Xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng bắc trung bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GV hƣớng dẫn : ThS Hoàng Văn Trung SV thực : Nguyễn Thị Giang - 1152043915 Nguyễn Thị Liên - 1152040507 Lớp : 52K - CNTP NGHỆ AN 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập –Tự –Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Ngu ễn Thị Giang Khóa: 52 Cán hƣớng dẫn: Cán duyệt: Mssv: 115204 3915 Nguyễn Thị Liên Mssv: 1152040507 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm ThS Hồng Văn Trung Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: Ngày tháng năm 2016 Cán hƣớng dẫn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập –Tự –Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Giang Mssv: Nguyễn Thị Liên Mssv: Khóa: 52 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 115204 3915 115204 0507 Cán hƣớng dẫn: ThS Hoàng Văn Trung Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: Ngày tháng năm 2016 Cán duyệt LỜI CẢM ƠN Khóa luận đƣợc thực Trung tâm phịng thực hành thí nghiệm - Trƣờng Đại học Vinh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, ch ng t i xin chân thành g i ời cảm ơn đến thầy giáoTh.S Hoàng Văn Trung - Khoa Hóa học - Trƣờng Đại học Vinh giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình nghiên cứu hoàn thành đề tài Ch ng t i xin chân thành cám Th.S Chu Thị Thanh Lâm – T.T Thực hành thí nghiệm – Trƣờng Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng tơi q trình làm thí nghiệm Ch ng t i xin g i lời cảm ơn đến thầy cô, cán Trung tâm Th nghiệm gi p đỡ chúng tơi q trình thực đề tài Và lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên, gi p đỡ chúng tơi hồn thành đề tài Vinh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Nguyễn Thị Giang - Nguyễn Thị Liên BẢNG KÍ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầ đủ Tên tiếng anh Hiệp hội nhà hố học phân tích Association of Official Analytical thống Chemists AQC Aminoquinolil - Nhydroxysuccinimidyl cacbamat Aminoquinolil - Nhydroxysuccinimidyl carbamate Dm Chất khô Dry matter EAA Axit amin thiết yếu Essential amino acid FMOC 9-florenylmetyl cloroformat 9-florenylmethyl cloroformate GC Sắc ký khí Gas chromatography Sắc ký khí detector ion hóa Gas chromatography/ flame l a ionization detector Viết tắt AOAC GC/FID Gas chromatography/ mass GC/MS Sắc ký khí khối phổ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao KPH Không phát MeOH Metanol Methanol NEAA Axit amin không thiết yếu Nonessential amino acid OPA ortho-phthalaldehyd/ orthophthaldialdehyd ortho-phthalaldehyd/ orthophthaldialdehyd PITC Phenylisothioxyanat Phenylisothiocyanate RPHPLC Sắc ký lỏng hiệu cao pha ngƣợc Reverse phase - High performance liquid chromatography TAA Tổng axit amin Total amino acid TEA Trietylamin Triethylamine THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran spectrometry High performance liquid chromatography MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài .1 Mục đ ch nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nấm 1.1.1 Giới thiệu nấm 1.1.2 Phân loại nấm 1.1.3 Đặc điểm dinh dƣỡng nấm .5 1.1.3.1 Chất khô, giá trị ƣợng .5 1.1.3.2 Protein axit amin 1.1.3.3 Lipid (chất béo) 1.1.3.4 Cacbohydrat chất xơ 1.1.3.5 Vitamin .7 1.1.3.6 Thành phần khoáng chất 1.1.3.7 Thành phần hƣơng vị 1.1.3.8 Thành phần chất chống oxi hóa 1.1.3.9 Thành phần có hại kháng dinh dƣỡng nấm ăn .9 1.1.4 Vai trò nấm tự nhiên đời sống ngƣời 1.2 Axit amin 13 1.1.2 Định nghĩa cấu trúc 13 1.2.2 Phân loại 14 1.1.3 Tính chất hóa lý axit amin 16 1.2.3.1 Tính chất ƣỡng tính 16 1.2.3.2 Tác dụng với ancol tạo hợp chất chứa nhóm chức este 16 1.2.3.3 Amino axit tham gia phản ứng trùng ngƣng, đồng trùng ngƣng tạo đipeptit, tripeptit,…, po ipeptit 16 1.1.4 Vai trò axit amin .17 1.1.5 Axit amin nấm 20 1.3 Các phƣơng pháp tách xác định đồng thời axit amin 23 1.3.1 Các phƣơng pháp sắc ký cổ điển 23 1.3.1.1 Phƣơng pháp sắc ký mỏng 23 1.3.1.2 Phƣơng pháp sắc ký cột 23 1.3.1.3 Phƣơng pháp chuẩn độ điện .24 1.3.2 Phƣơng pháp sắc ký khí .24 1.3.3 Phƣơng pháp điện di mao quản 24 1.3.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .25 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM .27 1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 27 1.2.1 Thiết bị dụng cụ 27 1.2.2 Hóa chất .27 2.2 Thực nghiệm 29 2.2.1 Thu thập mẫu nấm 29 2.2.2 X lí mẫu 29 2.2.3 Tiến hành phân tích máy 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Xây dựng đƣờng chuẩn 32 3.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định ƣợng phƣơng pháp .37 3.3 Khảo sát điều kiện thủy phân mẫu 39 3.3.1 Khảo sát nồng độ axit HCl 39 3.3.2 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu .42 3.5 Độ thu hồi phƣơng pháp 45 3.6 Xác định hàm ƣợng axit amin mẫu nấm 47 3.7 Kết phân t ch hàm ƣợng axit amin thủy phân 47 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Cấu trúc 20 axit amin tiêu chuẩn 14 Bảng 2.2: Trị số ƣớc lƣợng ƣợng đòi hỏi axit amin cần thiết (mg/kg cân nặng/ngày) 19 Bảng 2.3: Đối chiếu loại axit amin thiết yếu 20 Bảng 2.4: Thành phần axit amin thiết yếu số lồi nấm hoang (g/100g protein thơ)[9, 19] 21 Bảng 2.5: Hàm ƣợng axit amin tự loài nấm Calvatia gigantea phía Nam Thỗ Nhĩ Kỳ Kết cho số mg axit amin tự 100g nấm khô (mg/100 g ± SD) [17] 22 Bảng 2.6: Thành phần axit amin thiết yếu hai loài nấm Hàn Quốc (g/100g) (định ƣợng phƣơng pháp HPLC) [16] 22 Bảng 3.2: Giá trị LOD LOQ axit Aspartic 38 Bảng 3.3: Giới hạn phát giới hạn định ƣợng phƣơng pháp 38 Bảng3.4: Ảnh hƣởng nồng độ HC đến hiệu suất thu hồi 41 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 44 Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi axit amin nấm Thƣợng Hoàng 45 Bảng 3.7: Hàm ƣợng axit amin nấm N1 48 Bảng 3.8: Hàm ƣợng axit amin mẫu nấm 51 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol 32 Hình 3.2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 25pmol 32 Hình 3.3: Sắc đồ chạy hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 100pmol .33 Bảng 3.1: Sự phụ thuộc diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/l) axit amin 33 Hình 3.4: Đƣờng chuẩn định ƣợng Asp .34 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn định ƣợng Glu .34 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn định ƣợng Ser 34 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn định ƣợng His .35 Hình 3.8: Đƣờng chuẩn định ƣợng Gly 35 Hình 3.9: Đƣờng chuẩn định ƣợng Thr 35 Hình 3.10: Đƣờng chuẩn định Hình 3.11: Đƣờng chuẩn định Hình 3.12: Đƣờng chuẩn định Hình 3.13: Đƣờng chuẩn định Hình 3.14: Đƣờng chuẩn định Hình 3.15: Đƣờng chuẩn định Hình 3.16: Đƣờng chuẩn định Hình 3.17: Đƣờng chuẩn định ƣợng Ala 35 ƣợng Try .35 ƣợng .35 ƣợng Val 36 ƣợng Met .36 ƣợng Phe 36 ƣợng Ile .36 ƣợng Leu .36 Hình 3.18: Đƣờng chuẩn định lƣợng Lys 36 Hình 3.19: Đƣờng chuẩn định ƣợng Pro 37 Hình 3.20 Đƣờng chuẩn định ƣợng Arg .37 Hình 3.21: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm N1 nồng độ HCl 4M 39 Hình 3.22: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm N1 nồng độ HCl 6M 40 Hình 3.23: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm N1 nồng độ HCl 7M 41 Hình 3.24: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl 41 Hình 3.25: Sắc đồ axit amin mẫu nấm N1 thời gian thủy phân 20h 42 Hình 3.26: Sắc đồ axit amin mẫu nấm N1 thời gian thủy phân 22h 42 Hình 3.27 : Sắc đồ axit amin mẫu nấm N1 thời gian thủy phân 24h 43 Hình 3.28: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân 44 Hình 3.29: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm TH 46 Hình 3.30: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân nấm TH thêm chuẩn .47 Hình 3.31 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm PL1 49 Hình 3.32 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm PL2 49 Hình 3.33 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm TH 50 Hình 3.34 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm N2 50 Hình 3.23: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm nồng độ Cl Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi TT Nồng độ HCl (M) Axit amin Nồng độ (pmol) Cs+mẫu - Cmẫu Cs+mẫu Cmẫu Glu 228,14587 208,64294 19,50293 Glu 66,5674 42,43910 24,1283 Glu 67,43267 51,07817 16,3545 Thr 132,78534 115,35804 17,4273 Thr 55,5943 31,35585 24,23845 Thr 62,16694 42,47315 19,69625 Val 132,12242 116,42986 15,69256 Val 40,43063 17,34813 23,0825 Val 44,83456 32,82530 12,0093 Met 25,66935 11,65952 14,00983 Met 54,33773 29,74023 24,5975 Met 25,5623 11,34093 14,2214 Trong đó: Cos nồng độ chuẩn thêm vào (pmol) Cs+mẫu nồng độ mẫu thêm chuẩn (pmol) Cos (pmol) H% 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 78,01 96,51 65,42 69,71 96,95 78.78 62,77 92,33 48.03 56,04 98,39 56,88 Cmẫu nồng độ mẫu phân tích (pmol) Hình 3.24: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ Cl Từ đồ thị biểu di n phụ thuộc hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl thủy phân cho thấy nồng độ axit HC chƣa đủ để thủy phân mẫu hiệu suất 41 thu hồi số axit amin nhỏ 100%, lẫn tạp chất chƣa tách đƣợc hoàn toàn Từ nồng độ 6M hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định hiệu suất thu đƣợc lớn 90% Từ kết chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trƣờng thủy phân mẫu cho nghiên cứu 3.3.2 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu Để chọn thời gian phù hợp cho thủy phân axit amin, chuẩn bị mẫu nấm N1 nấm N1 thêm chuẩn 25 pmol môi trƣờng HCl 6M, nhiệt độ 1250C thủy phân mốc thời gian khác : 20h, 22h, 24h, 26h Hình 3.25: Sắc đồ axit amin mẫu nấm thời gian thủy phân 20h Hình 3.26: Sắc đồ axit amin mẫu nấm N1 thời gian thủy phân 22h 42 Hình 3.27 : Sắc đồ axit amin mẫu nấm N1 thời gian thủy phân 24h Hình 3.28 : Sắc đồ axit amin mẫu nấm thời gian thủy phân 26h 43 TT Bảng 3.5: Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi Thời Nồng độ (pmol) Axit Cs+mẫu Cos gian H% Cmẫu amin Cs+mẫu Cmẫu (pmol) (h) 20 Lys 136,01164 110,33464 25,677 25 102,71 22 Lys 265,66745 239,59827 26,0692 25 104,28 24 Lys 76,54772 51,80521 24,74251 25 98,97 26 Lys 68,60565 45,87565 22,73 25 90,92 20 Glu 75,41949 53,46544 21,9540 25 87,82 22 Glu 100,66738 77,95735 22.71003 25 90,84 24 Glu 66.55488 42,43910 24,11578 25 96,46 26 Glu 61,10768 35,85110 25,2566 25 101,03 20 Thr 72,7731 51,05245 21.72065 25 86,88 22 Thr 135,7157 115,17985 20.53586 25 82,14 24 Thr 55,21005 31,35585 23.85420 25 95,42 26 Thr 52,32893 27,67528 24.65365 25 98,61 20 Try 30,62722 4,61492 26.0123 25 104,05 22 Try 37,25276 14,92409 22.32867 25 89.31 24 Try 31,00674 6,21724 24.7895 25 99,16 26 Try 29,07270 6,11550 22,9572 25 91,83 Hình 3.29: Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân Kết bảng 3.5 hình 3.29 cho thấy dƣới 20h mẫu chƣa đƣợc thủy phân hoàn toàn, axit amin chƣa tách hết khỏi tạp chất nên cho hiệu suất thu hồi không ổn định Khi thời gian thủy phân lớn 20h đủ để tách đƣợc axit amin khỏi mẫu 44 nên hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định Thời gian từ 24h-26h cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, lớn 90%, 24h cho hiệu suất lớn ( 95%) ổn định Vậy nên chọn 24h thời gian thủy phân mẫu phân tích Từ kết thu đƣợc khảo sát nồng độ axit HCl thời gian thủy phân trình bày ch ng t i đề xuất ƣợc đồ quy trình phân tích mục 2.4.3 cho axit amin thủy phân 3.5 Độ thu hồi phƣơng pháp Đây th ng số thiếu đánh giá phƣơng pháp phân t ch Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực với làm mẫu thực không thêm chuẩn song song tiến hành t nh độ thu hồi nhƣ sau :  Hiệu suất thu hồi: H%  Csm  Cm  100 C so Trong đó: H%: hiệu suất thu hồi Cs+m: Nồng độ chất phân tích mẫu thêm chuẩn Cm : Nồng độ chất phân tích mẫu thực Cso: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ch ng t i tiến hành nghiên cứu mẫu nấm xác định đƣợc hàm ƣợng axit amin phần xác định độ lặp lại phƣơng pháp, mẫu nấm TH Tiến hành thí nghiệm nấm TH, nấm TH thêm chuẩn 25pmol, dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn thu đƣợc kết mẫu thêm chuẩn đem so sánh với nồng độ chuẩn thêm vào, thực phân tích 3lần lặp lại lấy kết trung bình Các kết đƣợc bảng 3.6 Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi axit amin nấm TH Cmẫu Cso Cso+mẫu Axit amin H (%) ( g / ml ) ( g / ml ) g / ml Asp KPH KPH 3,325 Glu 8,029 4,5704 3,675 94,11 Ser 5,8624 3,3793 2,625 94,59 His 41,894 38,027 3,875 99,79 Gly 3,0434 1,4117 1,875 87,02 Thr 5,4786 2,6469 2,975 95,18 Ala 17,2843 14,8850 2,225 107,83 Arg 10,9774 6,7759 4,350 96,58 45 Tyr 5,9700 1,7104 4,525 94,13 Cys – ss – Cys 7,9564 4,7935 3,025 104,56 Val 6,0238 3,5919 2,925 83,14 Met 8,4567 5,2138 3,725 87,06 Phe 13,9833 9,4113 4,125 110,83 Ile 6,5002 3,3027 3,275 97,63 Leu 5,8142 2,6356 3,275 97,05 Lys 15,1456 12,1039 3,650 83,33 Pro 15,9678 13,0739 2,875 100,66 Các kết hiệu suất thu hồi giao động từ khoảng 83% đến 110% Theo AOCA, khoảng nồng độ axit amin xét độ thu hồi chấp nhận đƣợc từ 80 - 110%, nhƣ phƣơng pháp áp dụng cho mẫu nấm TH có độ thu hồi tốt Hình 3.30: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm T 46 Hình 3.31: Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân nấm T thêm chuẩn 3.6 Xác định hàm lƣợng axit amin mẫu nấm Sau tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho trình x lý mẫu phân tích axit amin mẫu nấm Đánh giá thống kê quy trình phân t ch axit amin đạt giới hạn cho phép, chúng tơi tiến hành áp dụng phân tích mẫu thực tế gồm mẫu nấm tự nhiên: nấm PL1, nấm PL2, nấm N1, nấm N2, nấm TH Hàm ƣợng axit amin (μg/g) có mẫu đƣợc t nh theo c ng thức sau : C  C     Vdm  f m Trong : - C hàm ƣợng axit amin có mẫu, t nh theo μg/g - Co: Hàm ƣợng axit amin có dịch chiết t nh th ng qua đƣờng chuẩn ( g / ml ) - m: ƣợng mẫu nấm phân t ch (g) - Vdm: Thể t ch định mức mẫu (m ) - f : hệ số pha oãng 3.7 Kết phân tích hàm lƣợng axit amin thủy phân Mẫu nghiên cứu gồm loại nấm đƣợc tiến hành phân t ch theo ƣợc đồ quy trình phân tích Kết phân tích cụ thể hàm ƣợng axit amin 0.5g mẫu nấm N1 đƣợc bảng 3.7 sắc đồ từ hình 3.32 đến hình 3.35 Kết phân tích cụ 47 thể hàm ƣợng axit amin 0.5 g mẫu nấmđƣợc bảng 3.8 Bảng 3.7: Hàm lượng axit amin nấm N1 Axit amin Diện tích Hàm lƣợng ( g / g ) Thr 3331,1106 147,9945 Val 2326,77271 75,8190 Met 3717,69604 172,9229 Ile KPH KPH Leu 1218,06726 43,3658 Phe 5704.58691 1829,217 Lys 1362,24341 300,8020 His 886,34241 3418,150 Tổng axit amin thiết yếu 5988,271 TT Asp KPH KPH 10 Glu 3793,11060 241,2822 11 Ser 2924,69409 97,8765 12 Gly KPH KPH 13 Cys – ss – Cys 2177,15503 271,8224 14 Ala 12076,4 469,4727 15 Arg 4169,94531 229,6458 16 Tyr 724,11273 38,31505 17 Pro 5741,56299 216,4494 Tổng axit amin không thiết yếu 1564,864 Tổng 4983,014 EAA/TAA 68,59 % Hàm ƣợng mẫu nấm PL1, PL2,N2,TH đƣợc t nh toán tƣơng tự, kết đƣợc bảng 3.7 sắc đồ từ hình 3.32 đến 3.35 48 Hình 3.32 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm PL1 Hình 3.33 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm PL2 49 Hình 3.34 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm T Hình 3.35 Sắc đồ tách axit amin dịch thủy phân mẫu nấm N2 50 STT Bảng 3.8: Hàm lượng axit amin mẫu nấm Axit amin Nấm PL1 Nấm PL2 Nấm TH Nấm N2 Thr 109,4345 86,802 101,141 72,575 Val 168,625 114,75 139,461 128,706 Met 33,308 17,416 208,555 34,416 Ile 394,782 185,692 132,108 288,548 Leu 474,845 380,435 105,426 99,764 Phe 125,080 87,058 376,454 168,314 Lys 675,402 512,158 614,67 610,873 His 1145,874 KPH 2245,405 2011,132 3127,351 1384,311 3822,079 3414,328 Tổng axit amin thiết yếu Asp KPH KPH KPH KPH 10 Glu 155,291 172,024 172,024 113,319 11 Ser 81,953 84,4397 84,4397 50,4656 12 Gly 56,087 41,2062 48,8994 99,889 13 Cys – ss – Cys 212,250 197,805 184,836 130,09 14 Ala 287,696 226,253 595,399 194,104 15 Arg 33,6598 31,7014 271,038 16,363 16 Tyr 55,199 37,4739 68,415 45,142 17 Pro 721,173 562,065 411,917 670,296 Tổng axit amin không thiết yếu 1603,309 1352,968 1836,968 1319,669 Tổng 4730,659 2737,279 5659,047 4733,997 EAA/TAA 66,11 % 50,57 % 67,54 % 72,12 % Bảng 3.8 cho thấytrong loại nấm nấm TH có tổng hàm ƣợng axit amin cao (5659,047μg/g), nấm Pl2 thấp (2737,279μg/g) Nếu so sánh với số loài nấm giới đƣợc nghiên cứu hàm ƣợng nhƣ nấm sị tím 6,86 g/100g = 68600 μg/g nấm kim châm Hàn Quốc 5,62 g/100g = 56200 μg/g (Lee, K, J et at., 2011), hay loài Dictyophora indusiata (nấm ƣới trắng) ồi có hàm ƣợng axit amin (8000mgkg-1) thấp 41 lồi nấm Vân Nam (mục 1.2.5) nhận xét mẫu nấm hàm ƣợng trung bình cịn thấp Nhƣ vậy, tùy thuộc lồi nấm, m i trƣờng sống…mà nấm có hàm ƣợng protein khác Trong thành phần loại nấm chứa đầy đủ axit amin thiết yếu 51 cho thể Tỉ lệ EAA/TAA từ50.57% (nấm P 2) đến 72,12% (nấm N2) suy tỉ lệ EAA/NEAA từ1,02 – 2,58 Nhƣ tỉ lệ EAA/NEAA oại đáp ứng tốt với giá trị tham khảo 0,6 đề nghị PAO/WHO (1973) Tuy nhiên axit amin Asp kh ng đƣợc định ƣợng mẫu ảnh hƣởng khách quan đến kết Cả5 loại nấm nguồn thực phẩm giàu dinh dƣỡng có chứa đầy đủ axit amin thiết yếu Hàm ƣợng His số acid amin khác nhỏ vài oại nấm nên định ƣợng đƣợc 52 KẾT LUẬN Trên sở nhiệm vụ đƣợc đặt kết đạt đƣợc rút số kết luận sau: Khảo sát tối ƣu hóa số điều kiện quy trình thủy phân x lý mẫu xác định hàm ƣợng axit amin nấm : + Thời gian thủy phân mẫu tối ƣu 24h + Nồng độ HCl thủy phân tối ƣu 6M Đã xây dựng đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn axit amin xác định đƣợc khoảng nồng độ nghiên cứu nằm khoảng tuyến tính Xác định đƣợc giới hạn phát LOD giới hạn định ƣợng LOQ phƣơng pháp nhỏ: LOD từ 0,0010 – 0,0356 pmol, LOQ từ 0,0035 – 0,1187 pmol Quy trình phân t ch đƣa đƣợc đánh giá đƣờng chuẩn, độ thu hồi Độ thu hồi với loại axit amin nằm khoảng 83,14 – 110,83% vùng đƣờng chuẩn tuyến tính Xác định đƣợc hàm ƣợng axit amin thủy phân mẫu nấm tự nhiên, cụ thể: Mẫu nấm Hàm lƣợng axit amin thủy phân (μg/g) Nấm PL1 4730,659 Nấm PL2 2737,279 Nấm N1 4983,014 Nấm N2 4733,997 Nấm TH 5659,047 Từ kết thu đƣợc thấy phƣơng pháp phân t ch hàm ƣợng axit amin mẫu nấm với độ tin cậy cao đề nghị đƣợc áp dụng phƣơng pháp phân tích axit amin cho nhiều đối tƣợng thực phẩm khác Chúng mong muốn đƣợc tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh mở rộng đề tài khác, tiếp tục đánh giá kết để so sánh đƣợc hàm ƣợng axit amin lồi nấm khác từ đánh giá đƣợc giá trị loài nấm bổ sung số liệu vào bảng thành phần thực phẩm Việt Nam 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguy n Trung thuần, Phạm Thị Thu, (2002), Bách khoa dinh dưỡng, Nhà xuất Phụ Nữ- Hà Nội, trang 28-52 Phạm Luận (1987), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Khoa Hóa học Trƣờng Đại học Tổng Hợp Hà Nội Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao, Khoa Hóa học - Trƣờng ĐHKHTN Hà Nội Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nhƣ Thuận (1978), Kiểm nghiệm ƣơng thực thực phẩm, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật – Hà Nội, trang 128-183 Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn Việt Nam tập I, Nhà xuất khoa học tự nhiên công nghệ Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2008), Thành phần loài nấm dƣợc liệu Việt Nam, Tạp chí di truyền học ứng dụng – chuyên san công nghệ sinh học, 4, 39-42 Tiếng Anh AOAC Official Method (2000), Monosodium Glutamate in food, Potentiometric Titration Method, C 970.37 Bailey, J.L (1962), Estimation of amino acids by ninhydrin, Techniques in Protein Chemistry, Elsevier, Amsterdam, pp 73-81 Bano, Z., Rajathnam, S (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, ChineseUniversity Press, Hong Kong, 363-380, 1982 10 Belitz, H.-D., & Grosch, W (1999), Food chemistry, Berlin: Springer 11 Chang, S, T (1980), Mushroom as human food, Bioscience, 30, 399-401 12 Colak, A., Faiz, Z., & Sesli, E (2009), Nutritional composition of some wild edible mushrooms, Turkish Journal of Biochemistry, 34, 25–31 13 Diplock AT, Aggett PJ, AshwellM, Bornet F, Fern EB, RoberfroidMB (1999), Br J Nutr, 81:S1–S27 14 Falandysz J (2008) J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev; 26:256–99 15 FAO (Food and Agriculture Organization) (1991), Protein Quality Evaluation, Rome:Food and Agricultural Organization of the United Nations 16 Guo, Y J., Deng, G F., Xu, X R., Wu, S., Li, S., Xia, E Q., et al (2012), Antioxidant capacities, phenolic compounds and polysaccharide contents of 49 edible macro-fungi, Food & Function, 3, 1195–1205 54 17 Hawksworth, D.L., (1991), The fungal dimension of biodiversity Magnitude, significance and conservasion, Mycol, Res 95, 640-655 18 Ibrahim Kıvrak, Seyda Kıvrak, Mansur Harmandar (2014), Free amino acid profi ing in the giant puffba mushroom (Ca vatia gigantea) using UPLC– MS/MS, Food Chemistry, 158, 88–92 19 Kim, M Y., Chung, L M., Lee, S J., Ahn, J K., Kim, E H., Kim, M J., et al (2009), Comparison of free amino acid, carbohydrates concentrations in Korean edible and medicinal mushrooms, Food Chemistry, 113, 386–393 20 Lourdes Bosch, Amparo Alegria, Rosaura Farre (2006), Application of the 6aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RPHPLC determination of amino acids in infant foods, Journal of chromatography B, 831, P 176-183 21 Li, G S F., Chang, S.T (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, Chinese University Press, Hong Kong, 199-219 22 Manzi P, Grambelli L, Marconi S, Vivanti V, Pizzoferrato L (1999), Food Chem, 65, 477–82 23 Manzi, P., Marconi, P., Aguzzi, A., & Pizzoferrato, L (2004), Commercial mushrooms: Nutritional quality and effect of cooking, Food Chemistry, 84, 201–206 24 Moore, S., Stein, W.H., (1951), Determination amino acid by post-columm derivatization, J.Biol Chem 192,663 25 Satoshi Mitsuhashi (2014), Current topics in the biotechnological production of 26 27 28 29 essential amino acids, functional amino acids, and dipeptides, Current Opinion in Biotechnology, 26:38–44 University of MarylandMedicalCenter (2009) "Lysine", Retrieved Whittaker, R H (1969), “New concepts of kingdoms of organisms”, Science, 163, 150–160 Wu G (2009), Amino acids: metabolism, functions, and nutrition, Amino Acids, 37, 1-17 Yaru Song, Ming Shenwu, Shulin Zhao, Dongyan Hou, Yi-Ming Liu (2005), Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro-4- nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatographyltandem mass spectrometry, Journal of chromatography A, 1091, 102-109 30 Yiannis C Fiamegos, Constantine D Stalikas (2006), Gas chromatographic determination of amino acids via one-step phase-transfer catalytic pentafluorobenzylation-preconcentration, Journal of chromatography A 55 ... amin, vitamin, kháng sinh, phụ gia thực phẩm Xuất phát từ thực tế đó, lựa chọn đề tài : ? ?Xác định hàm lượng axit amin số loài nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC? ?? Mục... dụng sắc ký lớp mỏng 1.3.1.2 Phương pháp sắc ký cột Phƣơng pháp sắc ký cột phƣơng pháp sắc ký đơn giản, tảng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sau Phƣơng pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột... 0,94 0,39 0,20 3,83 22 1.3 Các phƣơng pháp tách xác định đồng thời axit amin 1.3.1 Các phương pháp sắc ký cổ điển 1.3.1.1 Phương pháp sắc ký mỏng Phƣơng pháp sắc ký mỏng đƣợc triển khai Bailey,