nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng 3 hoạt chất vitamin b1, b6, b12 trong sản phẩm thuốc tiêm đông khô neutrivit 5000 bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

NGUYỄN PHI HẢI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3 HOẠT CHẤT VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SẢN PHẨM THUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ NEUTRIVIT 5000 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

NGUYỄN PHI HẢI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3 HOẠT CHẤT VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SẢN PHẨM THUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ NEUTRIVIT 5000 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà nội -Năm 2016

NGUYỄN PHI HẢI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3 HOẠT CHẤT VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SẢN PHẨM THUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ NEUTRIVIT 5000 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC).

Chuyên ngành : Kỹ thuật Hóa học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.Ts Lê Văn Hiếu

Hà Nội-Năm 2016

bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Phi Hải

Hiếu – Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình,

nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm Viện Kĩ thuật Hóa học, cùng các thầy cô giáo Viện Kĩ thuật Hóa học, trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Bình Định, tháng 01 năm 2016

Tác giả

Nguyễn Phi Hải

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 8

1.1 Giới thiệu về kỹ thuật đông khô 8

1.1.1 Khái niệm, ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật đông khô 8

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới độ ổn định của sản phẩm (hay chế phẩm) thuốc đông khô [23] 10

1.2 Giới thiệu về thuốc tiêm đông khô 14

1.3 Giới thiệu về thuốc tiêm đông khô NEUTRIVIT 5000 17

1.4 Giới thiệu về hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 19

1.4.1 Vitamin B1 ( Thiamine Hydrochloride) [1], [5], [6], [8] 19

1.4.2 Vitamin B6 ( Pyridoxine Hydrochloride) [5],[6], [8] 20

1.4.2 Vitamin B12 ( Cyanocobalamin)[5],[6], [8] 20

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 22

1.5.1 Nguyên lý [7], [9], [10], [11] 22

1.5.2 Phân loại các phương pháp sắc ký lỏng [10], [11], [12], [19], [20] 23

1.5.3 Các đại lượng đặc trưng trong phương pháp phân tích sắc ký lỏng [9], [10], [11], [24], [25], [26] 24 1.5.4 Phương pháp định lượng trong HPLC [9], [10], [11], [27], [28] 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Ảnh hưởng của các yếu tố đến phép xác định đồng thời CMP và UMP bằng phương pháp HPLC với detector DAD 33

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện 33

3.1.2 Ảnh hưởng của thành phần pha động 36

3.1.3 Ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động (u) 39

3.2 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp HPLC xác định Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 41

3.2.1 Độ ổn định của hệ thống HPLC với detector DAD 41

3.2.3 Khoảng tuyến tính 45

3.3 Xây dựng quy trình phân tích đồng thời CMP và UMP và áp dụng vào thực tế 47

3.3.1 Quy trình xử lý mẫu 47

3.3.2 Kiểm soát chất lượng quy trình phân tích 48

3.3.3 Áp dụng thực tế 52

KẾT LUẬN 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC

Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

AOAC Association of Official

Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hoá học phân tích chính thức DAD Diode - Array Detector Detector mảng điot

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IE-HPLC Ion Exchange - HPLC Sắc ký trao đổi ion

LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

NP-HPLC Normal Phase - HPLC Sắc ký pha thuận

RP-HPLC Reverse Phase - HPLC Sắc ký pha đảo

ppm Part per million Phần triệu

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

S Standard Deviation Độ lệch chuẩn

STT Bảng Tiêu đề Trang

1 Bảng 1.1 Các quốc gia áp dụng kỹ thuật đông khô để sản

2 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha

5 Bảng 3.4 Kết quả xách định S ( độ lệch chuẩn của diện

tích pic của Vitamin B1, Vitamin B6, Vitamin B12 đối với mẫu giả dược)

43

6 Bảng 3.5 Các kết quả thí nghiệm xác định LOD, LOQ 44

7 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

1 Hình 1.1 Sơ đồ thể hiện giai đoạn làm khô sơ cấp vật

2 Hình 1.2 Biến thiên nhiệt độ và áp suất của hệ trong

các giai đoạn của chu trình đông khô 10

3 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Vitamin B1 19

4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Vitamin B6 20

5 Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Vitamin B12 20

18 Hình 3.10 Sắc đồ phân tích các mẫu thực tế 54

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong nhiều năm qua, ở bất kỳ quốc gia nào trên thế giới, ngoài những

ưu tiên đầu tư để phát triển kinh tế - xã hội, bảo vệ môi trường, việc chăm sóc sức khỏe và điều trị bệnh luôn là một trong nhiệm vụ được quan tâm hàng đầu Theo định hướng phát triển nền công nghiệp dược Việt Nam đến năm

2020 và tầm nhìn đến 2030 của Bộ Y tế, nước ta sẽ ngày càng chủ động hơn trong việc phát triển các nguyên liệu cho ngành dược và đa dạng hóa các loại dược phẩm Mặt khác, để tăng cường hiệu quả điều trị bệnh, trên thị trường thế giới cũng như ở nước ta, ngày càng ra đời nhiều loại thuốc chứa không chỉ một hoạt chất, mà chứa 2 hay nhiều hơn các hoạt chất Theo hướng này, để điều trị một số bệnh thần kinh, các loại thuốc chứa đồng thời 3 hoạt chất: Vitamin B1, Vitamin B6 và vitamin B12 đã được một số cơ sở dược phẩm trên thế giới và ở nước ta sản xuất dưới ở các dạng sản phẩm khác nhau như viên nén, viên nang và thuốc tiêm đông khô Công ty Dược và Trang thiết bị

Y tế Bình Định (Công ty BIDIPHAR) là một trong những công ty sản xuất thuốc lớn ở nước ta đã đi đầu nghiên cứu áp dụng công nghệ đông khô để bào

chế sản phẩm thuốc tiêm đông khô NEUTRIVIT 5000 chứa 3 hoạt chất

chính là Vitamin B1, Vitamin B6 và vitamin B12 (trên cơ sở phối trộn ba nguyên liệu chứa 3 hoạt chất riêng lẻ), phục vụ điều trị một số bệnh thiếu hụt vitamin nhóm B do dinh dưỡng, Viêm đa dây thần kinh do rượu, Thiếu máu

ác tính tự phát, hoặc sau khi cắt dạ dày)

Tuy các loại thuốc chứa hoạt chất trên đã và đang được lưu hành trên thị trường thế giới và ở nước ta, nhưng cho đến nay, quy trình phân tích các loại thuốc đó chưa được đưa ra trong các Dược điển Việt Nam, Dược điển Anh (British Pharmacopoeia), Dược điển Mỹ (U.S Pharmacopoeia), Dược

điển Châu Âu (European Pharmacopoeia) Mặt khác, quy trình phân tích riêng Vitamin B12 và phân tích đồng thời 2 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 cũng chưa được công bố trong các dược điển nói trên Rõ ràng, để phục vụ công tác kiểm soát an toàn dược phẩm và đồng thời, đóng góp vào việc phát triển các quy trình phân tích dược phẩm cho ngành kiểm nghiệm thuốc ở nước

ta, những nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích 3 hoạt chất trên trong các loại thuốc là rất cấp thiết

Xuất phát từ các vấn đề trên, đề tài “ Nghiên cứu xây dựng qui trình

định lượng 3 hoạt chất vitamin B1, B6, B12 trong sản phẩm thuốc tiêm đông khô Neutrivit 5000 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ” được thực hiện nhằm mục đích xây dựng được quy trình phân tích

3 hoạt chất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đóng góp tích cực vào ngành kiểm nghiệm thuốc ở nước ta

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, vitamin B6, Vitamin B12 trong thuốc tiêm đông khô bằng phương pháp HPLC nhằm đóng góp thêm vào lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm

- Áp dụng quy trình phân tích vào thực tế để kiểm tra một số mẫu dược phẩm đang lưu hành trên địa bàn tỉnh Bình Định

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là 3 (ba) hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6, Vitamin B12 trong một số chế phẩm thuốc đang lưu hành ở thị trường Việt Nam: thuốc tiêm đông khô, thuốc viên nén, thuốc viên nang

- Phạm vi nghiên cứu : Xây dựng quy trình phân tích ba hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6, Vitamin B12

- Thử nghiệm ứng dụng quy trình phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6, Vitamin B12 trong thuốc tiêm đông khô bằng phương pháp HPLC

4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

4.1 Nội dung nghiên cứu

1) Khảo sát các điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng detector DAD:

- Lựa chọn cột sắc ký; khảo sát bước sóng phát hiện;

- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi, thành phần pha động;

- Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động

2) Khảo sát phương pháp xử lý mẫu:

- Kỹ thuật chuẩn bị mẫu;

- Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu;

3) Xây dựng quy trình phân tích và đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích:

- Đánh giá tính ổn định và đặc hiệu của hệ thống HPLC với detector DAD;

- Đánh giá độ lặp lại (đối với mẫu chuẩn phòng thí nghiệm);

- Xác định giới hạn phát hiện, khoảng tuyến tính;

4.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp phân tích: sử dụng phương pháp HPLC với detector DAD

để phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 Định lượng bằng phương pháp phương pháp so sánh với chuẩn

- Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật xử lý mẫu: sử dụng phương pháp đơn biến;

- Phương pháp đánh giá tính ổn định và đặc hiệu của hệ thống HPLC với detector DAD: xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) đối với thời gian lưu, diện tích đỉnh, độ đối xứng đỉnh, độ phân giải đỉnh… (yêu cầu RSD  2% đối với tất cả các thông số đó);

- Phương pháp kiểm soát chất lượng của quy trình phân tích: đánh giá độ lặp lại (đối với mẫu chuẩn phòng thí nghiệm và mẫu thực tế) qua RSD; đánh giá độ chính xác qua độ thu hồi (Recovery,%) khi phân tích mẫu thêm chuẩn (spiked sample); xác định giới hạn phát hiện theo quy tắc 3; xác định khoảng tuyến tính (dựa vào hệ số tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ chất phân tích);

5 Cấu trúc luận văn

Luận văn bao gồm 3 chương:

Chương 1 Tổng quan về lý thuyết

Trình bày cơ sở lý thuyết về kỹ thuật đông khô, khái niệm, ưu điểm

và hạn chế của kỹ thuật đông khô Giới thiệu về nguyên lý, phân loại sắc

ký, các đại lượng đặt trưng của phương pháp HPLC

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1 Nội dung nghiên cứu

1) Khảo sát các điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng detector DAD

- Lựa chọn cột sắc ký; bước sóng phát hiện

- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng pha động

2) Khảo sát phương pháp xử lý mẫu:

- Kỹ thuật chuẩn bị mẫu;

- Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu;

3) Xây dựng quy trình phân tích và đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích:

- Đánh giá tính ổn định và đặc hiệu của hệ thống HPLC với detector DAD; Đánh giá độ lặp lại (đối với mẫu chuẩn phòng thí nghiệm);

- Xác định giới hạn phát hiện, khoảng tuyến tính;

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp phân tích: sử dụng phương pháp HPLC với detector DAD

để phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 Định lượng bằng phương pháp phương pháp so sánh với chuẩn

- Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật xử lý mẫu: sử dụng phương pháp đơn biến;

- Phương pháp đánh giá tính ổn định và đặc hiệu của hệ thống HPLC với detector DAD: xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) đối với thời gian lưu, diện tích đỉnh, độ đối xứng đỉnh, độ phân giải đỉnh… (yêu cầu RSD  2% đối với tất cả các thông số đó);

- Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê; sử dụng phần mềm Excel và

Chương 3 Kết quả và thảo luận

Các kết quả thu được như sau:

- Ảnh hưởng của các yếu tố đến phép xác định 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 bằng phương pháp HPLC với detector DAD, gồm:

- Xác định được bước sóng phát hiện, thành phần pha động, tốc độ dòng pha động phù hợp;

- Đã đánh giá độ tin cậy của phương pháp HPLC xác định 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12

- Đã khẳng định về độ ổn định của hệ thống HPLC với detector DAD, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và độ đúng của phương pháp

- Đã xây dựng được quy trình phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 bằng phương pháp HPLC và áp dụng vào thực tế; Chất lượng của phương pháp phân tích được đánh giá qua độ lặp lại và

độ đúng

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học của đề tài: Đã xây dựng được quy trình mới cho phép phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 trong các chế phẩm thuốc, góp phần phát triển phương pháp HPLC cho lĩnh vực kiểm nghiệm ở nước ta

- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Với quy trình phân tích xây dựng được, các phòng thí nghiệm của các trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, các công ty

dược trong nước sẽ chủ động trong việc kiểm soát an toàn dược phẩm đang lưu hành ở thị trường Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kỹ thuật đông khô

1.1.1 Khái niệm, ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật đông khô

Kỹ thuật đông khô được nghiên cứu phát triển và ứng dụng trong dược phẩm từ những năm chiến tranh thế giới lần thứ 2: dùng để bảo quản huyết tương, sản xuất penicillin và các kháng sinh khác Hiện nay, kỹ thuật đông khô được áp dụng khá rộng rãi trong sản xuất thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt và một số dạng thuốc khác như: hệ mang dược chất dùng trong nhãn khoa (OLSC: The Ophthalmic Lyophylisate Carrier system), viên nén rã nhanh, vi nang, [6], [8]

Đông khô là quá trình làm khô (loại nước) từ dung dịch nước đã được đông lạnh (tức là đang ở thể rắn) ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ ơtecti (Eutecti) của hệ rắn – lỏng – hơi Trong quá trình làm khô, dung môi được loại trực tiếp

từ pha rắn (không qua pha lỏng) dưới áp suất thấp (thường dưới 100 mmHg)

và thu được sản phẩm khô [23], [29]

Có thể chia quá trình đông khô thành ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô

sơ cấp, làm khô thứ cấp [22]

i) Giai đoạn đông lạnh: Đây là giai đoạn đầu tiên của quá trình

đông khô; Ở giai đoạn này, phần lớn nước được tách ra khỏi dược chất và

tá dược, hệ tách thành nhiều pha Kết thúc giai đoạn này sẽ tạo ra trạng thái kết tinh hoặc vô định hình, hoặc hỗn hợp kết tinh và vô định hình của vật chất trong hệ [21]

ii) Giai đoạn làm khô sơ cấp: Trong giai đoạn này, độ dày của lớp

băng (nước đóng băng) giảm xuống, còn độ dày của sản phẩm khô tăng lên

Nước đá tạo thành trong giai đoạn đông lạnh sẽ thăng hoa trực tiếp khi

hạ áp suất của buồng đông khô dưới áp suất hơi của nước đá

Trong giai đoạn làm khô sơ cấp, cần duy trì nhiệt độ của sản phẩm không vượt quá - 150C, áp suất buồng thông thường duy trì từ 0,05 mm Hg (0,0665 mbar) đến 0,2 mm Hg (0,2660 mbar)

iii) Giai đoạn làm khô thứ cấp: Trong giai đoạn này, nước không

đông lạnh, mà nước hấp phụ trong pha nền (matrix) sẽ được loại ra khỏi sản phẩm Khi các tinh thể nước đá được loại khỏi sản phẩm (do sự thăng hoa trực tiếp), thì nhiệt độ của sản phẩm sẽ tăng lên rất nhanh, do không cần cung cấp nhiệt cho quá trình thăng hoa nữa, nhưng nhiệt vẫn tiếp tục được cung cấp cho sản phẩm, làm cho nhiệt độ của sản phẩm tăng lên cao hơn nhiều so với nhiệt độ trong giai đoạn làm khô sơ cấp Trong giai đoạn này, không cần thay đổi áp suất của hệ, vì áp suất trong giai đoạn làm khô sơ cấp thích hợp cho giai đoạn làm khô thứ cấp [21], [22], [23], [29]

Hình 1.1. Sơ đồ thể hiện giai đoạn làm khô sơ cấp vật chất trong lọ thuốc Tấm đỡ gia nhiệt

Mặt phân cách thăng hoa Chất rắn khô

Dung dịch đông lạnh

Hướng của nhiệt và độ chuyền

khối Tới bộ ngưng tụ

Như vậy, mục tiêu của giai đoạn làm khô thứ cấp là giảm hàm ẩm còn lại tới mức tối ưu, thường dưới 1 đến 2% để đảm bảo độ ổn định của sản phẩm trong quá trình bảo quản

Biến thiên nhiệt độ của sản phẩm, giá đỡ và áp suất buồng trong giai đoạn đông lạnh, làm khô sơ cấp và làm khô thứ cấp được nêu ở hình 1.2

Hình 1.2 Biến thiên nhiệt độ và áp suất của hệ trong các giai đoạn

của chu trình đông khô [23]

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới độ ổn định của sản phẩm (hay chế phẩm) thuốc đông khô [23]

Độ ổn định của chế phẩm thuốc đông khô là một trong những yêu cầu rất quan trọng Một chế phẩm thuốc đông khô phải có các đặc tính sau: ở dạng bánh thuốc, ổn định trong thời gian dài, thời gian hoà tan ngắn, duy trì được những đặc tính gốc của dạng ban đầu (tính chất của dung dịch ban đầu, cấu trúc hóa học, kích thước các tiểu phần trong dung dịch hỗn hợp hay hỗn dịch ban đầu) Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới độ ổn định của một chế phẩm thuốc đông khô, bao gồm [29]:

+ Công thức (hay thành phần) của dung dịch đem đông khô: Sự thay đổi về đặc tính vật lý và hoá học xảy ra trong các giai đoạn đông lạnh và làm khô kế tiếp nhau phụ thuộc vào thành phần của dung dịch được đông khô

Áp suất buồng

0,6 1,2

1,8 1,5

0,3 0,9

Chẳng hạn, khi dùng Manitol với nồng độ đậm đặc và lượng lớn, nếu xảy ra quá trình kết tinh, có thể dẫn tới hậu quả làm nứt vỡ lọ; Khi sản phẩm ở dạng

vô định hình (sau quá trình đông lạnh), mà nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ phá vỡ cấu trúc của sản phẩm, thì dung dịch đông lạnh sẽ chảy và làm mất cấu trúc đã thiết lập; Hiện tượng phá vỡ cấu trúc đó có thể nhận biết qua sự co lại của bánh thuốc hoặc mất hẳn cấu trúc của bánh thuốc

+ Đặc tính của bao bì trực tiếp;

+ Các thông số kỹ thuật: Nhiệt lượng cần thiết cho sự thăng hoa khoảng

670 calo/g trong quá trình kết hợp sự truyền nhiệt và sự chuyển khối Nhiệt được truyền do tiếp xúc bị cản trở bởi khay kim loại sử dụng, bề dày của đáy

lọ, bề dày lớp sản phẩm đông lạnh Sự truyền nhiệt do tiếp xúc phụ thuộc vào

áp suất buồng đông khô, nên việc kiểm soát áp suất rất quan trọng để duy trì

sự đồng nhất giữa các lô sản xuất Sự truyền nhiệt do đối lưu không đáng kể Bức xạ nhiệt nhỏ nhưng cũng có ý nghĩa, đóng góp vào tổng lượng nhiệt truyền cho sản phẩm Độ chuyển khối trong quá trình đông khô chính là lượng nước từ quá trình thăng hoa đầu tiên qua những kẽ hở của lớp chất rắn khô, khoảng trống của lọ, khe hở của nút và buồng đông khô tới bộ phận ngưng tụ;

+ Thiết bị đông khô: Loại thiết bị đông khô đi kèm với khả năng điều khiển nhiệt độ và áp suất gắn với các thiết bị kiểm tra, khả năng của bộ phận ngưng tụ có tác động lớn đến không chỉ công suất mà cả chất lượng của sản phẩm thu được;

+ Điều kiện bảo quản: Hàm lượng nước còn lại trong chế phẩm đông khô là một đặc tính có liên quan nhiều đến độ ổn định vật lý và hoá học của chế phẩm, đặc biệt với các chất rắn vô định hình Các chế phẩm đông khô thường được bảo quản ở nhiệt độ dưới nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh của nó

và nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh có liên quan trực tiếp với hàm ẩm của chế

phẩm Khi nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh giảm, do tác động của nhiệt độ bảo quản, có thể dẫn tới không ổn định về trạng thái vật lý như bánh thuốc co lại hay bị nát và thúc đẩy tốc độ của các phản ứng hoá học làm cho chế phẩm

không ổn định

- Ưu, nhược điểm và ứng dụng của kỹ thuật đông khô

Kỹ thuật đông khô có nhiều ưu điểm [1], [2], [22], [23].:

+ Quá trình làm khô được tiến hành ở nhiệt độ thấp, nên hạn chế được các phản ứng hoá học xảy ra làm phân huỷ dược chất;

+ Sản phẩm khô thu được có diện tích bề mặt riêng lớn, nên sẽ hoà tan rất nhanh khi cần hoà tan vào nước (hoặc dung môi);

+ Do được làm khô trong chân không và đóng nắp lọ đựng thuốc cũng trong chân không, nên hạn chế tối đa sự có mặt của oxy và do vậy, giảm thiểu

sự oxy hoá dược chất

Với các ưu điểm trên, kỹ thuật (hay phương pháp) đông khô thường được áp dụng cho các dược chất dễ bị thuỷ phân, ít tan, nhạy cảm với nhiệt, các thuốc cần dùng trong trường hợp khẩn cấp…[21],[29] Nhiều hãng dược trên thế giới và ở nước ta đã áp dụng kỹ thuật đông khô trong sản xuất các loại thuốc tiêm đông khô như nêu ở bảng 1.1

Hạn chế của kỹ thuật đông khô [22], [23],[29]:

+ Một số protein có thể bị phá huỷ bởi quá trình đông lạnh hay quá trình làm khô;

+ Độ ổn định của thuốc ở trạng thái rắn có thể phụ thuộc vào dạng kết tinh hay vô định hình của dược chất trong sản phẩm, nếu quá trình đông khô tạo ra chất rắn vô định hình và nếu dạng này không ổn định, thì sản phẩm sẽ không đạt chất lượng như mong muốn;

+ Giá thành của kỹ thuật đông khô tương đối cao

Bảng 1.1 Các quốc gia áp dụng kỹ thuật đông khô để sản xuất thuốc

tiêm đông khô [29]

Omeprazol

40mg

Pantoprazol

40mg

Cefuroxime

natri

Pymepharma Việt Nam

Vancomycin 500mg Bidilucil

Bidiphar Bình Định-

Việt Nam

1.2 Giới thiệu về thuốc tiêm đông khô

Thuốc tiêm đông khô là thuốc tiêm ở dạng bột vô khuẩn, được bào chế bằng phương pháp đông khô và được pha thành dung dịch hay hỗn dịch ngay trước khi tiêm

Kỹ thuật bào chế thuốc tiêm đông khô thường được áp dụng cho các chế phẩm sinh học hoặc các chế phẩm thuốc có dược chất không bền ở dạng dung dịch nước, đặc biệt là các dược chất dễ bị thuỷ phân Việc bảo quản chế phẩm ở trạng thái khô (sau khi đông khô) giữ cho thuốc ổn định trong quá trình bảo quản Tuy nhiên, dược chất vẫn có thể bị thuỷ phân hoặc phân huỷ ở mức độ nào đó ngay trong quá trình đông khô, nếu thành phần của dung dịch đem đông khô không chứa các tác nhân có thể giảm thiểu hay khống chế được

sự thuỷ phân dược chất

Như vậy, việc nghiên cứu xây dựng công thức dung dịch đem đông khô

có vai trò quyết định Khi thiết kế công thức thuốc tiêm đông khô có dược chất dễ bị thuỷ phân, cần đặc biệt chú ý tới ảnh hưởng của ba thành phần (tỷ

lệ nước trong hỗn hợp dung môi, pH của dung dịch, tá dược) và bao bì

i) Hàm lượng nước trong dung môi [1], [21]: Nước là môi trường thuỷ

phân đối với rất nhiều dược chất có các liên kết hoá học dễ bị thuỷ phân như este, lacton, lactam, Một trong những biện pháp hạn chế thuỷ phân dược chất là giảm tỷ lệ nước trong hỗn hợp dung môi bằng việc sử dụng các dung môi khan tan được trong nước như propylenglycol, ethanol, glycerin

Ngoài các dung môi trên, người ta còn sử dụng hỗn hợp dung môi butanol và nước (tỷ lệ thể tích là 20:80) khi cần tăng nhanh tốc độ hoà tan trở lại của bột đông khô vì nó tạo ra bề mặt tiếp xúc lớn sau quá trình đông khô; Mặt khác, tert-butanol còn có tác dụng sát khuẩn, nên đảm bảo độ vô khuẩn cho thuốc tiêm đông khô Để giảm đau, giảm kích ứng khi tiêm và bảo quản chế phẩm, người ta thường thêm alcol benzylic vào thuốc tiêm, do alcol

tert-benzylic ngoài tác dụng làm dung môi, nó còn có tác dụng gây tê tại chỗ và tác dụng sát khuẩn Song, các dung môi tan được trong nước có thể gây kích ứng chỗ tiêm hoặc làm tăng độc tính của thuốc khi dùng với lượng lớn hoặc với nồng độ cao

ii) pH của dung dịch trước khi đông khô [21]: Thông thường pH của

dung dịch trước khi đông khô và pH của dung dịch hoà tan chế phẩm đông khô trở lại là tương tự nhau Tuy nhiên, nếu sử dụng axit hoặc bazơ dễ bay hơi để điều chỉnh pH của dung dịch trước khi đông khô thì pH có thể thay đổi đáng kể trong quá trình quá trình đông khô

Để lựa chọn giá trị pH thích hợp cho một dung dịch thuốc tiêm, người

ta thường nghiên cứu thiết lập đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của tuổi thọ thuốc theo giá trị pH Khoảng giá trị pH được lựa chọn sẽ là pH để thuốc có

độ ổn định cao nhất Khi thuốc đạt tuổi thọ trên 2 năm trong khoảng pH rộng, thì có thể lựa chọn pH của thuốc tiêm cho những mục tiêu khác như khả năng dung nạp tại vị trí tiêm, sinh khả dụng,

Trong quá trình bảo quản, pH của thuốc tiêm có thể thay đổi do sự biến đổi của dược chất, gây ra do các chất có trong thành phần bao bì thuỷ tinh hoà tan dần dần vào dung dịch thuốc Khi pH của thuốc tiêm thay đổi sẽ làm giảm độ ổn định của dược chất trong dung dịch Do vậy, để duy trì pH của dung dịch thuốc tiêm ổn định ở giá trị thích hợp nào đó, người ta thường dùng hệ đệm Việc lựa chọn hệ đệm trong công thức đông khô cần phải chú ý đến khả năng hệ đệm bị kết tinh trong giai đoạn đông lạnh, làm thay đổi đáng

kể pH, làm giảm độ ổn định của chế phẩm ngay trong quá trình đông khô

- Tá dược độn: Trong trường hợp dược chất được dùng với liều rất nhỏ

và tự nó không thể hình thành được bánh đông khô có hình dạng xác định, người ta phải thêm tá dược độn để phân tán dược chất và tạo khuôn Các tá

dược độn thường dùng là manitol, lactose, glycin, polyethylene glycol (PEG), cyclodextrin và dẫn chất hoặc hỗn hợp của các tá dược này

- Chất bảo vệ: Khi bào chế các thuốc tiêm đông khô chứa dược chất là

protein, liposome, cần có thêm chất bảo vệ dược chất để tránh sự phá huỷ trong giai đoạn đông lạnh hoặc giai đoạn làm khô hay cả hai Nói chung, các đường không no (chứa liên kết đôi) như saccarose, lactose, maltose là các chất bảo vệ hiệu quả nhất

- Các chất đẳng trương: Trong một số trường hợp, thuốc tiêm đòi hỏi

phải đẳng trương, thì mới có thể sử dụng manitol (làm tá dược độn) và saccarose (làm chất bảo vệ)

Khi lựa chọn các tá dược đưa vào thành phần của dung dịch đem đông khô, phải chú ý tới khả năng hút ẩm, trạng thái vật lí của tá dược trong quá trình đông khô , vì chúng có thể ảnh hưởng tới sự thuỷ phân của dược chất

Ví dụ, thuốc tiêm đông khô Methylprednisolon sodium succinat dùng tá dược độn manitol thì tốc độ thuỷ phân dược chất tăng lên so với khi dùng lactose

Để giảm thiểu sự thuỷ phân dược chất trong quá trình bảo quản các chế phẩm thuốc tiêm đông khô, phải khống chế hàm lượng nước còn lại trong sản phẩm đông khô và tốt nhất ở mức dưới 1% Nói chung, hàm lượng nước còn lại trong chế phẩm được quyết định không chỉ bởi các thông số kỹ thuật của quá trình đông khô, mà còn phụ thuộc khá lớn vào tá dược đã sử dụng trong công thức đông khô

iv) Bao bì [1], [5]: Bao bì chứa/đóng gói thuốc tiêm đông khô thông

thường là các lọ thuỷ tinh có dung tích thay đổi từ 2 mL, 3 mL, 5 mL đến 10

mL và nút đậy bằng cao su xẻ rãnh, ngoài cùng là chụp bằng nhôm Lọ thuỷ tinh là vật liệu bao bì không cho sự xâm nhập của hơi nước vào thuốc, nhưng

độ kín của nút cao su với miệng lọ sẽ có ảnh hưởng đáng kể đến độ ổn định của chế phẩm

1.3 Giới thiệu về thuốc tiêm đông khô NEUTRIVIT 5000

Thuốc tiêm đông khô NEUTRIVIT 5000 (được bào chế theo kỹ thuật đông khô) do Công ty CP Dược TTBYT Bình Định sản xuất và tiêu thụ trên thị trường đầu tiên ở nước ta từ năm 2012 Thuốc tiêm đông khô NEUTRIVIT 5000 có thành phần như sau :

 Mỗi lọ thuốc đông khô chứa:

 Nước cất pha tiêm vừa đủ 5ml

- Dạng bào chế - Quy cách đóng gói: Hộp 4 lọ bột đông khô + 4 ống dung

môi 5ml

+ Dược lực học:

Vitamin B1: Trong cơ thể Vitamin B1 kết hợp với Adenosine

-triphosphate(ATP) tạo thành Thiamin pyrophosphate Vai trò của nó trong chuyển hóa carbohydrate là adecarboxy hóa acid pyruvic và các

alphaketoacid tạo thành Acetaldehyde và Carbon dioxide

Vitamin B6: Trong cơ thể Vitamin B6 bị chuyển hoá thành Pyridoxal- 5’- phosphate, một dạng có hoạt tính sinh học của Vitamin B6, chất này đóng vai trò như 1 coenzym hoạt tính trong rất nhiều quá trình chuyển hóa, như chuyển hóa các amino acid, nucleic acid, acid béo chưa no, các carbohydrate,

dị hóa glycogen và tổng hợp porphyrin

Vitamin B12: Có tác dụng tạo máu Trong cơ thể người, các

cobalamin này tạo thành các coenzym hoạt động là methytcobalamin và deoxyadenosylcobalamin rất cần thiết cho tế bào sao chép và tăng trưởng Ngoài ra, khi nồng độ Vitamin B12 không đủ sẽ gây ra suy giảm chức năng của một số dạng acid folic cần thiết khác trong tế bào Vitamin B12 rất cần thiết cho tất cả các mô có tốc độ sinh trưởng tế bào mạnh như các mô tạo máu, ruột non, tử cung

Vitamin B12: Được hấp thu ở hồi tràng nhờ acid hydrocloric tách Vitamin B12 khỏi thức ăn rồi gắn với yếu tố nội là một glycoprotein có trong thành đáy dạ dày để được vận chuyển qua thành ruột Vào máu Vitamin B12 gắn với Transcobalamin II rồi được tích trữ ở gan 1-10mg chiếm 90% tổng lượng Vitamin B12 chỉ có Transcobalamin II có khả năng vận chuyển

Vitamin B12 vào mô

Nguồn dự trữ của Vitamin B12 bị tiêu hao chậm ( 3-5mcg/ngày ) nên biểu hiện thiếu máu chỉ xảy ra 3-4 năm sau khi cắt phần lớn dạ dày Thời gian bán huỷ của Vitamin B12 ở gan khoảng 400 ngày Vitamin B12 có chu kỳ gan ruột

- Chỉ định: Neutrivit 5000 được dùng trong các trường hợp sau: Viêm dây

thần kinh, viêm đa dây thần kinh, viêm đa dây thần kinh do nghiện rượu mãn tính, viêm dây thần kinh thị giác, hậu nhãn cầu do thuốc hay độc chất, đau thần kinh toạ, đau do phong thấp, đau dây thần kinh cổ cánh tay

- Liều lượng và cách dùng: Người lớn: tiêm bắp 1 hội chứng đau nhức liên

quan đến thần kinh: 1-2 lọ/ngày, nghiện rượu mãn tính: 2 lọ/ngày

- Chống chỉ định: Mẫn cảm với bất cứ thành phần nào của thuốc

- Tương tác thuốc: Chưa có báo cáo nào về tương tác thuốc

- Thận trọng: Phụ nữ có thai không chống chỉ định, nhưng phải có ý kiến của

bác sĩ

- Tác dụng không mong muốn: Chưa được ghi nhận được

1.4 Giới thiệu về hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 1.4.1 Vitamin B1 ( Thiamine Hydrochloride) [1], [5], [6], [8]

Vitamin B1 có công thức phân tử là C 12 H 17 ClN 4 OS ·HCl , khối lượng mol là 337,27 g/mol và có công thức cấu tạo như nêu ở hình 1.3

Vitamin B1 có một số tính chất lý – hóa như sau: Bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng hoặc tinh thể không màu, dễ tan trong nước, tan trong glycerol, ít tan trong Ethanol 96%; pH trong dung dịch nước (Dung dịch chế phẩm 10mg/ml trong nước) là 2,7 –3,4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Vitamin B1

1.4.2 Vitamin B6 ( Pyridoxine Hydrochloride) [5],[6], [8]

Vitamin B6 có công thức phân tử là C8H11NO3 ·HCl , khối lượng mol

là 205,64 g/mol và có công thức cấu tạo như nêu ở hình 1.4

Vitamin B6 có một số tính chất lý – hóa như sau: Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96 %, thực tế không tan trong cloroform và ether.Chảy ở khoảng 205 C kèm theo phân hủy pH trong

dung dịch nước (Hòa tan 2,50 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 50,0

±1nm

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Vitamin B12

Hiện nay, trên thị trường thế giới và ở nước ta, đang lưu hành một số loại thuốc chứa đồng thời 3 hoạt chất Vitamin B1, vitamin B6, Vitamin B12, nhưng cho đến nay, quy trình bào chế các loại thuốc đó chưa được đưa ra trong các Dược điển Việt Nam, Dược điển Anh, Mỹ và Châu Âu Mặt khác, quy trình phân tích riêng và phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, vitamin B6, Vitamin B12 cũng chưa được công bố trong các dược điển nói trên Rõ ràng,

để phục vụ công tác kiểm nghiệm dược phẩm, việc nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích riêng và đặc biệt là phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, vitamin B6, Vitamin B12 trong các loại thuốc là rất cấp thiết Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đang được xem là một trong những phương pháp chuẩn và được dùng phổ biến trong lĩnh vực phân tích và kiểm nghiệm dược phẩm Dưới đây sẽ giới thiệu về phương pháp HPLC

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.5.1 Nguyên lý [7], [9], [10], [11]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đôi khi còn được gọi

là phương pháp sắc ký lỏng áp suất cao, là phương pháp phân tích dựa trên cơ

sở của sự phân tách các chất trong mẫu trên một pha tĩnh chứa trong cột, khi mẫu di chuyển qua cột nhờ dòng pha động lỏng dưới áp suất cao Phương pháp HPLC là một phương pháp điển hình thuộc nhóm các phương pháp sắc

ký lỏng (LC - Liquid Chromatography)

Khi phân tích theo phương pháp HPLC, các chất trong mẫu được hòa tan trong dung môi thích hợp Khi cho dung môi chứa chất phân tích đi qua cột (nhờ dòng pha động áp suất cao), các chất phân tích được tách ra ở các thời điểm khác nhau Các chất sau khi ra khỏi cột được phát hiện bởi detector

và tín hiệu từ detector được chuyển qua bộ phận xử lý tín hiệu để cho ra kết quả là sắc đồ của mẫu được phân tích Dựa vào sắc đồ, có thể định tính và định lượng các chất trong mẫu Sơ đồ tổng quát của hệ thống phân tích theo phương pháp HPLC được nêu ở hình 1.6

Hình 1.5 Hệ thống phân tích HPLC 1.5.2 Phân loại các phương pháp sắc ký lỏng [10], [11], [12], [19], [20]

Căn cứ vào cấu tạo của pha tĩnh, thành phần của pha động và cơ chế tách, người ta phân loại các phương pháp sắc ký lỏng như sau:

- Sắc ký hấp phụ: phương pháp sắc ký dựa trên sự phân bố chất phân tích giữa pha tĩnh (rắn, lỏng) và pha động (lỏng) nhờ lực tương tác Van – de - van thông qua các trung tâm hấp phụ

- Sắc ký phân bố lỏng-lỏng (sắc ký chiết): phương pháp sắc ký dựa trên

sự phân bố chất phân tích giữa 2 pha lỏng Pha tĩnh là chất lỏng được phủ lên

bề mặt một chất mang trơ nhồi trong cột tách Pha động chảy qua cột, nhưng không hòa tan pha tĩnh

- Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh được cải tiến, biến đổi nhờ liên kết với các nhóm chức hóa học khác nhau để có thể tách được nhiều loại chất tan khác nhau Dựa vào cấu tạo của pha liên kết mà người ta chia ra thành nhiều kiểu sắc ký khác nhau:

 Sắc ký pha đảo (Reverse Phase - HPLC hay RP - HPLC): pha động phân cực hơn (thường là nước) so với pha tĩnh

 Sắc ký pha thuận (Normal Phase - HPLC hay NP - HPLC): pha động không phân cực hoặc ít phân cực hơn so với pha tĩnh

 Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange - HPLC hay IE - HPLC): sự tách xảy ra nhờ sự trao đổi ion giữa các chất phân tích trong mẫu và các ion pha tĩnh

- Sắc ký ion: sự tách xảy ra dựa trên sự trao đổi của ion chất phân tích với pha tĩnh và pha động

- Sắc ký rây phân tử: sự tách xảy ra dựa trên sự lưu giữ chất phân tích theo kích thước phân tử của nó trên pha tĩnh

1.5.3 Các đại lượng đặc trưng trong phương pháp phân tích sắc ký lỏng

[9], [10], [11], [24], [25], [26]

Sau khi ra khỏi cột tách, các chất phân tích đi vào detector Đặc trưng hóa lý của chất phân tích được detector phát hiện, chuyển thành tín hiệu, khuyếch đại và ghi thành sắc ký đồ hay sắc đồ (hình 1.7 và 1.8)

1) Thời gian lưu (tR):

Thời gian lưu (tR) hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh (tR’) của mỗi chất phân tích là hằng định và các chất phân tích khác nhau sẽ có thời gian lưu khác nhau ở cùng một điều kiện HPLC đã chọn Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng được dùng để phát hiện định tính các chất phân tích Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố như: bản chất sắc ký của pha tĩnh; bản chất, thành phần, tốc độ của pha động; cấu tạo và bản chất của chất phân tích; trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động

2) Số đĩa lý thuyết (N):

Khi chất phân tích đi qua cột tách, nó sẽ phân bố cân bằng giữa 2 pha - pha động và pha tĩnh Khi đạt được 1 cân bằng, người ta nói đạt được 1 đĩa lý thuyết Độ dài cột để đạt được 1 đĩa lý thuyết được gọi là chiều cao đĩa lý thuyết (H)

Hình 1.7 Sắc đồ và các đại lƣợng đặc trƣng

Hình 1.8 Sắc đồ của 2 chất đƣợc tách ra khỏi nhau

Trong đó (hình 1.7 và 1.8), tm: thời gian chết; Wb1 & Wb2: độ rộng tại đường nền của đỉnh 1 và đỉnh 2; tR: thời gian lưu của đỉnh sắc ký; tR’1 & tR’2: thời gian lưu hiệu chỉnh; ∆t: hiệu giữa 2 thời gian lưu hiệu chỉnh

Số đĩa lý thuyết (N) là đại lượng biểu thị hiệu năng tách của cột tách trong một điều kiện sắc ký nhất định Số đĩa lý thuyết N càng lớn (hay chiều cao đĩa lý thuyết H càng nhỏ), hiệu quả tách của cột càng cao Số đĩa lý thuyết

N được tính theo công thức (1.5.1):

2 2

2

16 545

h

R R

W

t W

t t

N

 : : độ lệch chuẩn của đỉnh sắc ký; Wh: độ rộng tại ½ chiều cao đỉnh;

Wb: độ rộng đỉnh tại đường nền; tR: thời gian lưu của đỉnh sắc ký

Trong thực tế, N thường nằm trong khoảng 2.500 đến 5.500, và tối thiểu phải đạt là 1.000

3) Độ phân giải (R):

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của hai chất phân tích ra khỏi nhau ở cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Độ phân giải R giữa hai đỉnh cạnh nhau được tính như sau:

) 2 ( ) 1 (

1 2

2 1

1

( 2

h h

R R

b b

R R

W W

t t W

W

t t R

4) Hệ số đối xứng (T):

Hệ số đối xứng T cho biết mức độ đối xứng của đỉnh trên sắc đồ thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa đỉnh (bên phải và bên trái) tại điểm 1/10 hoặc 1/20 của chiều cao đỉnh

Trong thực tế, rất khó đạt được những đỉnh có dạng đối xứng như phân

bố chuẩn hay phân bố Gauss (T = 1) Khi T nằm trong khoảng 0,8  2,5 thì phép định lượng được chấp nhận

h   (1.5.4) Trong đó,

A: hệ số mô tả các đường đi khác nhau của chất phân tích trong cột; B: hệ số khuếch tán dọc theo chiều dài cột;

C: hệ số trở kháng chuyển khối

Ở cùng một điều kiện sắc ký xác định, sẽ có một tốc độ dòng (u) tối ưu

- là tốc độ mà tại đó H nhỏ nhất, tức là số đĩa lý thuyết (N) của cột tách lớn nhất và lúc này, hiệu quả tách của cột lớn nhất Chính vì vậy, đối với mỗi quy trình phân tích bằng phương pháp sắc ký, cần thiết phải khảo sát để tìm được

u thích hợp

1.5.4 Phương pháp định lượng trong HPLC [9], [10], [11], [27], [28]

1) Diện tích và chiều cao đỉnh:

- Diện tích đỉnh của một chất phân tích là đại lượng tỉ lệ thuận với nồng

độ của chất đó Để tính diện tích đỉnh, người ta thường dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình tính diện tích đỉnh Việc tính toán diện tích đỉnh sẽ gặp khó khăn khi đỉnh quá lớn hoặc bị doãng, hoặc không đối xứng

- Khi đỉnh có dạng không đổi, thì chiều cao đỉnh (khoảng cách từ đường nền đến đỉnh) là một đại lượng tỉ lệ thuận với diện tích đỉnh và do đó,

tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích Khi xác định chiều cao đỉnh (dùng máy tính) thì không cần xét đến hệ số đối xứng

2) Phương pháp định lượng:

Trong phân tích sắc ký, thường dùng các phương pháp định lượng sau:

- Phương pháp ngoại chuẩn (phương pháp đường chuẩn): tiến hành xây dựng phương trình đường chuẩn (bằng phương pháp hồi quy tuyến tính) biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích (hoặc chiều cao) đỉnh vào nồng độ các dung dịch chuẩn của chất phân tích (các sắc đồ của các dung dịch chuẩn được ghi ở cùng điều kiện sắc ký) Sau đó, từ diện tích (hoặc chiều cao) đỉnh của chất phân tích trong mẫu, xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu từ phương trình đường chuẩn

- Phương pháp nội chuẩn: thêm vào mẫu một lượng biết trước chính xác chất nội chuẩn (C0) có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất phân tích và có đỉnh tách khỏi đỉnh của chất phân tích ở cùng điều kiện sắc ký và có diện tích (hoặc chiều cao) đỉnh tỉ lệ thuận với diện tích (hoặc chiều cao) đỉnh của chất phân tích Tiến hành ghi sắc đồ của mẫu (sau khi thêm chất nội chuẩn) và tính nồng độ chất phân tích (C) theo công thức (1.5.5.):

Vì

0 0

0

0

A

AC C C

A C

A





 (1.5.5)

Trong đó,

A0 & C0: diện tích đỉnh và nồng độ chất nội chuẩn thêm vào mẫu;

A & C: diện tích đỉnh và nồng độ chất phân tích trong mẫu

- Phương pháp thêm chuẩn: phương pháp này thường được sử dụng trong HPLC khi có ảnh hưởng của các chất trong môi trường mẫu hay pha nền (matrix) Tiến hành ghi sắc đồ của dung dịch mẫu và dung dịch mẫu sau khi được thêm chuẩn chất phân tích (có thể thêm 1, 2, 3 hoặc 4 lần) Sau đó xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích đỉnh và nồng độ dung dịch chuẩn chất phân tích thêm vào mẫu (Cthêm) Phương trình có dạng A (diện tích đỉnh) = a + bCthêm và từ đó, tính được nồng

độ chất phân tích trong mẫu (C):

C =

b

a

(1.5.6) Trong đó, a: đoạn cắt trên trục tung của đường hồi quy tuyến tính;

b: hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính