Nghiên cứu định lượng các vitamin b2, c và e trong nấm lớn ở vùng bắc trung bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng anhAA Axit L - ascorbic Acid ascorbic AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thống Association of Official Analytical Chemists DHAA Axit dehydro

NGUYỄN THỊ NGỌC MAI

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CÁC VITAMIN B2, C VÀ E TRONG NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH

NGHỆ AN - 2014

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN ĐÌNH THẮNG

NGHỆ AN - 2014

hành thí nghiệm - Trường Đại Học.

Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Phó Giáo sư - Tiến sĩ Trần Đình Thắng, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Th.S Hoàng Văn Trung – Khoa Hóa Học – Trường Đại học Vinh đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi hoàn thành luận văn

Tác giả xin chân thành cảm ơn Hội đồng khoa học – khoa Hóa trường Đại học Vinh, các thầy giáo, cô giáo trực tiếp giảng dạy lớp cao học 20 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi làm nền tảng để thực hiện luận văn này.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu – Các phòng ban – Trung tâm thực hiện thí nghiệm trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học.

Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, cổ vũ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn!

Vinh, ngày tháng 10 năm 2014

Tác giả

Nguyễn Thị Ngọc Mai

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về nấm 3

1.1.1 Giới thiệu về nấm 3

1.1.2 Phân loại nấm 3

1.1.3 Tổng quan về vitamin trong nấm 4

1.1.4 Tầm quan trọng của nấm 5

1.2 Giới thiệu về vitamin – Vitamin B 2 , vitamin C và vitamin E 6

1.2.1.Giới thiệu về vitamin 6

1.2.2 Vitamin B2 8

1.2.2.1 Lịch sử 8

1.2.2.2 Cấu trúc của vitamin B2 8

1.2.2.3 Tính chất của vitamin B2 9

1.2.2.4 Chức năng của vitamin B2 11

1.2.2.5 Nhu cầu về vitamin B2 11

1.2.2.6 Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin B2 12

1.2.3 Vitamin C 13

1.2.3.1 Lịch sử 13

1.2.3.2 Cấu trúc vitamin C 14

1.2.3.3 Tính chất của vitamin C 15

1.2.3.4 Chức năng của vitamin C 16

1.2.3.5 Nhu cầu về vitamin C 17

1.2.3.6 Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin C 18

1.2.4 Vitamin E 20

1.2.4.1 Lịch sử 20

1.2.4.4 Chức năng của vitamin E 23

1.2.4.5 Nhu cầu về vitamin E 24

1.2.4.6 Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin E 24

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 25

1.3.1 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 25

1.3.1.1 Nguyên lý 25

1.3.1.2 Phân loại sắc ký 25

1.3.1.3 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 26

1.3.2 Hệ thống HPLC 30

1.3.3 Chọn điều kiện sắc ký 31

1.3.3.1 Lựa chọn pha động 31

1.3.3.2 Lựa chọn pha tĩnh 31

1.3.3.3 Detector 34

1.3.4 Tiến hành đo sắc ký 35

1.3.4.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 35

1.3.4.2 Chuẩn bị dung môi pha động 35

1.3.5 Định lượng bằng phương pháp HPLC 36

1.3.5.1 Các bước định lượng bằng phương pháp HPLC 36

1.3.5.2 Các phương pháp định lượng 36

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 38

2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 38

2.2 Hóa chất 38

2.3 Thực nghiệm 39

2.3.1 Hình mẫu 39

2.3.2 Vitamin B2 40

2.3.2.3 Cách tiến hành 41

2.3.2.4 Điều kiện sắc ký 42

2.3.3 Vitamin C 42

2.3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin C cho phép đo HPLC 42

2.3.3.2 Sơ đồ xử lý mẫu vitamin C 43

2.3.3.3 Cách tiến hành 43

2.3.3.4 Điều kiện sắc ký 44

2.3.4 Vitamin E 44

2.3.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin E cho phép đo HPLC 44

2.3.4.2 Sơ đồ xử lý mẫu vitamin E 45

2.3.4.3 Cách tiến hành 45

2.3.4.4 Điều kiện sắc ký 46

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 nghiên cứu định lượng vitamin B 2 47

3.1.1 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin B2 47

3.1.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 51

3.1.2.1 Giới hạn phát hiện LOD 51

3.1.2.2 Giới hạn định lượng LOQ 52

3.1.3 Xác định hàm lượng vitamin B2 trong nấm 52

3.1.4 Đánh giá phương pháp 53

3.1.4.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 53

3.1.4.2 Xác định độ thu hồi 55

3.1.5 Các sắc đồ của vitamin B2 trong phép đo HPLC 56

3.2 Nghiên cứu định lượng vitamin C 58

pháp phân tích 60

3.2.2.1 Giới hạn phát hiện LOD 60

3.2.2.2 Giới hạn định lượng LOQ 61

3.3.3 Xác định hàm lượng vitamin C trong nấm 61

3.2.4 Đánh giá phương pháp 62

3.2.4.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 62

3.2.4.2 Xác định độ thu hồi 65

3.2.5 Các sắc đồ của vitamin C trong phép đo HPLC 66

3.3 Nghiên cứu định lượng vitamin E 68

3.3.1 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin E 68

3.3.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 71

3.3.2.1 Giới hạn phát hiện LOD 71

3.3.2.2 Giới hạn định lượng LOQ 72

3.3.3 Xác định hàm lượng vitamin Etrong nấm 72

3.3.4 Đánh giá phương pháp 73

3.3.4.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 73

3.3.4.2 Xác định độ thu hồi 75

3.3.5 Các sắc đồ của vitamin E trong phép đo HPLC 76

KẾT LUẬN 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng anh

AA Axit L - ascorbic Acid ascorbic

AOAC Hiệp hội các nhà phân tích

hóa học chính thống

Association of Official Analytical Chemists

DHAA Axit dehydro - L - ascorbic Acid dehydro ascorbic

IAA Axit isoascorbic Acid isoascorbic

FAD Riboflavin

-5’-adenosydiphotphat

Flavin adenine dinucleotide

FLD Detector huỳnh quang Fluorescence detector

FMN Riboflavin-5’-photphat Flavin mononucleotide

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid

chromatographyLOD Giới hạn phát hiện Limit of detection

LOQ Giới hạn định lượng Limit of quantitation

MW Trọng lượng phân tử Molecular weight

NP-HPLC Sắc ký hấp phụ pha thường Normal phase – High performance

liquid chromatographyRDA Khuyến nghị chế độ ăn

uống

Recommended dietary allowance

RP-HPLC Sắc ký hấp phụ pha đảo Reversed phase – High performance

liquid chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 1.1: Vitamin và khoáng chất chính 4Bảng 1.2: Hàm lượng vitamin B2 trong thực phẩm 12

Bảng 1.5: Tổng hàm lượng vitamin C trong một số loại rau và trái cây 20

Bảng 1.6: Danh pháp của một vài α-tocopherol 22

Bảng 3.1: Diện tích của vitamin B2 tương ứng với từng nồng độ chuẩn 50

Bảng 3.2: Nồng độ chuẩn của vitamin B2 qua 3 lần đo 51

Bảng 3.3: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin B2 trong nấm 53

Bảng 3.4 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên các mẫu nấm 54

Bảng 3.5 Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ 56

Bảng 3.6: Diện tích của vitamin C tương ứng với từng nồng độ chuẩn 60

Bảng 3.7: Nồng độ chuẩn của vitamin C qua 3 lần đo 61

Bảng 3.8: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong nấm 62

Bảng 3.9 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên các mẫu nấm 63

Bảng 3.10 Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm 01 65

Bảng 3.11: Diện tích của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn 70

Bảng 3.12: Nồng độ chuẩn của vitamin E qua 3 lần đo 72

Bảng 3.13: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm 73

Bảng 3.14 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên các mẫu nấm 74

Bảng 3.15 Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ 76

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Cấu trúc của riboflavin, FMN và FAD 9 Hình 1.2: Sản phẩm thoái quang của riboflavin trong môi trường có tính

Hình 1.4: Cấu trúc hóa lập thể của tocol và tocotrienol 21

Hình 1.5: Pic sắc ký và thời gian lưu 27

Hình 1.6: Hệ thống máy sắc ký HPLC agilent 1100 30

Hình 2.1: Mẫu Nấm 01 40

Hình 2.2: Mẫu Nấm lỗ 40

Hình 2.3: Mẫu nấm TH04 40

Hình 2.4: Mẫu HKG 406 40

Hình 2.5: Mẫu nấm HKG 401 40

Hình 3.1: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,1ppm 47

Hình 3.2: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,2ppm 47

Hình 3.3: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,5ppm 48

Hình 3.4: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 10ppm 48

Hình 3.5: Sắ5c đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 20ppm 49

Hình 3.6: Sắc đồ chuẩn vitamin B2 có nồng độ 50ppm 49

Hình 3.7: Đường chuẩn vitamin B2 50

Hình 3.8: Sắc đồ mẫu nấm HKG 406 56

Hình 3.9: Sắc đồ mẫu nấm HKG 401 57

Hình 3.10: Sắc đồ mẫu nấm TH04 57

Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm 58

Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 10ppm 58

Hình 3.13: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 20ppm 59

Hình 3.14: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 50ppm 59

Hình 3.15: Đường chuẩn vitamin C 60

Hình 3.16: Sắc đồ của nấm linh HKG 406 66

Hình 3.17: Sắc đồ của nấm 01 không thêm chuẩn 66

Hình 3.20: Sắc đồ của nấm lỗ 68

Hình 3.21: Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E có nồng độ 4ppm 68

Hình 3.22: Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E có nồng độ 10ppm 69

Hình 3.23: Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E có nồng độ 20ppm 69

Hình 3.24: Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E có nồng độ 40ppm 70

Hình 3.25: Đường chuẩn vitamin E 71

Hình 3.26: Sắc đồ mẫu nấm 01 76

Hình 3.27: Sắc đồ mẫu nấm HKG 401 77

Hình 3.28: Sắc đồ mẫu nấm lỗ không thêm chuẩn 77

Hình 3.29: Sắc đồ mẫu nấm lỗ thêm chuẩn 78

Trong ba thập kỷ qua, việc nghiên cứu về nấm đã được chứng minh cáckết quả có lợi của nó và đã được theo sau bởi sự phát triển nhanh chóng củacác doanh nghiệp sản xuất kinh doanh với thương mại trồng nấm [24], [28].Nhiều loài nấm được ứng dụng trong công nghệ dược phẩm, là nguồn nguyênliệu để điều chế các hoạt chất điều trị bệnh lao, gan, tiết niệu, tim mạch, ungthư, AIDS.

Nấm có ý nghĩa quan trọng trong đời sống con người, chúng là nguồnthực phẩm giàu chất dinh dưỡng, là nguồn thức ăn quý giá được nhân dân ưachuộng, chứa nhiều protein, các chất khoáng, vitamin (A, B, C, D, E…) vàmột lượng lớn axit amin thiết yếu

Vitamin là một nhóm các hợp chất hóa học khác nhau nhưng có mộtđiểm chung duy nhất là một lượng nhỏ chúng cần thiết cho các hoạt độngbình thường và duy trình sự trao đổi chất của cơ thể [29] Vitamin là nhữngchất mà cơ thể con người không thể tổng hợp được Phần lớn phải đưa từngoài vào bằng con đường ăn, uống Nhu cầu vitamin hàng ngày của cơ thểrất ít, nhưng nếu thiếu sẽ gây ra những rối loạn trầm trọng, gây ra một số bệnh

và nếu kéo dài có thể chết Vì thế việc bảo vệ vitamin trong quá trình chế biến

và bảo quản thực phẩm là rất cần thiết Hiện tượng mất vitamin có thể xuấthiện do các phản ứng hóa học gây mất hoạt tính vitamin, do bị tách ra hay rò

rỉ khỏi thực phẩm như các vitamin tan trong nước bị mất trong quá trình nấu,chần thực phẩm [30].

Nói chung, nhu cầu vitamin của cơ thể thường được đảm bảo nhờ chế

độ ăn uống cân bằng Thiếu vitamin gây nên bệnh hypovitaminosis, thừavitamin gây nên bệnh avitaminosis [19] Cả hai trường hợp bệnh đều donguyên nhân ăn uống không phù hợp, do các rối loạn hấp thu, do căng thẳnghoặc bệnh tật Vì vậy việc nghiên cứu định lượng các vitamin trong nấmnhằm mục đích xác định hàm lượng vitamin trong nấm có ý nghĩa khoa học

và thực tiễn cao đối với sức khỏe con người Vitamin có ý nghĩa to lớn vớingành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và rất cần thiết đối với con người

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng

các vitamin B 2 , C và E trong nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”.

Để thực hiện đề tài chúng tôi thực hiện những nhiệm vụ đặt ra sau:

- Tổng quan về các vitamin B2, C, E và phương pháp xác định cácvitamin B2, C, E

- Xây dựng đường chuẩn của vitamin B2, C, E

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) củaphương pháp

- Định lượng các vitamin B2, C và Ebằng phương pháp HPLC

- Xác định hiệu suất thu hồi

mũ, hoặc tất cả nấm thịt lớn Một cách sử dụng hạn chế hơn chỉ bao gồmnhững loại nấm lớn đó là có thể ăn được hoặc có giá trị chữa bệnh Nấm đượcđịnh nghĩa theo nghĩa rộng như sau: “Nấm là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ

mà có thể là mọc trên mặt đất hoặc dưới đất và đủ lớn để thấy được bằng mắtthường và được thu hoạch bằng tay” (Chang và Miles, 1992) Theo địnhnghĩa này, nấm không cần phải là lớp nấm đảm, hoặc trên không, hoặc có thịt,hoặc ăn được Nấm có thể là lớp nấm túi hay nấm nang, mọc từ dưới lên, cómột kết cấu không nhiều thịt và không nhất thiết ăn được Định nghĩa nàykhông phải là hoàn hảo nhưng có thể chấp nhận được, nhưng có thể dùng đểđánh giá số lượng nấm trên trái đất [26]

1.1.2 Phân loại nấm

Nấm là một giới riêng biệt khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tảđược 69.000 loài, sống khắp nơi trên trái đất từ hốc tường đến thực vật, độngvật và con người: bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn Nấm làcác sinh vật có nhân thực (được xếp vào nhóm eukaryote) có vách tế bào baobọc bên ngoài thường chứa chitin polysaccharit, chất béo và protein Nấmkhông có chất diệp lục và do đó không thể thực hiện quá trình quang hợp Do

đó, nấm phải hấp thu chất dinh dưỡng từ các nguồn khác nhau Nấm sinh sảnhữu tính hoặc vô tính và có bộ máy sinh dưỡng thường là dạng sợi có cấu trúcphân nhánh gọi là sợi nấm [27]

1.1.3 Tổng quan về vitamin trong nấm

Nấm là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng lớn nhất thế giới chưa được khaithác Nấm rất giàu protein, khoáng chất, vitamin, chất xơ và các axit aminthiết yếu Nấm là một trong những nguồn giàu vitamin đặc biệt là vitamin B.Nấm có chứa một lượng lớn các vitamin như Thiamin 1,4-2,2mg (%),Riboflavin 6,7-9,0mg (%), Niacin 60,6-73,3mg (%), Biotin, axit ascorbic 92-144mg (%), axit plantothenic 21,1 – 33,3mg (%) và axit folic 1,2 – 1,4mg/100g trọng lượng khô [34] Ví dụ, về hàm lượng của thiamin, niacin,riboflavin của một số nấm trong mg/100g trọng lượng nấm khô Hàm lượngthiamin dao động từ 0,35mg trong nấm rơm; 1,14mg trong nấm mỡ; 3,49mgtrong nấm linh chi; đến 1,16 đến 4,80 trong nấm sò; đến 7,8g trong nấmhương Hàm lượng niacin thay đổi từ; 54,9mg trong nấm hương, đến 55,7mgtrong nấm mỡ; 61,9mg trong nấm linh chi, đến 64,88mg trong nấm rơm, từ46,0 đến 108,7mg trong nấm sò Hàm lượng riboflavin trong nấm mỡ (5,0mg)

và nấm hương (4,9mg) hơn là nấm rơm (1,63 đến 2,98mg) và 17,2mg trongnấm linh chi [27]

Bảng 1.1: Vitamin và khoáng chất chính [34]

Vitamin và khoáng

chất chính Nhu cầu hàng ngày

Hàm lượng nấm

Thiamin (B1) 1,4mg 4,8-8,9mg

Ribiflavin (B2) 1,5mg 3,7-4,7mg

Niacin 18,2mg 42-108mgPhotpho 450mg 708-1348mgSắt 9mg 15-17mgCanxi 450mg 33-199mgĐồng 2mg 12-22mg

1.1.4 Tầm quan trọng của nấm

Nấm rất đóng vai trò quan trọng đối với cuộc sống của con người baogồm y học, thực phẩm, nông nghiệp [1].

Nấm là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Nấm ăn có hàmlượng protein rất cao chỉ sau cá, thịt Tổng lượng axit amin của nấm tới 15 -40% là các axit amin không thể thay thế, 25 - 35% là các axit amin tự do.Lượng chất béo trong nấm rất thấp, khoảng 15 – 20% [10] Đặc biệt trongnấm rất giàu các khoáng chất, vitamin (A, B, C, D, E…) Nấm ăn không cócác độc tố nên có thể coi nấm ăn như một loại “rau sạch” và “thịt sạch” giàuchất dinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe Nấm ăn còn là nguồn nguyên liệu đểchế biến các món ăn chay, ăn kiêng [1]

Một ý nghĩa hết sức quan trọng của nấm là làm thuốc chữa bệnh Trong

số 14.000 đến 15.000 loài nấm trên thế giới, có khoảng 700 loài nấm có tínhchất y dược, nhưng dự kiến có khoảng 1800 loài nấm dược liệu có tiềm năng[27] Hầu hết tất cả nấm có chứa polysaccarit trong màng tế bào của chúng,một số loài nấm được phát hiện có chứa polysaccarit đặc biệt có hiệu quảtrong việc làm chậm sự tiến triển của bệnh ung thư, một số bệnh khác và làmgiảm tác dụng phụ của việc điều trị hóa trị và xạ trị [26] Nấm có hiệu quảtrong việc chống lại bệnh ung thư, giảm cholesterol, căng thẳng, mất ngủ, hensuyễn, dị ứng và bệnh tiểu đường (1983) [25]

Nấm đóng vai trò quan trọng đối với nghề trồng rừng Nấm giúp chothực vật lấy được nước và muối khoáng còn thực vật cung cấp cho nấm thức

ăn hữu cơ Nhiều loài nấm có khả năng tạo rễ nấm được liệt vào loại nấm ănquý giá (nấm vua và nấm Tuber melanosporum) [6]

Phát triển nghề trồng nấm là góp phần tích cực giải quyết các phế thảitrong nông nghiệp, lâm nghiệp và công nghiệp trên cơ sở đó góp phần bảo vệmôi trường và xác lập cân bằng sinh thái cho môi trường sống của con người

1.2 Giới thiệu về vitamin – Vitamin B 2 , C và E

1.2.1 Giới thiệu về vitamin

a Khái niệm

Vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ, với lượng rất nhỏ, cần thiếtcho hoạt động bình thường của cơ thể con người Chúng có thể thay đổi chứcnăng hóa học, sinh lý và được phân bố rộng rãi trong các nguồn thức ăn tựnhiên [30]

b Phân loại

Mười ba vitamin được ghi nhận trong chế độ dinh dưỡng ở người vàchúng có thể được sắp xếp thành hai nhóm theo độ tan của chúng Cácvitamin tan trong chất béo được đại diện bởi vitamin A, D, E và K; và cũngbao gồm khoảng 50 carotenoid mà có mức độ hoạt động khác nhau củavitamin A Các vitamin tan trong nước bao gồm vitamin C và các thành viênnhóm vitamin B, cụ thể là thiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2),niacin, vitamin B6, axit pantothenic, folate và vitamin B12 Đây là cách phânloại đơn giản phản ánh hoạt tính sinh học của các vitamin, như độ hòa tan ảnhhưởng đến phương thức hấp thu đường ruột của chúng và hấp thu bởi các tếbào Các đặc tính về độ tan cũng liên quan đến việc phân bố các vitamin trongnhóm thực phẩm khác nhau và ảnh hưởng trực tiếp đến sử dụng phương phápphân tích [30]

c Hoạt tính sinh học của vitamin

Thuật ngữ “hoạt tính sinh học” áp dụng cho thực phẩm có các loạivitamin trong chế độ dinh dưỡng ở người, dùng để chỉ tỷ lệ số lượng vitamintrải qua sự hấp thụ của đường ruột và đi vào cơ thể Bao gồm cả sự vậnchuyển vitamin hấp thu đến các mô và tế bào Cuối cùng các vitamin có thểđược chuyển hóa thành một dạng có thể thực hiện một số chức năng sinh hóahoặc sinh lý, chuyển hóa sang một dạng không có chức năng cho sự bài tiết

và giự trữ Thành phần chính của hoạt tính sinh học và các yếu tố về tỷ lệ giới

hạn là sự hấp thụ Hoạt tính sinh học tương đối thường được thể hiện dướidạng tỷ lệ phần trăm của các phản ứng thu được với chất chuẩn có hoạt tínhsinh học cao [30]

Trong sự hấp thu đường ruột, hoạt tính sinh học của một vitamin phụthuộc vào dạng hóa học và trạng thái vật lý trong đó vitamin tồn tại ở trongthực phẩm Các tính chất này có thể bị ảnh hưởng bởi những tác động trongchế biến thực phẩm và nấu ăn, đặc biệt là trường hợp tiền vitamin A củacarotenoid, niacin, vitamin B6 và folate [30]

Thành phần trong chế độ ăn có thể làm chậm hoặc tăng cường sự hấpthụ của vitamin, do đó các thành phần trong chế độ ăn uống là một yếu tốquan trọng trong hoạt tính sinh học [30]

d Các yếu tố ảnh hưởng đến vitamin

Các yếu tố chính làm giảm lượng vitamin là quá trình oxi hóa, nhiệt(nhiệt độ và thời gian), bị ảnh hưởng do sự xúc tác của kim loại, độ pH, ảnhhưởng của enzym, độ ẩm, bức xạ (ánh sáng hoặc bức xạ ion hóa) và sự kếthợp đa dạng của các yếu tố Các vitamin tan trong nước dễ bị mất mát trongquá trình rửa, nhúng và nấu trong nước Vitamin C rất dễ bị oxi hóa bởi hóachất trong quá trình xử lý, bảo quản và nấu ăn Thiamin nhạy với thực phẩm

có tính trung hòa hoặc tính kiềm và không bền trong không khí Riboflavin rất

dễ bị phân hủy bởi ánh sáng Niacin và vitamin B6 ổn định với nhiều môitrường xử lý Vitamin A và vitamin E bị phá hủy trong điều kiện đẩy nhanhquá trình oxi hóa trong chất béo chưa bão hòa, ví dụ như: không khí, nhiệt độ,ánh sáng, ion kim loại vết và thời gian bảo quản Vitamin K ổn định với nhiệt,nhưng cực kỳ nhạy cảm với cả ánh sáng huỳnh quang và ánh sáng mặt trời.Vitamin D ít bị ảnh hưởng khi xử lý và bảo quản [30]

1.2.2 Vitamin B 2

1.2.2.1 Lịch sử

Riboflavin (vitamin B2) đã được tách ra từ men bia vào năm 1932tưởng như là enzyme vàng với chức năng hô hấp của tế bào Từ năm 1933đến năm 1935, đã xác định được cấu trúc và tổng hợp được vitamin B2 Cáccoenzyme, flavin mononucleotide (FMN) và flavin adenine dinucleotide(FAD) đã được xác định từ năm 1934 đến năm 1938 [39]

1.2.2.2 Cấu trúc của vitamin B 2

Tên IUPAC của riboflavin là 7,8-dimetyl-10-(1’-d-ribityl) isoalloxazin(C17H20N4O6, MW=376,4g/mol) Tên riboflavin có nguồn gốc từ nửa phân tử(ribol) là dạng khử riboza của đường pentoza và nửa vòng isoalloxazin(thường được gọi là vòng flavin) mà có màu vàng để oxi hóa các phân tử Cácdạng khử xảy ra trong quá trình trao đổi chất với dạng oxi hóa thường khôngmàu Khi thêm các nhóm photphat hoặc nhóm adennosy -5’-diphotphat ở các

vị trí bên ribityl sinh ra riboflavin-5’-photphat (FMN) và riboflavin-5’adenosydiphotphat (FAD) tương ứng Cấu trúc của các hợp chất này được mô

-tả trong hình 1.1 Các nhóm này có thể được loại bỏ khi thủy phân axit, được

sử dụng trong quy trình phân tích định lượng để giải phóng các dạng tự docủa tổng riboflavin [32]

Trong các tế bào sinh học, FAD ở mức độ nhỏ hơn FMN, FMN xuấthiện hầu hết như là một coenzym thay thế một lượng lớn của enzyme flavin(flavoprotein) Trọng lượng phân tử của FMN và FAD tương ứng là 514,4 g/mol và 865,6g/mol [30]

H H

OH

O P O

OH O

N N

N N

NH 2

FAD R=

FMN R= P

OH OH

O O

10 5

9

1 2 4 3

Hình 1.1: Cấu trúc của riboflavin, FMN và FAD

1.2.2.3 Tính chất của vitamin B 2

a Tính chất vật lý

Riboflavin (vitamin B2) có dạng kết tinh màu vàng với điểm nóng chảykhoảng 280oC Là hợp chất không mùi và có vị đắng khó chịu Trong dungdịch nước trung tính, riboflavin phát huỳnh quang mạnh có màu vàng - xanh.Riboflavin ít tan trong nước (10-13mg/100ml ở 25-27,5oC; 19mg/100ml ở

40oC; 230mg/100ml ở 100oC) và thậm chí ít tan trong etanol nguyên chất(4,5mg/100ml ở 27oC) Riboflavin tan trong axit hydrocloric loãng và kiềmloãng (nhưng không ổn định trong kiềm) Riboflavin không hòa tan trongaxeton, dietyl ete, hoặc clorofom Dung dịch nước bão hòa của riboflavin có

pH là 5,5-7,2 Các giá trị pKa tương ứng của riboflavin, FMN và FAD là 10,2,1,3 và 6,5 [30]

b Tính chất hóa học

Ở dạng tinh thể, riboflavin bền khi được giữ trong điều kiện khô Trongdung dịch, riboflavin bị phá hủy do tiếp xúc với cả bức xạ cực tím và ánhsáng nhìn thấy, tỷ lệ phá hủy ngày càng tăng khi tăng nhiệt độ và độ pH.Sattar và đồng nghiệp, kết luận rằng khoảng bước sóng từ 350-520nm nóichung gây hại cho riboflavin ở trong dung dịch nước, với bước sóng từ 415 -455nm gây phá hủy lớn Sản phẩm đối quang chính của vitamin B2 trong môitrường trung tính và axit là lumichrome (7,8 –dimetylalloxazine), trong khitrong môi trường kiềm sản phẩm chính là lumiflavin (7,8-trimetyllisoalloxazine) Hình 1.2 Cả hai sản phẩm đối quang không thể hiệnđược hoạt tính của vitamin B2 [30]

Anh sang Anh sang

Hình 1.2: Sản phẩm đối quang của riboflavin trong môi trường có tính bazơ

và axitNếu tránh ánh sáng, dung dịch nước của riboflavin có pH nằm trongkhoảng từ 2 đến 5 là chịu nóng đến 120oC, với pH ˃ 7 thì vòng isoalloxazine

là nhanh chóng bị phá hủy ở nhiệt độ cao Riboflavin ổn định khi được tối ưuhóa tại pH 3,5-4,0 Riboflavin là ổn định đối với oxi và nhiều tác nhân oxyhóa trong trường hợp không có ánh sáng [30]

1.2.2.4 Chức năng của vitamin B 2

Các coenzym, FMN và FAD là những vitamin hoạt động sinh lý Chứcnăng hóa sinh, hấp thu, chuyển hóa và sinh lý của riboflavin đang được xem xét

Sinh hóa, FMN và FAD đóng vai trò như yếu tố đồng thời… như nhữngnhóm liên kết giả liên kết hóa trị hoặc không có hóa trị liên kết với coenzymtrong một loạt các phản ứng oxy hóa khử sinh học, chẳng hạn như [32]:

- Chuyển đổi glucozo thành axit gluconic và hydrogen peroxit đượcxúc tác bởi glucozo oxidase

- Oxy hóa các axit α- amino thành axit keto được xúc tác bởi D- aminoaxit oxidase và L – amino axit oxidase

- Oxy hóa của NADH qua hệ sắc tố tế bào được xúc tác bởi khử sắc tố

tế bào

- Oxi hóa axit béo được xúc tác bởi acyl-coenzym A dehydrogenase

- Tổng hợp axit béo từ axetat

1.2.2.5 Nhu cầu về vitamin B 2

Theo tiêu chuẩn mới nhất của RDA do hội đồng thực phẩm và dinh

dưỡng khuyến cáo nam giới trưởng thành từ 19 - 50 tuổi nên tiêu thụ hàmlượng vitamin B2 là 1,3mg/ngày Phụ nữ trưởng thành từ 19 - 50 tuổi nên tiêuthụ 1,1mg/ngày Khuyến cáo đối với phụ nữ mang thai hàm lượng cần tănglên 1,4mg/ngày và đối với phụ nữ cho con bú là 1,6mg/ngày [33]

Thiếu riboflavin trong chế độ ăn ảnh hưởng đến mắt, bao gồm cả chứng

sợ ánh sáng, đục giác mạc và loét, đục thủy tinh thể trước lão hóa, nhiễmtrùng quanh giác mạc, giảm nước mắt, cũng như tổn thương da, đặc biệt xungquanh miệng, mũi và tai [35]

Nhưng chế độ ăn uống không đầy đủ không phải là nguyên nhân duynhất của sự thiếu hụt riboflavin Một số bất thường về nội tiết, như suy tuyến

thượng thận và hormon tuyến giáp, sử dụng thuốc và các loại bệnh có thể ảnhhưởng đáng kể đến việc sử dụng vitamin [33].

1.2.2.6 Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin B 2

Các flavin được phát hiện rất ít nhất, với số lượng nhỏ trong tất cả cácloại thực phẩm tự nhiên chưa qua chế biến Men chiết xuất là đặc biệt giàuvitamin B2, gan và thận cũng là nguồn thực phẩm phong phú có chứa vitamin

B2 Cám, lúa mì, trứng, thịt, sữa và pho mát là những nguồn thực phẩm quantrọng trong khẩu phần ăn [30]

Thực phẩm mg vitamin B 2 / 100g khẩu phần ăn

Sữa bò, nguyên chất, tiệt trùng 0,23

Gan cừu, chiên 5,65

Cá tuyết phi lê, sống 0,05

Khoai tây, vụ chính, già, sống 0,02

Đậu xanh, sấy khô, sống 0,24

Đậu đỏ, sấy khô, sống 0,19

Đậu hà lan, sống 0,02

Cải xanh, sống 0,06

Táo ăn, sống 0,02

Nước cam, không đường 0,02

Men chiết xuất 11,9

Kết quả quá trình xay xát ngũ cốc làm giảm đáng kể lượng vitamin B2

(tới 60%), việc làm giàu vitamin B2 ở bánh mì và ngũ cốc ăn liền vào bữasáng góp phần đáng kể cho việc cung cấp vitamin B2 từ chế độ ăn Hầu hết

hàm lượng flavin của gạo lứt được giữ nguyên, nếu gạo được hấp trước khixát Sữa bò chủ yếu chứa các vitamin B2 tự do, với một lượng nhỏ FMN vàFAD Trong sữa nguyên chất, 14% flavin có liên kết không hóa trị vớiprotein Lòng trắng và lòng đỏ trứng có chứ loại protein đặc biệt là vitamin

B2, cần thiết cho việc dự trữ vitamin B2 khi sử dụng phôi của trứng [30]

1.2.3 Vitamin C

1.2.3.1 Lịch sử

Năm 1747, James Lind là một bác sĩ hải quân Anh, tìm ra vai trò củatrái cây trong việc chữa bệnh scobut cho các thủy thủ Anh Phát minh củaông là đại diện cho cuộc thử nghiệm trong y học đầu tiên về chữa trị bệnhscobut, trái cây được coi là một loại thực phẩm chữa bệnh Về cơ bản, không

có phát minh nào mới hơn cho đến khi bệnh scobut đã được phát hiện trênchuột lang năm 1907 Một cuộc thí nghiệm động vật dựa trên phản ứng củachuột lang được phát triển vào năm 1917 để kiểm tra tác dụng của thuốc chữascobut từ thực phẩm Axit ascorbic đã được tách ra từ các nguồn thực phẩmtrong tự nhiên, được thể hiện qua các yếu tố và cấu trúc đặc trưng chống lạibệnh scobut bởi nhóm Szent-Gyorgi, Haworth và King đầu những năm 1930.Szent-Goyrgi và Haworth đã được trao giải Nobel cho nghiên cứu axitascorbic của họ vào năm 1937 [39]

1.2.3.2 Cấu trúc của vitamin C

Thuật ngữ vitamin C được sử dụng mô tả chung cho tất cả các hợp chất

có tính đặc trưng về hoạt độ sinh học của axit ascorbic Thuật ngữ L-ascorbic

và axit ascorbic có thể được sử dụng thay thế cho nhau Định danh theo hệthống hóa học của IUPAC là 2-oxo-L-threo-hexano-1,4-lactone-2,3-enediol(C6H8O6, MW=176,1g/mol) [32] Có hai cặp đồng phân đối quang, cụ thể làaxit L- ascorbic và axit D- ascorbic và axit L- isoascorbic và D- isoascorbic(Hình 1.3) Axit D-ascorbic và axit L-isoascorbic là vitamin C không có hoạt

độ và không xảy ra trong tự nhiên Axit D-isoascorbic (còn gọi là axiterythorbic) cũng không tìm thấy trong các sản phẩm tự nhiên, nhưng sự xuấthiện ở trong một số vi sinh vật Tuy nhiên, đó là sản phẩm phụ của sự tổng hợpsinh học vitamin C, được tổng hợp từ đường được kết hợp bởi chất hóa học và

vi sinh vật, đã được tìm ra trong bia sau khi bổ sung vitamin C trong côngnghiệp Axit erythorbic có tính khử tương tự như axit L-ascorbic, nhưng thuốcchữa bệnh scobut của axit L-ascorbic chỉ thể hiện 5% trong chuột bạch [30]

O H

OH OH

CH 2 OH HO

O

axit L-isoascorbic

chat dong phan doi anh

chat dong phan doi anh O

Hình 1.3: Chất đồng phân lập thể của 2-oxo-L-threo-hexano-1,4-lactone-2,3-enediol

Axit L-ascorbic là dễ dàng tạo phản ứng thuận nghịch và bị oxi hóathành axit dehyroascorbic, tạo thành các anion gốc ascorbyl trung gian (còngọi là semidehyroascorbate) (hình1.3) [30]

Trái cây và hoa quả là nguồn thực phẩm chứa nhiều vitamin C Trongthực phẩm, vitamin C tồn tại hai loại vitamin: axit L – ascorbic (AA) và sảnphẩm oxi hóa của nó là axit dehyro-L-ascorbic (DHAA) Vitamin C tổng làtổng của AA và DHAA Một đồng phân là axit isoascorbic (IAA) thườngđược thêm vào thực phẩm như là một chất chống oxi hóa Cả hai IAA và sản

phẩm oxi hóa IAA, axit dehydroisoascorbic (DHAA) có thể gây nhiễu việcxác định vitamin C tổng [35].

b Tính chất hóa học

Dung dịch nước bão hòa của axit ascorbic 5% có pH từ 2,2-2,5, bảnchất của nó có tính axit là do sự ion hóa các nhóm hydroxyl trên C-3 (pK1 =4,17); Nhóm hydroxyl trên C-2 có nhiều khả năng chống lại oxi hóa hơn (pK2

= 11,79) [30]

Phản ứng thoái biến của axit L-ascorbic trong dung dịch nước phụthuộc vào một số yêu tố như độ pH, nhiệt độ, có mặt của oxi hoặc kim loại.Nói chung, axit ascorbic không bền trong nước ở nhiệt độ phòng [33] Trongdung dịch, tính khử mạnh của vitamin có thể làm thay đổi oxi hóa nhanhchóng và quá mức thành axit dehydroascorbic Không thể đảo ngược thủyngược axit L-dehydroascobic tạo ra 2,3-diketo-gulonic có hoạt tính sinh học.Chất khử có thể chuyển hình thức dehydro thành L-ascorbic trong hệ thốngsinh học Enzym chuyển đổi của L-dehydroascobic từ axit ascobic bởi

glutathione dehydroganes là một chất bảo vệ quan trọng chống lại sự oxi hóa.Axit ascobic có thể bị oxi hóa thông qua sự khử một hoặc hai electron Khửmột electron là quá trình chuyển hóa thông qua các axit L-ascorbic gốc tự do(axit semihydroascorbic hoặc axit monodehydroascorbic) Một electron đượcchuyển cho các gốc tự do từ ascorbate sản xuất ra một gốc ascorbate có tácdụng như một chất oxi hóa khử Khử hai electron xảy ra khi kim loại chuyểntiếp xúc tác với quá trình oxi hóa axit L-ascorbic Là một phức chất bậc babao giữa kim loại, axit L-ascorbic và oxy thông qua kim loại chuyển tiếp Sau

đó phức chất tách rời tạo thành axit L-dehydroascorbic, hydrogen peroxit vàion kim loại [39]

1.2.3.4 Chức năng của vitamin C

Axit ascobic và axit dehydroascrobic có hoạt tính sinh học tương đương,trong khi axit iso ascrobic chỉ có 5% hoạt tính sinh học của AA Sự hấp thu và

sự trao đổi chất của vitamin C những năm gần đây đã được quan tâm

Một số vai trò sinh hóa của axit ascrobic trong cơ thể bao gồm:

- Tham gia như một yếu tố đồng thời trong một số phản ứng enzym,trong đó có sự tổng hợp colagen, carnitin, norepinephrin, trao đổi chấttrytophan, tyrosine, histamine và cholesterol, các amin hóa của neuropeptides

và phản ứng giải độc trong gan

- Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến việc chuyển hai electrongiữa ascorbat dehydroascorbat, nhường một electron để vô hiệu hóa cácgốc tự do có hoạt tính cao Ví dụ như: Bảo vệ vitamin E bằng cách giảmcác gốc tự do tocopheryl

- Ức chế các phản ứng bề mặt, bao gồm ức chế sự hình thành của chấtnitrosamine gây ung thư

- Điều tiết sự hấp thụ tiêu hóa khoáng chất bao gồm cả sắt

Vitamin C được biết đến với vai trò của nó trong việc phòng chốngbệnh scobut Nonvitamin với chức năng nâng cao sức khỏe vẫn còn đangđược nghiên cứu và gây tranh cãi Chúng bao gồm điểu chỉnh sự tăng huyết

áp, bệnh tim thiếu máu, ung thư, đục thủy tinh thể, phản ứng miễn dịch vàcảm lạnh thông thường [35]

1.2.3.5 Nhu cầu về vitamin C

Theo tiêu chuẩn RDA năm 2000, đối với phụ nữ trưởng thành nên dùngvitamin C là 7,5mg/ngày, đối với nam giới trưởng thành nên dùng90mg/ngày Theo cuộc điều tra về khảo sát sức khỏe và dinh dưỡng quốc gia

từ 1976 – 1980, cho thấy tình trạng thiếu vitamin C dao động từ 0,1% ở trẻ

em (3-5 tuổi) đến 3% ở phụ nữ (25-44 tuổi) và 7 % ở nam giới (45-64 tuổi).Sau mười năm, tình trạng thiếu vitamin C đối với phụ nữ lớn tuổi là 12% và17% đối với nam giới [33]

Bệnh scobut là tên bệnh do cơ thể thiếu vitamin C Giống như thiếu cácdinh dưỡng khác, bệnh scobut đã được công nhận từ lâu trước khi các nghiêncứu về thành phần dinh dưỡng được biết và hiểu rõ

Olson đã phân loại triệu chứng bệnh scobut về cơ thể, xuất huyết, tâm

lý, kích thích bài tiết, huyết học và các mô liên kết có liên quan Thiếuvitamin C ở mức độ thấp có thể dẫn đến mệt mỏi và khó chịu Các triệuchứng sẽ được mô tả đầy đủ trong bảng 1.3 [39]

Bảng 1.3: Các dấu hiệu thiếu axit ascorbic [39]

Triệu chứng

Cơ thể Mệt mỏi, uể oải

Xuất huyết Xuất huyết màng mỏng

Xuất hiện các nốt đỏ trên daChảy máu chân răng

Tâm lý Khủng hoảng

Hoang tưởng

Rối loạn thần kinhKích thích bài tiết Khô Da

Khô mắtKhô miệngMạch không ổn định Thần kinh dinh dưỡng chuyển hóa amin bị thay đổiHuyết học Suy giảm sự hấp thu sắt

Suy giảm sự trao đổi axit folic

Mô liên kết Viêm khớp scobut

Khả năng chữa lành vết thương bị giảm

1.2.3.6 Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin C

Biến dị di chuyền, sự trưởng thành, khí hậu, ánh sáng mặt trời,phương pháp thu hoạch và lưu trữ tất cả đều có thể ảnh hưởng đến hàmlượng vitamin C [30]

Trái cây tươi (đặc biệt quả họ cam) và các loại rau xanh tạo nguồnvitamin C phong phú Gan (có chứa 10-40mg/100g), thận và tim là nhữngnguồn tốt, nhưng các loại thịt bắp và các loại ngũ cốc không chứa vitamin.Sữa mẹ cung cấp đầy đủ axit ascorbic để ngăn ngừa bệnh scobut ở trẻ sơ sinh,nhưng các sản phẩm từ sữa bò lại là một nguồn chứa ít vitamin C bị mất mát

do quá trình oxi hóa trong chế biến Bắp cải và những loại bắp cải khác cóchứa một dạng khác của axit ascorbic được biết như ascorbigen, chiếmkhoảng 15-20% hoạt tính sinh học ở chuột lang [30]

Bảng 1.4: Hàm lượng vitamin C trong một số loại rau và quả [30]

Tươi, sống 42.3 ± 3.4 - 42 ± 3

Đã nấu 24.4 ± 1.6 - 24 ± 2Xúp lơ, tươi, sống 54.0 ± 1.0 8.7 ± 0.6 63 ± 1Rau dền

Tươi, sống 52.4 ± 2.5 - 52 ± 3

Đã nấu 19.6 ± 1.0 - 20 ± 1

Vi sóng (4 phút) 48.3 ± 3.7 5.8 ± 0.6 54 ± 4Khoai tây

Sống 8.0 ± 0.0 3.0 ± 0.0 11 ± 0

Đã nấu 7.0 ± 1.0 1.3 ± 0.6 9 ± 1

Cà chua, tươi 10.6 ± 0.6 3.0 ± 0.0 14 ± 1Chuối 15.3 ± 2.5 3.3 ± 0.6 19 ± 3Quả nho, tươi 21.3 ± 0.6 2.3 ± 0.6 24 ± 1Cam

Vùng Florida 54.7 ± 2.5 8.3 ± 1.2 63 ± 3Vùng California 75 ± 4.5 8.2 ± 1.6 83 ± 5

Bảng 1.5: Tổng hàm lượng vitamin C trong một số loại rau và trái cây

Mẫu Tổng hàm lượng vitamin C

(AA+DHAA) (mg/100ml)Cải bông, sống 97 – 163

Bắp cải, sống 42 – 83Rau dền, tươi 25 – 70Khoai tây, 11 – 13

Cà chua 14 – 19Chuối 12 – 19Nho, đỏ 21 – 31

1.2.4 Vitamin E

1.2.4.1 Lịch sử

Sự tồn tại của vitamin E được phát hiện ra lần đầu tiên thông qua sựnghiên cứu sinh sản của động vật trong những năm đầu thế kỷ XX Vitaminđược mô tả như là một yếu tố dinh dưỡng tan trong chất béo, “yếu tố X”, cầnthiết cho sự sinh sản và ngăn ngừa tử vong thai nhi bởi Evans và Bishop vàonăm 1922 Sau đó nó được gọi là yếu tố chống vô sinh, với tên gọi là vitamin

E, và phát hiện ra vitamin E liên quan chặt chẽ với vitamin D Vitamin E tocopherol, α-T) được tách ra từ dầu của mầm lúa mì bởi nhóm nghiên cứucủa Evans (1936) Những nhà nghiên cứu gọi vitamin E (tocopherol) theocụm từ của tiếng Hy Lạp ferein có nghĩa là “mang” và tocos có nghĩa là “sinhcon”, do đó bản bản chất của vitamin E làm cho cơ thể được trẻ hóa [39]

(α-1.2.4.2 Cấu trúc của vitamin E

Vitamin E là dẫn xuất thay thế methyl của protocol, trong đó bao gồmvòng chroman-6-ol gắn ở C-2 từ chuỗi bên isoprenoit bão hòa Tocotrienols lànhững cấu trúc tương tự mà bên chuỗi chứa ba liên kết trans Trong tự nhiên,

có bốn tocopherols và bốn tocotrienols tương ứng; chúng được chỉ định làalpha – (α), beta-(β), gamma-(γ),và delta-(δ) theo số lượng và vị trí củathemethyl nhóm thế trong vòng chromanol (Hình 1.4) Dạng β- và γ- là các

đồng phân vị trí Các phân tử chứa ba tocopherol trung tâm bất đối ở 2,

C-4’, C-8’, và có tám lập thể Tocotrienols chỉ sở hữu trung tâm bất đối ở C-2

Hệ thống danh pháp RS của một số α-tocopherol được đưa ra trongbảng 1.6 Những hoạt tính sinh học vitamer xảy ra tự nhiên nhất là RRR-α-tocopherol (C29H50O2, MW=430,7g/mol) Tổng hợp hoàn toàn α-tocopherolđược điều chế bằng cách ngưng tụ trimetylhydroquinon với tổng hợp phytolhoặc isophytol Kết quả của phương pháp tổng hợp trong tất cả racemic 2RS,

4’RS, 8’RS-α-tocopherol (all-rac-α-tocopherol), mà hỗn hợp của tất cả támchất đồng phân không đối quang có thể có tỉ lệ gần như nhau Bốn cặp đồngphân đối quang là RRR/SSS, RRS/SSR, RSS/SRR và RSR/SRS [30]

O

HO

CH3

1' 1

3 2

4 5

8

6

7

2' 3'

4' 5' 6' 7'

8' 9' 10' 11' 12'

Tocopherol và Tocotrienol 5,6,7-Trimetyl α 5,8-Dimetyl β 7,8-Dimetyl γ 8-Metyl δ

Hình 1.4: Cấu trúc hóa lập thể của tocolpherol và Tocotrienol: a) RRR-Tocol

và b) 2R,3’-trans,7’-trans-tocotrienol

Bảng 1.6: Danh pháp của một vài α-tocopherol [30]

2R,4’R,8’R RRR-α-Tocopherol d-α-Tocopherol Là đồng phân

duy nhất của Tocopherol cótrong tự nhiên.2S,4’R,8’R

l-α-Tocopheroldl-α-Tocopherol

Epimer C-2 củadạng RRR từtổng hợp hoàntoàn (điều chế từphytol hoặcisophytol)

1.2.4.3 Tính chất của vitamin E

a Tính chất vật lý

Ở trạng thái tinh khiết, vitamin E là màu vàng nhạt, gần như khôngmùi, sánh như dầu, sẫm màu khi tiếp xúc với không khí α-Tocopheryl acetatcũng có vẻ bên ngoài tương tự Hydro succinat este là dạng bột màu trắng

Vitamin E không bị este hóa, không hòa tan trong nước và dễ dàng hòatan trong etanol, dung môi hữu cơ khác (bao gồm cả axeton, clorofom và ete)

và trong các loại dầu thực vật Các axetat vitamin E ít bị hòa tan trong etanolhơn vitamin không bị este hóa [30]

b Tính chất hóa học

Vitamin E bị phá hủy khá nhanh bởi ánh sáng mặt trời và ánh sángnhân tạo có bước sóng trong vùng UV Các vitamin bị oxi hóa bởi oxi trongkhông khí để chủ yếu tạo thành quinon không có chức năng hoạt động về mặtsinh học Quá trình oxy hóa được tăng lên bởi ánh sáng, nhiệt, tính kiềm và

một số kim loại vết Sự có mặt của axit ascorbic hoàn toàn ngăn chặn bởi tácdụng xúc tác của sắt (III) và đồng (II) vào quá trình oxi hóa bằng cách duy trìcác kim loại của chúng ở trạng thái oxi hóa thấp Các tocotrienol chưa bãohòa nhờ chuỗi bên của chúng, dễ bị phá hủy hơn so với tocopherol Cácvitamin có thể chịu được nhiệt trong dung dịch axit hoặc kiềm với điều kiệnoxi và tia cực tím được loại bỏ Bởi vì α-tocopheryl axetat thiếu nhómhidroxyl để phản ứng, không khí và ánh sáng trên thực tế là không có tácdụng phá hủy [30].

1.2.4.4 Chức năng của vitamin E

Vitamin E là một chất chống oxi hóa tốt Một số nghiên cứu đã báo cáorằng vitamin E có thể làm giảm nguy cơ rủi ro về các bệnh mãn tính Chấtchống oxi hóa kết hợp vitamin E và vitamin C làm chậm sự phát triển của xơ

vỡ động mạch và ở những người cấy ghép tim Nghiên cứu viện dịch tễ họccho thấy vai trò có lợi của vitamin E trong việc giảm nguy cơ gây ra bệnh timmạch, xơ vỡ động mạch, ung thư và hình thành đục thủy tinh thể [33]

Vitamin E ảnh hưởng đến quá trình sinh sản của động vật, giúp đảmbảo chức năng của nhiều mô và cơ quan Vitamin E làm tăng tác dụng củaprotein và vitamin A, ngoài ra nó còn có tác dụng ngăn cản các axit béo chưa

no bị oxi hóa [20]

α-Tocopherol (không este hóa) thường được sử dụng như một chấtchống oxi hóa để ổn định mỡ động vật, trong đó hàm lượng vitamin E thấphơn nhiều so với dầu thực vật Trong trường hợp không có chất chống oxyhóa, chất béo không bão hòa trải qua sự tự oxi hóa để sản xuất hydropeoxit

Sự phân hủy có thể tạo ra một loạt các hợp chất dễ bay hơi như andehit vàxeton, tạo ra mùi khó chịu và ôi [30] Do tính chất chống oxi hóa mạnh nêntrong kỹ thuật dầu mỡ, vitamin E được dùng làm chất bảo vệ chất béo khỏi bịoxi hóa và tránh hiện tượng ôi hóa [20]

1.2.4.5 Nhu cầu về vitamin E

Theo RDA (2000) hàm lượng vitamin E đối với người lớn (cả nam và

nữ từ 19 tuổi) là 15mg/ngày, đối với trẻ sơ sinh từ 0-6 tháng là 4mg/ngày vàtrẻ sơ sinh từ 7-12 tháng là 6mg/ngày, đối với trẻ nhỏ từ 1- 3 tuổi là 6mg/ngày

và trẻ từ 4-8 tuổi là 7mg/ngày [33]

Khi cơ thể có hàm lượng vitamin E thấp sẽ gây ra các bệnh lý do thiếuvitamin E Thiếu vitamin E gây ra bởi khuyết tật di truyền α-tocopherol thànhprotein, gây ra bởi khuyết tật di truyền trong sự tổng hợp Lipoprotein Thiếuvitamin E do hội chứng hấp thu chất béo kém Biểu hiện chính khi thiếuvitamin E là mất cân bằng tủy sống ở tiểu não, bệnh về cơ xương và nhiễmsắc tố võng mạc [33] Khi thiếu vitamin E, sự tạo phôi sẽ bị cản trở, đồng thờixảy ra sự thoái hóa cơ quan sinh sản, teo cơ, thoái hóa tủy sống và suy nhược

cơ thể [20]

1.2.4.6 Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin E

Các nguồn thực phẩm giàu vitamin E là những hạt ngũ cốc và nhữngloại hạt, đậu Các loại dầu thực vật chiết xuất từ thực vật là những nguồn giàuvitamin E Sản phẩm ngũ cốc nguyên hạt, cá, thịt, trứng, sản phẩm sữa và rauxanh cũng cung cấp một lượng vitamin E đáng kể [30]

Hầu hết rau và trái cây không thuộc vùng nhiệt đới thường chứa rất ítα- tocopherol 1mg/100g trọng lượng tươi, α-tocopherol là vitamin chiếm ưuthế hiện nay Loại rau lá xanh là một trong số các loại rau giàu nguồn vitamin

E Những lá cây chín xanh thẫm bên ngoài bắp cải, là thường bị loại bỏ, cóchứa nhiều vitamin E hơn những lá xanh nhạt mà được tiêu thụ Tim của bắpcải trắng và hoa súp lơ thực tế không chứa vitamin E Nghịch lý, Lá vàng khichúng bị mất các chất diệp lục có chứa nhiều α –tocopherol hơn những látươi Trong táo và lê, nồng độ của vitamin E trong vỏ lớn hơn trong cùi Táoxanh chứatocopherol hơn các loại táo đỏ hoặc vàng [30]

Nồng độ của vitamin E trong các tế bào động vật phụ thuộc vào hàmlượng vitamin trong chế độ ăn uống của động vật Trong bắp thịt sống, chất béo

và các bộ phận từ động vật có vú và các loài chim, hầu hết vitamin E là mộtdạng của α-tocopherol Hàm lượng α-tocopherol của động vật có vú nói chungthường ít hơn 1mg/100g Trong trứng, tất cả vitamin E ở trong lòng đỏ, nồng độkhác nhau rất nhiều tùy thuộc vào mức độ bổ sung α-tocopherol axetat (nếu có)

có trong thức ăn cho gà Cá là có nguồn vitamin E tốt hơn thịt [30]

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

1.3.1 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1.1 Nguyên lý

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và phađộng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiếnhành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha tĩnh vàpha động Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chấthóa học của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với phatĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau vàtách ra khỏi nhau [10]

+ Sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC): Đây là phương pháptách chất phân tích dựa trên sự phân cực NP-HPLC sử dụng pha tĩnh phâncực và pha động không phân cực Các chất phân tích phân cực tương tác vàđược giữ lại bởi pha tĩnh phân cực Sự hấp phụ tăng mạnh khi sự phân cựccủa chất phân tích tăng và có sự tương tác giữa các chất phân tích phân cựcvới pha tĩnh phân cực làm tăng thời gian rửa giải [36].

+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Có pha tĩnh không phâncực và pha động phân cực RP-HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc tương tác

kỵ nước, đó là kết quả của lực đẩy giữa dung môi phân cực với chất phân tíchkhông phân cực và pha tĩnh không phân cực Liên kết của các chất phân tích vớipha tĩnh tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc xung quanh đoạn phân tử củachất phân tích khi kết hợp với các phối tử trong dung môi nước [36]

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC): Sắc ký trao đổiion là dựa trên sự hấp dẫn giữa các ion chất tan và nơi điện tích liên kết giữapha tĩnh Ion mang điện tích bị loại bỏ Đây là dạng sắc ký được sử dụng rỗngrãi trong làm sạch nước, sắc ký trao đổi ligand, sắc ký trao đổi ion củaprotein, sắc ký trao đổi anion có pH cao của carbohydrat oligosaccarit… [36]

- Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC): là tách các hạt dựa trên cơ sở kíchthước Nó rất có lợi cho việc xác định cấu trúc bậc ba và cấu trúc bậc bốn củaprotein và axit amin Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi cho việc xác địnhkhối lượng phân của polisacarit [36]

1.3.1.3 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

a Thời gian lưu

Thời gian lưu (tR) là thời gian từ khi bơm mẫu vào cột đến khi xuất hiệnđiểm cực đại của pic Nếu thời gian lưu càng lớn thì chất đó lưu giữ càngmạnh và tốc độ di chuyển của nó càng chậm [11]

Hình 1.5: Pic sắc ký và thời gian lưuThời gian chết (tM) là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, đượctính từ khi bơm mẫu đến khi pha động đi qua cột.

Thời gian lưu hiệu chỉnh tR’= tR – tM

b Hệ số phân bố K

Trong quá trình sắc ký, khi một chất đang di chuyển trên cột và phân

bố giữa hai pha, nếu ta cho pha động dừng lại để phân bố đạt tới trạng tháicân bằng thì ta có:

Trong đó: CS; CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động

Nếu K càng lớn thì sự di chuyển chất cần tách qua pha tĩnh càng chậm,hỗn hợp các chất cần tách có giá trị K khác nhau càng nhiều thì khả năng táchdiễn ra càng dễ Hệ số K phụ thuộc vào bản chất hai pha, bản chất của chấtphân tích, nhiệt độ [11]

c Hệ số dung lượng K’

Hệ số dung lượng K’ còn gọi là thừa số dung lượng hay hệ số phân bốkhối lượng Hệ số dung lượng K’ là một đại lượng quan trọng được dùng rộngrãi để mô tả tốc độ di chuyển của một chất

1 quá trình rửa giải thường diễn ra quá nhanh, các pic sẽ xuất hiện quá sớm và

dễ lẫn với các pic của tạp chất Nếu K’ >> 5 thời gian phân tích thường kéodài [11]

ra khỏi nhau thì giá trị α dao động trong khoảng 1,05÷2 [11]

e Hiệu lực cột và đĩa lý thuyết

Hiệu lực cột tách được đặc trưng bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết N

và Chiều cao tương đương của đĩa lý thuyết H [11]

Giả sử cột sắc ký có chiều dài là L, chia thành N đĩa, mỗi đĩa có chiềucao H Công thức tính số đĩa lý thuyết:

H=(t R

μ C)2

Trong đó: tR là thời gian lưu

µC là độ lệch chuẩn ứng với độ rộng của pic

Hiệu lực cột tách càng cao khi cột sắc ký có số đĩa (N) càng lớn vàchiều cao tương đương của đĩa lý thuyết H càng nhỏ.

Trong thực tế phân tích chiều cao tương đương của đĩa lý thuyếtthường từ 0,1 – 1mm

* Mối liên hệ giữa độ rộng (W) với độ lệch chuẩn µC của pic sắc ký.Trường hợp 1: Nếu độ rộng được tính là khoảng cách giữa 2 điểm uốn trênđường cong

Ta thấy nếu hai pic cùng cỡ thì:

RS = 0,75 Hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều

RS = 1,0 Hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

RS = 1,5 Hai pic tách hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau 0,3%

Nếu hai pic có độ lớn khác nhau càng nhiều thì RS càng lớn hơn nữamới tách được tốt