XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Ts NGUYỄN THỊ THU THỦY CN La Văn Thái CN Bùi Thị Quỳnh Hoa 2015 Trƣờng Đại Học Cần Thơ Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Mơn Hóa Học Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc - - NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Cán hướng dẫn: Ts Nguyễn Thị Thu Thủy Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine threonine thức ăn chăn nuôi phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Sinh viên thực hiện:Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424 Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38 Nội dung nhận xét:  Nhận xét hình thức luận văn tốt nghiệp  Nhận xét nội dung luận văn tốt nghiệp Đánh giá nội dung thực đề tài: Những vấn đề hạn chế: Nhận xét sinh viên thực đề tài: Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 Cán hướng dẫn Ts Nguyễn Thị Thu Thủy Trƣờng Đại Học Cần Thơ Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Mơn Hóa Học Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc - - NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN Cán phản biện: Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine threonine thức ăn chăn nuôi phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424 Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38 Nội dung nhận xét:  Nhận xét hình thức luận văn tốt nghiệp  Nhận xét nội dung luận văn tốt nghiệp Đánh giá nội dung thực đề tài: Những vấn đề hạn chế: Nhận xét sinh viên thực đề tài: Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 Cán phản biện BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Năm học 2015 – 2016 Đề tài: “XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINETRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC) LỜI CAM ĐOAN Em tên: Nguyễn Thị Ngọc Châm tác giả luận văn này, em xin cam đoan luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu riêng em, kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác chỉnh sửa theo ý kiến hội đồng chấm bảo vệ luận văn Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 Nguyễn Thị Ngọc Châm Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên nghành: Hóa Dược Đã bảo vệ duyệt Hiệu trưởng: Trưởng khoa: Trưởng chuyên ngành Cán hướng dẫn Ts Nguyễn Thị Thu Thủy LỜI CẢM ƠN -Trong suốt trình học tập, rèn luyện Trường Đại học Cần Thơ với trình thực luận văn tốt nghiệp, quan tâm, giúp đỡ tận tình dẫn từ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè, em học hỏi nhiều kiến thức từ sách vỡ, kinh nghiệm thực tiễn bổ ích cho thân Để có thành ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Khoa Khoa học tự nhiên tất quý Thầy Cô giảng dạy kiến thức quý báu cho em suốt trình học tập Ban lãnh đạo Trung tâm Phân Tích Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, tạo điều kiện tốt hóa chất, thiết bị, dụng cụ để giúp em hoàn thành tốt luận văn Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ts Nguyễn Thị Thu Thủy Cảm ơn cô truyền dạy kiến thức sâu rộng mình, tận tình hướng dẫn với quan tâm ân cần, âm thầm hỗ trợ động viên tinh thần, cô tạo điều kiện tốt để em vượt qua khó khăn hồn thành luận văn Xin gửi đến lời cảm ơn sâu sắc nhất! Xin gửi lời cảm ơn đến Ts Tôn Nữ Liên Hƣơng, dẫn dắt em lớp Cử nhân Hóa Dược Khóa 38 suốt năm học trường Cảm ơn cô truyền lại kiến thức quý báu chuyên ngành quan tâm sâu sắc tận tụy, giúp chúng em vượt qua rào cản khó khăn học tập Cảm ơn CN La Văn Thái – Trưởng phòng thí nghiệm Trung tâm Phân Tích Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, CN Bùi Thị Quỳnh Hoa – kiểm nghiệm viên phòng phân tích sắc ký anh chị cơng ty, nhiệt tình hướng dẫn, chia kinh nghiệm giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân yêu thương, chăm sóc hỗ trợ suốt quãng thời gian học tập, chỗ dựa tinh thần cho vượt qua khó khăn sống, tạo điều kiện để hoàn thành chương trình học Cám ơn bạn bè người xung quanh đồng hành, chia giúp đỡ tơi suốt q trình học tập i TÓM TẮT Để đảm bảo cân amino acid sản phẩm thức ăn chăn nuôi cần tiến hành phân tích xác định hàm lượng amino acid phương pháp đại có độ xác cao , đề tài tiến hành phân tích định lượng lysine, methionine threonine amino acid thiết yếu thường phối trộn thức ăn chăn nuôi nhằm tăng tốc độ sinh trưởng suất sản xuất vật nuôi, phương pháp ứng dụng phân tích máy sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Mẫu thức ăn chăn nuôi thủy phân với dung dịch HCl 6M (103◦C 24 giờ) tạo dẫn xuất tiền cột với ortho-phthaladehyde với có mặt tác chất 3-mercaptopropanoic acid tạo thành hợp chất có khả phát huỳnh quang mạnh, trình tạo dẫn xuất tiền cột tự động hóa với thiết bị bơm lấy mẫu tự động (autosampler), phân tách thực cột Agilent Zorbax EclipseAAA (4,6 150 mm, m) phát detector DAD bước sóng ( 338nm Phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao (sự sai khác thời gian lưu mẫu thử mẫu chuẩn nhỏ %), khoảng tuyến tính rộng (3 - 150 ppm, R2 > 0,995), phương pháp có độ chụm đạt (RSD = 2,6 % với lysine, 2,5 % với methionine, 0,8 % với threonine ) Giới hạn phát giới hạn định lượng thấp (Lysine: LOD = 1,131 ppm; LOQ = 3,392 ppm, Methionine: LOD = 1,343 ppm; LOQ = 4,029 ppm, Threonine: LOD = 1,593 ppm; LOQ = 4,779 ppm) Kết phân tích độ mẫu thử có kết xác với độ lệch chuẩn tương đối mẫu nguyên liệu lysine đạt (RSD = 1,03 %), độ chệch (bias) đạt -1,43 % Kết phân tích thu hàm lượng phù hợp với tỉ lệ phối trộn thức ăn chăn nuôi với hàm lượng lysine khoảng 0,53 – 1,89 %, methionine 0,25 – 0,52 % threonine 0,32 – 1,44 % Từ khóa: amino acid, thức ăn chăn nuôi, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), tạo dẫn xuất tiền cột với OPA ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT ix CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát amino acid 2.1.1 Giới thiệu chung amino acid 2.1.2 Phân loại amino acid 2.1.3 Tính chất vật lý 2.1.4 Tính chất hóa học 2.2 Lysine 11 2.2.1 Giới thiệu lysine 11 2.2.2 Tác dụng Lysine 12 2.3 Methionine 13 2.3.1 Giới thiệu Methionine 13 2.3.2 Tác dụng methionine 13 2.4 Threonine 14 2.4.1 Giới thiệu threonine 14 2.4.2 Tác dụng threonine 15 2.5 Một số phương pháp định lượng amino acid 15 2.5.1 Phương pháp sắc ký giấy 15 2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 2.5.3 Phương pháp sắc ký khí 17 iii 2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 17 2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 18 2.6.1 Khái niệm 18 2.6.2 Nguyên lí hoạt động tách sắc ký 18 2.6.3 Phân loại 19 2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 20 2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định 22 2.8 Thủy phân protein 23 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 25 3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm 25 3.1.1 Địa điểm thí nghiệm 25 3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm 25 3.1.3 Thiết bị dụng cụ 25 3.1.4 Hóa chất 25 3.1.5 Đối tượng thí nghiệm 26 3.2 Phương pháp nghiên cứu 26 3.2.1 Chuẩn bị mẫu 26 3.2.2 Khảo sát thời gian lưu 26 3.2.3 Xây dựng đường chuẩn dựa khoảng tuyến tính 27 3.2.4 Khảo sát giới hạn phát 29 3.2.5 Khảo sát giới hạn định lượng 30 3.2.6 Độ xác (độ chụm độ đúng) 31 3.3 Thực nghiệm 36 3.3.1 Quy trình xử lý mẫu phân tích HPLC 36 3.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, pha động dung dịch phân tích 36 3.3.3 Điều kiện chạy máy HPLC 39 3.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lưu mẫu chuẩn lysine, methionine threonine 40 3.3.5 Xây dựng đường chuẩn 40 3.3.6 Xác định giới hạn phát 40 3.3.7 Xác định giới hạn định lượng 40 3.3.8 Thí nghiệm khảo sát độ xác phương pháp 40 iv 3.3.9 Tiến hành thí nghiệm mẫu 41 3.3.10 Cơng thức tính tốn kết 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 4.1 Kết khảo sát thời gian lưu 42 4.2 Kết xây dựng đường chuẩn 42 4.3 Giới hạn phát 44 4.4 Giới hạn định lượng 44 4.5 Kết khảo sát độ xác phương pháp 44 4.5.1 Kết khảo sát độ chụm phương pháp 44 4.5.2 Kết khảo sát độ phương pháp 45 4.6 Kết tiến hành mẫu thử 46 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 51 v ăn gia súc gia cầm (theo tiêu chuẩn NRC – 1994, NRC – 1998, TCVN 2265: 1994) - Với kết cho thấy phương pháp xác định hàm lượng lysine, methionine, threonine áp dụng để phân tích hầu hết loại amino acid bậc 1, giúp đánh giá cách xác giá trị dinh dưỡng thức ăn chăn ni nói riêng sản phẩm dinh dưỡng khác nói chung thơng qua việc phân tích máy HPLC 4.2 Kiến nghị Từ kết phân tích q trình thực đề tài em có số kiến nghị sau: - Các công ty đơn vị sản xuất phân phối thức ăn chăn nuôi thị trường nên ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng amino acid trình kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm nhằm nâng cao chất lượng tiết kiệm chi phí nguyên liệu phối trộn để mang lại hiệu kinh tế - Vì thời gian thực đề tài ngắn, nên phương pháp chưa khảo sát điều kiện quy trình xử lý mẫu như: nhiệt độ, nồng độ dung dịch thủy phân, nồng độ tác chất, thời gian ủ mẫu, thực loại mẫu khác nhau, để giúp đề tài phong phú đa dạng Đồng thời, đánh giá lại thông số thẩm định cách để xác định giá trị phương pháp phân tích - Có thể ứng dụng sở phương pháp để phân tích thêm loại amino acid loại hợp chất khác như: glycine, serine, cystein, amine, acid nucleic, để mở rộng phạm vi ứng dụng phương pháp - Tiến hành tạo dẫn xuất amino acid với tác chất khác so sánh hiệu suất thu hồi hai phương pháp - Tiến hành xử lý mẫu phương pháp khác như: thủy phân mẫu kiềm, enzyme - Tối ưu hóa điều kiện phân tích máy phát chất phân tích với loại đầu dò khác như: UV-VIS, FLD tiến hành phân tích với phương pháp khác như: GC-MS, GC-FID, LC-MS so sánh khả phân tích amino acid phương pháp 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Tố (Chủ biên), 2008 Sinh hóa học động vật Giáo trình Nhà xuất Nơng nghiệp Hà Nội Trang 20-27 [2] Cao Đăng Nguyên (Chủ biên), 2006 Công nghệ protein Giáo trình Nhà xuất Đại học Huế Huế Trang 13-25 [3] Nguyễn Tiến Toàn, 2012 Nghiên cứu ảnh hưởng lysine probiotics thức ăn hỗn hợp đến khả sinh trưởng chất lượng thịt gà ta nuôi thương phẩm Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Đại học Nha Trang Nha Trang [4] Ngô Anh Thư Nguyễn Anh Thư, 2008 Acid amin không thay Tiểu luận Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh [5] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008 Các phương pháp phân tích đại Giáo trình Nhà xuất trường Đại học Cần Thơ Cần Thơ [6] Đoàn Bảo Quốc, 2005 Nuôi trồng xác định thành phẩn amino acid số loài nấm bào ngư (Pleurotus spp.) kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography - HPLC) Luận văn tốt nghiệp Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh [7] Lê Thị Hồng Thảo, 2005 Nghiên cứu úng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) tối ưu hóa số điều kiện phân tích acid amin cá Đề tài nghiên cứu cấp viện Viện dinh dưỡng Hà Nội [8] Nguyễn Huy Du, Nguyễn Văn Đông, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thị Thùy Luyên Nguyễn Ánh Mai, 2012 Cải tiến quy trình xác đinh thành phần axit amin Tạp chí phát triên KH&CN Tập 14 [9] Silvia Marten and Mareike Margraf, 2012 Determination of Amino acids by UHPLC with automated OPADerivatization by the Autosampler [10] Trần Cao Sơn (Chủ biên), 2010 Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Trang 16-57 [11] TCVN 8764 : 2010 ISO 13903 : 2005 Thức ăn chăn nuôi – xác định hàm lượng acid amin [12] AOAC Official Method 999.13, 2002 [1] 50 PHỤ LỤC 51 ĐỒ THỊ ĐƢỜNG CHUẨN VÀ PHƢƠNG TRÌNH ĐƢỜNG CHUẨN 52 SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC ĐIỂM CHUẨN 53 54 55 56 57 58 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ CHỤM CỦA PHƢƠNG PHÁP 59 60 SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG MẪU NGUYÊN LIỆU LYSINE 61 SẮC KÝ ĐỒ CỦA MẪU THỨC ĂN CHĂN NUÔI 62 63 ...TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP... threonine thức ăn chăn nuôi phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Sinh viên thực hiện:Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424 Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38 Nội dung nhận xét:  Nhận xét hình thức luận văn tốt... thức ăn chăn nuôi phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424 Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38 Nội dung nhận xét:  Nhận xét hình thức luận văn tốt