từ các nguyên liệu sẵn có Nhóm này gồm các amino acid còn lại

Theo nhiều nghiên cứu, tuy tyrosine và cystein là các amino acid không thiết yếu cơ thể có thể tổng hợp được nhưng với điều kiện phải có phenylalanine cơ thể mới có thể tổng hợp được tyrosine và phải có methionine mới tổng hợp được cystein Do vậy, nếu trong khẩu phần ăn của người và động vật nếu không bổ sung đầy đủ phenylalanine và methionine sẽ dẫn đến thiếu hụt tyrosine và cystein

Ngoài các amino acid thường gặp ở trên, trong phân tử protein còn có một

số amino acid khác, đó là những loại ít gặp Các amino acid này là dẫn xuất của những amino acid thường gặp như: trong phân tử colagen có chứa 4 – hydrogenxyproline là dẫn xuất của proline, 5 – hydrogenxylysine là dẫn xuất của lysine Mặt khác, mặc dù không có trong cấu trúc protein, nhưng có rất nhiều loại amino acid khác thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với hợp chất khác trong các mô và tế bào, chúng có thể là chất tiền thân hay là các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hoá trong cơ thể sinh vật

Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp

Ký hiệu

Khối lượng (M) Glycine

--amino--idolylpropionic

-amino--hydoxypropionic

-amino-hydrogengenxybutiric

--amino--tiopropionic amide của aspartate amide của glutamate

Trp Ser Thr

Cys Asn Gln Lys His Arg Asp Glu

mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamate)

Tính tan trong nước:

Các amino acid thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether (trừ proline và hydrogenxyproline) Chúng cũng dễ hòa tan trong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine)

Tính quang học

Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái Quay phải được ký hiệu bằng dấu (+), quay trái được ký hiệu bằng dấu (-) Góc quay đặc hiệu của amino acid phụ thuộc vào pH của môi trường Tuỳ theo sự sắp xếp trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà các amino acid có cấu trúc dạng D hay L (Hình 2.7) gọi là đồng phân lập thể Số đồng

phân lập thể được tính theo 2n (n là số carbon bất đối)

Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid

Hầu hết các amino acid khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng ( ) khoảng từ

220 - 280 nm Đặc biệt cùng nồng độ 10-3 M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine và phenylalanine là yếu nhất Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein

2.1.4 Tính chất hóa học [2]

Amino acid có tính lưỡng tính

Do trong phân tử có cả nhóm amino (–NH2) và nhóm carboxylic (–COOH) vừa có khả năng nhận proton (H+) thể hiện tính base, vừa có khả năng nhường proton thể hiện tính acid

Dạng ion lƣỡng cực Dạng phân tử

Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid

Phản ứng với ninhydrin

Khi đun nóng amino acid với ninhydrin tạo phức màu xanh tím (trừ proline cho màu vàng).Các nhà phân tích cũng lợi dụng tính chất này để định lượng amino acid bằng cách định lượng khí NH3, CO2 hoặc aldehyde vừa tạo thành

Khi nghiên cứu tính chất hóa học của amino acid ta phát hiện ra rằng nhóm

α– amine có khả năng trùng hợp với dinitrobenzene Trong mạch chỉ có một

nhóm α– amine tự do ở đầu N, khi trùng hợp sẽ tạo thành dinitropheny –

polypeptide Liên kết này rất bền, do đó khi dùng HCl thủy phân protein sẽ giải phóng ra tất cả các amino acid tự do cùng với amino acid liên kết với dinitrobenzene dưới dạng dinitrophenyl – amino acid Sau đó, với phương pháp sắc ký ta có thể định danh amino acid đó

Phản ứng Sorensen (phản ứng với aldehyde formic – formalin)

Phản ứng với kim loại nặng

Hình 2.11 Phản ứng màu Biure

Các amino acid có khả năng phản ứng với các kim loại nặng, tạo thành hợp chất phức nội phân tử với các muối của kim loại đó, đặc biệt là với ion Cu2+, phản ứng tạo thành phức chất Biure có màu đỏ tím

Ngoài ra, do các amino acid có cấu tạo gốc R khác nhau, nên người ta có thể dùng để xác định từng amino acid riêng rẽ nhờ phản ứng đặc trưng của nó,

ví dụ phản ứng oxy hoá khử do nhóm –SH của cysteine, phản ứng tạo muối do các nhóm –COOH hay –NH2 của glutamte hay lysine, phản ứng tạo ester do nhóm OH của tyrosine

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein 2.2 Lysine [3]

2.2.1 Giới thiệu về lysine

- Lysine (viết tắt là Lys hoặc K) Tên khoa học: 2,6-diaminohexanoic acid

- Lysine là một α-amino acid chứa hai nhóm –NH2 và một nhóm –COOH với công thức phân tử: C6H14N2O2

- Công thức hóa học: HOOCCH(NH2)(CH2)4NH2

- Nó là một amino acid thiết yếu, cơ thể không thể tự tổng hợp được Trong cấu tạo phân tử có chứa một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-Lysine và L-Lysine Hai đồng phân này có

Phức Biure có màu đỏ tím

Oxy hóa Khử

tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau và cơ thể sinh vật chỉ hấp thu được dạng

- Lysine tồn tại ở dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy ở 200-300◦C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrine

- Lysine có nhiều trong trứng, thịt, sữa, cá, đậu nành… nhưng dễ bị phá huỷ trong quá trình chế biến, nấu nướng thức ăn

- Lysine cần thiết cho sự phát triển xương của trẻ, hỗ trợ sự hấp thụ calci, duy trì sự cân bằng nitơ trong cơ thể

- Lysine giúp ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hoá và hấp thu tối đa chất dinh dưỡng và phát triển chiều cao

- Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ khó hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển kém, dễ thiếu men tiêu hoá và nội tiết tố Chính vì

thế lysine là một loại amino acid thường được thêm vào khẩu phần ăn của trẻ em và của gia súc

2.3 Methionine [4]

2.3.1 Giới thiệu về Methionine

- Methionine (viết tắt là Met hay M) Tên khoa học: (methylthio)butanoic acid

2-amino-4 Methionine là một -amino acid chứa lưu huỳnh Có công thức phân tử:

C5H11NO2S

- Công thức cấu tạo: H3CS(CH2)2CH(NH2)COOH

- Methionine là một trong 2 amino acid chứa lưu huỳnh (amino acid còn lại là cystein) Nguyên tử lưu huỳnh trong Methionine không có tính thân hạch mạnh mặc dù nó có thể phản ứng với một vài trung tâm thân điện

tử Methionine thường không tham gia vào liên kết hóa học ở trung tâm hoạt động của enzyme

- Methionine có nhiều trong thịt gà, thịt bò, trứng, cá, tỏi, yogurt và các loại đậu

Hình 2.14 Công thức các dạng đồng phân lập thể của methionine

2.3.2 Tác dụng của methionine

- Khi là một amino acid tự do, methionine đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa của cơ thể Nó có thể tạo S-Adenosyl-L-Methionine (SAM), một chất cho methyl trong các phản ứng

- Methionine cũng được cho là làm giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể, giảm nồng độ cholesterol trong máu, giúp giải phóng chất độc trong gan,

bảo vệ đặc hiệu tế bào gan, ngăn ngừa tế bào gan thoái hóa mỡ, cần thiết trong việc tổng hợp ADN và ARN

- Methionine tăng cường tổng hợp glutathion và được sử dụng thay thế cho acetylcysteine để điều trị ngộ độc paracetamol

- Methionine cũng là một chất chống oxi hóa mạnh, có thể khử hoạt tính của gốc tự do Ngoài ra, do trong phân tử có chứa lưu huỳnh nên nó có thể chống lại các bệnh lở da, tóc và móng

- Tuy nhiên ở những người đã bị suy gan, methionine có thể làm cho tổn thương gan nặng

2.4 Threonine [4]

2.4.1 Giới thiệu về threonine

- Threonine (viết tắt Thr hoặc T) Tên khoa học: hydroxybutanoic acid

2-amino-3 Threonine là một amino acid thiết yếu Công thức phân tử: C4H9NO3

- Công thức cấu tạo: HOOCCH(NH2)CH(OH)CH3

- Ở nhiệt độ thường, threonine tồn tại ở dạng tinh thể không màu

- Threonine là một amino acid phân cực, ưa nước và phân tử ái điện tử Threonine có chứa nhóm –OH (alcohol) Cả carbon ở vị trí và đều có hoạt tính mạnh

- Threonin là một trong hai trên hai mươi axit amin sinh protein có hai tâm đối xứng Threonin có thể tồn tại dưới bốn dạng đồng phân lập thể với

các cấu hình sau: (2S,3R), (2R,3S), (2S,3S) và (2R,3R) L-Threonin được

dùng để chỉ đồng phân không đối quang hydroxybutanoic acid Đồng phân lập thể thứ hai (2S,3S) hiếm khi có

(2S,3R)-2-amino-3-mặt trong tự nhiên, được gọi là L-allo-threonin Hai đồng phân lập thể

(2R,3S)- và (2R,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoic aicd có vai trò không

- Nó cần thiết để giúp duy trì sự cân bằng protein thích hợp trong cơ thể, cũng như hỗ trợ trong việc hình thành collagen và elastin trong da

- Threonine cũng tham gia vào hoạt động của gan (bao gồm cả ngăn cản gan nhiễm mỡ), chức năng lipotropic khi kết hợp với aspartic acid và methionine, cũng như hỗ trợ các hệ thống miễn dịch bằng cách giúp sản xuất kháng thể và thúc đẩy tăng trưởng và hoạt động tuyến ức

- Chất dinh dưỡng khác cũng được hấp thu tốt hơn khi threonine hiện diện,

và nó cũng đã được sử dụng như là một phần của điều trị sức khỏe tâm thần

- Threonine cũng được xác nhận trong việc hỗ trợ sự hình thành kháng thể

và những thành phần chính của hệ thống miễn dịch của cơ thể Tạo ra những kháng thể chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm trùng ngoài da

- Bổ sung threonine cho cơ thể giúp ích cho việc điều trị các bệnh do tổn thương hệ thần kinh trung ương Nhiều triệu chứng xơ cứng teo cơ cũng được khắc phục bởi loại amino acid này

- Tuy nhiên, liều cao threonine khi dùng có thể gây tổn thương chức năng gan và thận

2.5 Một số phương pháp định lượng amino acid

Có nhiều phương pháp định lượng amino acid ứng dụng nhiều nhất là các phương pháp sắc ký, dưới đây là một số phương pháp thông dụng nhất trong phân tích định lượng các amino acid

2.5.1 Phương pháp sắc ký giấy [5]

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động Dung môi cố định thường là nước giữ ở chân giấy sắc ký Dung môi di động thường là dung môi hữu cơ bão hòa nước, di chuyển trên giấy theo cơ chế mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch Vận tốc di chuyển của từng chất phân tích khác nhau thì không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một giá trị nhất định gọi là Rf

Hình 2.16 Mô tả ắc ký giấy đi lên

Trong đó:

a: khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích

b: khoảng cách dịch chuyển của dung môi

Rf: trị số

Hình 2.17 Sơ đồ bể sắc ký giấy một chiều đi lên

Có nhiều loại sắc ký giấy khác nhau: sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký một chiều đi lên, sắc ký võng nằm ngang và sắc ký hai chiều Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Shleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol : 1 Acetic acid : 5 nước (dùng cho chiều thứ nhất) : 3 phenol : 1 nước (dùng cho chiều thứ 2)

Mực dung môi trong

bể sắc ký

Vạch xuất phát cho chất phân tích

Giới hạn chiều cao dung

Nắp đậy

2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng [6]

Nguyên tắc của phương pháp này cũng dựa trên nguyên tắc của phương pháp sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố của chất phân tích giữa hai pha Tuy nhiên, chất hấp phụ pha động được trán trên một phiến kính hoặc nhôm tạo thành một lớp mỏng và pha động là một dung môi thích hợp Dung môi di chuyển kéo theo sự dịch chuyển của các chất trong mẫu phân tích Các chất hấp phụ thường là silica gel, alumium oxide, sephadex, được kết hợp với thạch cao dán vào miếng kính

Phương pháp sắc ký bản mỏng nhuộm màu với ninhydrin có thể dùng định tính, bán định lượng đồng thời một số loại amino acid từ dịch thủy phân protein phương pháp này thường được sử dụng trong kiểm nghiệm thực phẩm, sinh hóa trước đây Để tăng độ phân giải cho các amino acid người ta phải dùng sắc ký hai chiều với hệ 2 dung môi thích hợp Trong phương pháp sắc ký bản mỏng có ba hệ dung môi thường được sử dụng là phenol/nước, collidine, butanol/acid acetic/nước Tùy theo hệ dung môi và tỉ lệ của hệ dung môi mà các amino acid có thứ tự và giá trị Rf khác nhau

2.5.3 Phương pháp sắc ký khí [7]

Vì các amino acid là những chất khó bay hơi, nên với phương pháp sắc

ký khí trước tiên ta phải tạo dẫn xuất dễ bay hơi cho các amino acid bằng cách ứng dụng chương trình nhiệt độ trong quá trình sắc ký, thường là để tạo thành dẫn xuất N-acetyl-amine Đầu tiên, ta cho amino acid tự do (sau quá trình thủy phân protein) tác dụng với cồn amylic và HBr khan Sau đó, cho hỗn hợp này tác dụng với anhydrid acetic Cột thường dùng trong sắc ký khí là Chromosorb

W (60-80 mesh) có một lớp polyethylenglycol 1 % (carbowax 1564 hoặc 6000) Chương trình nhiệt giữa 125◦C và 155◦C, tốc độ dòng 60-240 mL/phút Tuy nhiên, phương pháp này không được ứng dụng rộng rãi vì khả năng tách rất kém và cũng khá lỗi thời

2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến nhất hiện nay và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích, nghiên cứu khoa học và công nghệ trong đó có phân tích amino acid Nhiều công trình phân tích amino acid dựa trên phương pháp này đã được công bố và nó đã trở thành tiêu chuẩn

để phân tích amino acid Vì phương pháp này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao và ít tốn thời gian cũng như lượng mẫu cần rất ít Trong khoảng 15 năm trở lại đây thì kỹ thuật này là kỹ thuật được ứng dụng rỗng rãi nhất và chiếm gần 70% các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký

Hình 2.18 Hệ thống máy sắc ký HPLC tại các phòng thí nghiệm

2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [5]

2.6.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký

Hỗn hợp cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp, tiêm một thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng dung môi (pha động) trong đó mẫu được hòa tan

Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh) Các cấu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh Pha động (còn gọi

là chất rửa giải) được bơm qua cột được nhồi chặt các hạt sắc kí Với việc chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau Khi những cấu tử lần lượt thoát ra khỏi cột vàđi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu được ghi lại, xử lí

và chuyển ra ngoài dưới dạng một sắc kí đồ cho biết sự hiện diện của mỗi cấu

tử dưới dạng một peak Khi đó lượng cấu tử có trong mẫu được tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích của peak của nó

2.6.3 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người

ta chia HPLC thành 4 loại:

- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (absorption/liquid chromatography)

- Sắc ký phân bố (partition chromatography)

- Sắc ký ion (ion chromatography)

- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000)

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography)

và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ

là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT

2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hình 2.19 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Trong đó:

 Dung môi pha động: dung môi pha động gồm một hoặc nhiều dung môi

khác nhau để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột

Có thể sử dụng dung môi rửa giải có thành phần không đổi trong suốt quá trình phân tích, tuy nhiên đối với một hỗn hợp phức tạp một thành phần pha động thường không thích hợp từ đầu đến cuối Do đó thường sử dụng phương pháp gradient nồng độ (thay đổi thành phần pha động theo tỉ lệ đã được chương trình hóa) cho phép tách tốt trong thời gian vừa phải

Yêu cầu đối với dung môi pha động :

o Có độ tinh khiết cao, cần loại bỏ tạp chất và đuổi khí trước khi sử dụng

o Có độ nhớt thấp, không tạo áp lực khi vào cột

o Không tương tác với pha tĩnh, không làm lão hóa cột tách và làm thay đổi các đặc tính của nó

o Không hấp thu trong vùng ánh sáng phân tích

 Bơm (bơm cao áp): để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc

ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc ký nằm trong vùng 0,5 – 3,0 mL/phút

 Van bơm mẫu (bộ phận lấy mẫu tự động): để bơm mẫu vào cột tách theo

những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích 20, 50, 100 µL Van 6 chiều chỉ

có một vòng mẫu nhưng van 10 chiều thì có 2 vòng mẫu

 Cột HPLC (cột tách): là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình sắc ký, nó

là một yếu tố quyết định hiệu quả sự sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu Cột tách có nhiều cỡ khác nhau và thường làm bằng thép không gỉ, tùy thuộc vào mức độ sắc ký thông thường cột tách có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính trong từ 2 – 5 mm, đường kính của chất nhồi cột từ 3-10 m

Yêu cầu đối với cột sắc ký: cột phải trơ, có thành thẳng và chịu được áp suất cao

Trong sắc ký phân bố pha đảo, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

o Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý

→ sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

o Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều

ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

- Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên

dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

- Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người

ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

 Detector: là trang bị phát hiện chất phân tích Có rất nhiều loại detector

khác nhau, tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp để đạt độ nhạy cao khi phát hiện các chất và định lượng chúng như: detector UV – VIS, AES, AAS, FD, RID, DAD, MS

Trong đề tài này, với những điều kiện có sẵn tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert Control Cần Thơ, em ứng dụng khả năng phân tích của detector diod phát quang (DAD)

Nguyên tắc hoạt động: dựa trên sự phát quang của một loại diod đặc biệt

khi nó bị chùm sáng tác động vào (tương tự như detector phổ hấp thụ quang phân tử UV – VIS) Mỗi detector có hàng chục diod phát quang tạo thành một mảng diod, có vùng phổ làm việc từ 200 – 1100 nm và có tính không gian 3 chiều Nên loại này thu nhận được hình không gian của peak hấp thụ của chất, và nhiều peak đồng thời Loại này có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, tốc độ đo cao hơn và có thể đo được từ 2 đến 42 kênh đồng thời Chọn sóng đo hấp thụ cho từng chất là dễ dàng Hạn chế được sự chen lấn và trùng sóng hấp thụ

 Trang bị điều khiển và xử lý số liệu: gồm các máy tự ghi (recorder), bộ

phân tích kế (intergrator), máy tính, máy in

2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định [8,9]

Khoảng một nữa các phép phân tích amino acid dựa trên sự tách các amino acid tự do bằng sắc ký lỏng trao đổi ion rồi tạo dẫn xuất sau cột phân tách Kỹ thuật tạo dẫn xuất sau cột có thể áp dụng cho các mẫu thử có một lượng nhỏ chất đệm (như các muối và ure) và cần 5-10 g mẫu thử protein cho một lần phân tích Các kỹ thuật còn lại bao gồm việc tạo dẫn xuất trước cột rồi tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) Các kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột thường rất nhạy và chỉ cần khoảng 0,5-1,0 g mẫu thử protein/peptide cho mỗi lần phân tích

Vì vây, với các điều kiện có sẵn tại Trung tâm Phân tích và Giám định Vinacert Control Cần Thơ, ứng dụng phương pháp tạo dẫn xuất amino acid

tiền cột với thuốc thử ortho-phthalaldehyde (OPA) Đây là phương pháp được

ứng dụng khá phổ biến hiện nay, dùng để phân tích hầu hêt các amino acid với khả năng tạo dẫn xuất nhanh và ổn định

Hình 2.20 Công thức cấu tạo của OPA

Thuốc thử OPA, khi có mặt một hợp chất thiol (có thể dùng 2-ME hoặc 3-MPA) sẽ tác dụng với các amine bậc một để cho một hợp chất isoindole phát huỳnh quang mạnh Bản thân thuốc thử OPA không phát huỳnh quang, nên không gây trở ngại Mặt khác, vì OPA dễ tan và ổn định trong nước đồng thời cho phản ứng nhanh Tuy nhiên, dẫn xuất tạo thành chỉ bền trong vài phút, nên phải tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất bằng hệ thống tiêm mẫu tự động (autosample) để tránh mất thời gian với việc tạo dẫn xuất bằng tay cũng như quá trình phân tích với máy Dù vậy, OPA không cho phản ứng với các amine bậc 2, nên kỹ thuật này không áp dụng được để phân tích các amino acid có chứa nhóm chức amine bậc 2 như proline

Hình 2.21 Phương trình tạo dẫn xuất với thuốc thử OPA

Dẫn xuất tạo thành sau khi được phân tích bằng cột pha đảo sẽ được phát hiện bằng detector DAD ở bước sóng kích thích 338 nm

Ngoài ra, còn một số phương pháp tạo dẫn xuất với các amino acid như tạo dẫn xuất sau cột với thuốc thử ninhydrine, tạo dẫn xuất sau cột với thuốc thử OPA, tạo dẫn xuất trước cột với thuốc thử 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC),

Ưu điểm của phương pháp tạo dẫn xuất với OPA:

- Tạo dẫn xuất nhanh, rút ngắn thời gian phân tích so với phương pháp tạo dẫn xuất với ninhydrin đã được ứng dụng từ rất lâu, không còn phù hợp nữa

- Lượng mẫu cần dùng phân tích rất nhỏ tiết kiệm được chi phí

- Độ nhay cao, giới hạn phát hiện thấp khi phát hiện với detector FLD (khoảng 1picomol đã được công bố)

- Phân tích được hầu hết các amino acid bậc 1 với độ chính xác cao

Nhược điểm:

- Không phân tích được các amino acid bậc hai

- Không bền vững nên sau khi tạo dẫn xuất phải phân tích nhanh chóng trên máy

2.8 Thủy phân protein [2]

Có nhiều phương pháp thủy phân protein nhưng phương pháp chủ yếu dùng để tách các amino acid ra khỏi mẫu thực phẩm là dùng HCl) với nồng độ cao khoảng 6 M Tuy nhiên, tùy theo mục đích nghiên cứu định tính hay định lượng mà có các phương pháp thủy phân khác như:

- Thủy phân bằng kiềm

- Thủy phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion

Tác nhân thiol Amino acids

- Thủy phân bằng enzyme

Trong quá trình thủy phân protein bằng HCl thì threonine bị phân hủy một phần, methionine có thể bị oxi hóa một phần Tùy theo từng mục đích nghiên cứu và phân tích mà ta áp dụng các phương pháp thủy phân khác nhau, đối với đề tài này cần định lượng các amino acid một cách chính xác nên tôi

áp dụng phương pháp thủy phân bằng HCl nồng độ cao 6 M có mặt chất xúc tác 3 – mercaptopropionic acid, để quá trình thủy phân xảy ra hoàn toàn tiến hành ủ mẫu thủy phân qua đêm ở điều kiện nhiệt độ thích hợp khảo sát từ một

số tài liệu và phù hợp với điều kiện tại phòng thí nghiệm

Quá trình thủy phân chủ yếu để cắt đứt các liên kết peptide của các amino acid trong protein, trả các amino acid về dạng tự do sau đó tạo dẫn xuất với dẫn chất OPA có mặt tác nhân thiol là 3 – MPA để tạo thành hợp chất có khả năng phát quang mạnh và được phát hiện bằng detector DAD

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm

3.1.1 Địa điểm thí nghiệm

Địa điểm thí nghiệm: Trung tâm Phân tích và Giám định Vinacert Control Cần Thơ

Địa chỉ: F2-62-63, đường số 6, khu dân cư 586, phường Phú Thứ, quận Cái Răng, TP Cần Thơ

3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm

Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng kể từ tháng 9 năm

2015 đến tháng 11 năm 2015

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao UHPLC Ultimate 3000 Thermo

- Đầu dò RS Diode Array Detector

- Ống thử nghiệm Falcon bằng nhựa 50 mL, 30 115 mm

- Micropipete 10 - 100 µL, Micropipete 100 – 1000 µL và Micropipete

1000 - 5000 µL đã được hiệu chỉnh cùng đầu tuýp Micropipete với cùng thể tích

- Boric acid rắn (99 %, Xilong)

- Dung dịch o-phthaladehyde (OPA) ( 99 %, Sigma-Aldrich)

- Sodium hydoxide rắn (NaOH) (99 %, Merck)

- Dung dịch hydrochloride acid (HCl) (37%, Merck)

- Dung dịch 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) (99 %, ACROS Organic™)

- Muối di-potassium hydrophosphate (K2HPO4) (99 %, Merck)