Nghiên cứu định lượng Isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột

Chuơng 1.TỔNG QUAN.......................................................................................31.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM........................................31.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới.........................................................31.1.2. Tình hình bệnh lao tại Việt Nam.......................................................51.1.3.Phác đồ điều trị lao.............................................................................61.2.TỔNG QUAN VỀ ISONIAZID.......................................................................71.2.1.Tác dụng sinh học ..............................................................................71.2.2.Tính chất hóa lý..................................................................................81.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid ...........................................101.3.VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO..........................................121.3.1.Khái niệm.........................................................................................121.3.2.Một số thông số đặc trưng................................................................131.3.3.Các phương pháp định lượng bằng HPLC.......................................161.4.VÀI NÉT VỀ TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP................................................171.4.1.Một số khái niệm..............................................................................171.4.2.Các phương pháp tối ưu hoá ............................................................181.5.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG DỊCH SINH HỌC...............191.5.1.Khái niệm.........................................................................................191.5.2.Nội dung thẩm định..........................................................................20Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Thị Kiều Anh – phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội và TS.Phạm Thị Thanh Hà – bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở Phòng đào tạo sau đại học, Bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Dược trường Đại học Y Dược Huế đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say mê nghiên cứu khoa học. Hà Nội, tháng 12 năm 2009 Học viên Đào Thị Cẩm Minh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chuơng 1 TỔNG QUAN 1.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3 1.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới 1.1.2. Tình hình bệnh lao tại Việt Nam 1.1.3.Phác đồ điều trị lao 1.2.TỔNG QUAN VỀ ISONIAZID 7 1.2.1.Tác dụng sinh học 1.2.2.Tính chất hóa lý 1.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid 1.3.VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 12 1.3.1.Khái niệm 1.3.2.Một số thông số đặc trưng 1.3.3.Các phương pháp định lượng bằng HPLC 1.4.VÀI NÉT VỀ TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP 16 1.4.1.Một số khái niệm 1.4.2.Các phương pháp tối ưu hoá 1.5.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG DỊCH SINH HỌC 19 1.5.1.Khái niệm 1.5.2.Nội dung thẩm định Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.NGUYÊN – VẬT LIỆU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 22 2.1.1.Hoá chất 2.1.2.Thiết bị 2.2.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22 2.2.1.Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 2.2.2.Trong xác định nồng độ INH trong dịch sinh học của bệnh nhân lao uống thuốc có chứa INH 2.3.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.4.1.Xây dựng và tối ưu hóa quá trình tạo dẫn chất trong phương pháp phân tích 2.4.2.Thẩm định phương pháp 2.4.3.Định lượng INH trong dịch sinh học Chương 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1.KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TẠO DẪN CHẤT TRONG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 29 3.1.1.Khảo sát điều kiện sắc ký 3.1.2.Xây dựng qui trình dẫn chất hoá 3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 38 3.2.1.Tính chọn lọc Tiến hành như mục 2.4.2, kết quả sắc ký đồ của dịch sinh học trắng, dịch sinh học có thêm INH, và dịch sinh học có thêm INH, PZA, RMP được trình bày ở các hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 3.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính 3.2.3.Độ chính xác 3.2.4.Độ đúng 3.2.5.Độ tìm lại 3.2.6.Giới hạn định lượng (LOQ) 3.2.7.Độ ổn định 3.3.ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC CỦA BỆNH NHÂN LAO 47 3.3.1.Nồng độ INH trong huyết tương bệnh nhân 3.3.2.Nồng độ INH trong dịch màng phổi của bệnh nhân Chương 4 BÀN LUẬN 4.1.VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC 53 4.1.1.Về quá trình tạo dẫn chất hóa 4.1.2.Về xây dựng điều kiện sắc ký 4.1.3.Thẩm định phương pháp phân tích 4.2.VỀ ỨNG DỤNG 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFB : Trực khuẩn kháng cồn kháng acid CA : Cinamaldehyd CTCLQG : Chương trình chống lao quốc gia DOTS : Điều trị liệu ngắn ngày có kiểm sát FDA : Cục quản lý thuốc & thực phẩm Mỹ The United States Food and Drug Administration H 2 0 : Nước HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) INH : Isoniazid LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol PA : Tinh khiết phân tích PZA : Pyrazinamid RMP : Rifampicin Rs : Độ phân giải RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) S : Diện tích TCA : Acid tricloroacetic UV : Tử ngoại (Ultra Violet) WHO : Tổ chức Y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do lao trên thế giới Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng INH trong dịch sinh học Bảng 2.1: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Bảng 3.1: Các biến đầu vào và các mức Bảng 3.2: Các biến đầu ra Bảng 3.3: Mô hình thiết kế thí nghiệm và kết quả Bảng 3.4: Các hệ số hồi quy của Y1 Bảng 3.5: Các hệ số hồi quy của Y2 Bảng 3.6: Phân tích phương sai cho Y1 Bảng 3.7: Phân tích phương sai cho Y2 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của INH Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ tìm lại của phương pháp Bảng 3.12: Kết quả khảo sát giới hạn định lượng Bảng 3.14: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong dịch màng phổi bệnh nhân Bảng 3.15: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong huyết tương bệnh nhân DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1: Sắc đồ của dịch sinh học trắng (a), dịch sinh học có INH (b), và phổ UV của pic ứng với INH (c) Hình 3.2: Sắc đồ mẫu định lượng với nồng độ TCA 20 % Hình 3.3a: Các đường đồng mức của Rs với nồng độ CA là 1% Hình 3.3b: Các đường đồng mức của S với nồng độ CA là 1% Hình 3.4: Các đường đồng mức của diện tích S pic INH (a) và độ phân giải Rs (b) với nồng độ CA là 1% Hình 3.5: Sắc đồ mẫu huyết tương trắng (a) và dịch màng phổi trắng (b) Hình 3.6: Sắc đồ mẫu thêm INH vào huyết tương trắng (a), dịch màng phổi trắng (b) Hình 3.7: Sắc đồ mẫu thêm INH, PZA, RMP vào huyết tương trắng(a), dịch màng phổi trắng (b) Hình 3.8: Phổ hấp thụ cực đại tại thời gian lưu ứng với pic INH trong mẫu huyết tương (a), dịch màng phổi (b) Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ INH trong huyết tương Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ INH trong dịch màng phổi Hình 3.11: Biểu đồ minh họa giá trị RSD % của các nồng độ INH so với yêu cầu phân tích thuốc Hình 3.12: Biểu đồ minh họa độ ổn định của INH trong huyết tương Hình 3.13: Biểu đồ minh họa độ ổn định của INH trong dịch màng phổi Hình 3.14: Sắc đồ của huyết tương bệnh nhân 2VL87 (a), dịch màng phổi bệnh nhân T5 (b) Hình 3.15: Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo nồng độ INH trong huyết tương Hình 3.16: Tỷ lệ % bệnh nhân (có nồng độ INH trong huyết tương) ở các khoảng điều trị Hình 3.17: Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo nồng độ INH trong dịch màng phổi Hình 3.18: Tỷ lệ % bệnh nhân (có nồng độ INH trong dịch màng phổi) ở các khoảng điều trị Hình 4.1: Sắc đồ mẫu dịch sinh học trắng thêm INH được nồng độ 10 µg/ml Hình 4.2: Sắc đồ mẫu dịch sinh học trắng thêm INH được nồng độ 10 µg/ml trong tài liệu [11] ĐẶT VẤN ĐỀ Lao là một bệnh truyền nhiễm, đã được y học nói đến với cái tên đáng sợ “dịch hạch trắng” vì rất dễ dàng lây từ người này sang người khác. Một người bị lao có thể lây truyền cho 10 – 15 người khác trong một năm. Do sự phát minh ra các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y giới, làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân có thể là do nhiều bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị, hay do thầy thuốc kê đơn không đúng, do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian … Để đạt được hiệu quả điều trị cần giám sát nồng độ thuốc trong dịch sinh học để sớm có điều chỉnh kịp thời đạt hiệu quả điều trị. Isoniazid là một trong những thuốc thiết yếu của phác đồ điều trị lao trong chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG). Đã có nhiều phương pháp định lượng các hoạt chất trong những dạng thuốc phối hợp (có isoniazid) điều trị lao ở dạng chế phẩm [6],[7],[9],[10],[17],[19]. Còn trong dịch sinh học, việc định lượng isoniazid tiến hành chủ yếu ở huyết tương hay nước tiểu của người [11], [23], [26], mà ít có những phương pháp định lượng isoniazid tại cơ quan tổn thương cụ thể là phổi, dịch màng phổi. Bên cạnh đó, khi tiến hành định lượng các hoạt chất ở dạng phối hợp thì isoniazid lại cho kết quả chỉ dạng vết, khó xác định nồng độ một cách chính xác, nhất là trong dịch màng phổi của bệnh nhân lao sau 1 khi uống thuốc này [11],[16]. Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng mà giới hạn định lượng INH với độ nhạy cao để có thể xác định được nồng độ isoniazid trong dịch sinh học của bệnh nhân lao là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định lượng Isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột ” nhằm : -Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột. -Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng nồng độ isoniazid trong dịch sinh học (huyết tương và dịch màng phổi) của bệnh nhân lao uống thuốc này. 2 [...]... VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1.Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc chất lỏng được bao trên bề mặt chất mang rắn đã được liên kết hóa học với một chất hữu cơ Quá trình sắc ký. .. nay, sắc ký phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quả tách tốt đối với nhiều đối tượng phân tích [2], [12] 13 Tùy thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc ký khác nhau Trong đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến sắc ký phân bố pha đảo -Sắc ký phân bố pha đảo gồm có: Sắc ký lỏng – lỏng Sắc ký pha liên kết Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hóa học với chất. .. hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc đồ [2] So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó 1.3.2.3.Số đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động, tức... Mẫu 1: dịch sinh học trắng Mẫu 2: dịch sinh học trắng thêm INH được nồng độ 10 µg/ml Mẫu 3: dịch sinh học trắng thêm PZA, INH được nồng độ 80 µg/ml, 10 µg/ml Mẫu 4: dịch sinh học trắng thêm RMP, INH được nồng độ 30 µg/ml, 10 µg/ml Mẫu 5: dịch sinh học trắng thêm INH, PZA, RMP được nồng độ 10 µg/ml, 80 µg/ml, 30 µg/ml So sánh sắc đồ của mẫu phân tích (mẫu 2, 3, 4, 5) với sắc đồ của mẫu dịch sinh học trắng... TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 .Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích Mẫu trắng dịch sinh học: huyết tương (Viện huyết học và truyền máu), dịch màng phổi trắng (Bệnh viện Lao và bệnh phổi TW) 23 Mẫu thử: hòa tan chất đối chiếu INH trong methanol được dung dịch gốc, rồi pha loãng ra các nồng độ thích hợp Cho các dung dịch có nồng độ xác định vào trong mẫu trắng 2.2.2 .Trong xác định nồng... độ INH trong dịch sinh học của bệnh nhân lao uống thuốc có chứa INH Mẫu trắng: Dịch sinh học (huyết tương hay dịch màng phổi không có INH) Mẫu thử: Dịch sinh học (huyết tương hay dịch màng phổi) của bệnh nhân sau khi uống đồng thời INH, PZA, RMP Nghiên cứu được tiến hành trên dịch sinh học của bệnh nhân lao phổi có AFB (+): bệnh nhân 16 tuổi trở lên, chức năng gan thận bình thường (biểu hiện bằng các... 2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1.Xây dựng và tối ưu hóa quá trình tạo dẫn chất trong phương pháp phân tích Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình trong tài liệu [11]: dịch sinh học 500 µl, thêm 1000 µl acetonitril, lắc xoáy 5 phút, siêu ly tâm 15 phút (15000 vòng/phút) ở 4 0C, dịch nổi trên được lọc qua màng lọc 0,22 µm, thu được dịch lọc Quá trình tạo dẫn chất: lựa chọn thuốc thử tạo dẫn chất; khảo sát... động Chất tan (A,B,…) Pha tĩnh Pha động 1.3.2.Một số thông số đặc trưng 1.3.2.1.Hệ số dung lượng k’ Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tích với pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất của quá trình sắc ký là sự phân bố chất tan giữa hai pha Sự phân bố này được đặc trưng bằng hệ số dung lượng k’; k’ được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất. .. chất mang tạo nên dẫn chất Siloxan; nếu pha tĩnh là những nhóm chức không phân cực (C8, C18, …) dung môi phân cực như: Methanol, Acetonitril thì ta có sắc ký pha đảo Trong sắc ký pha đảo thứ tự rửa giải các chất là : chất phân cực ra trước, các chất ít phân cực và không phân cực ra sau Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký là tổng của các mối tương tác: -Giữa chất phân tích và pha tĩnh -Giữa chất phân... kèm và các thành phần tạp trong dịch sinh học, cho phép định lượng INH có trong mẫu theo yêu cầu phân tích dịch sinh học 24 -Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn FDA với các chỉ tiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ đúng, độ tìm lại, độ ổn định Ứng dụng phương pháp đã xây dựng xác định nồng độ INH trong huyết tương hay dịch màng phổi của bệnh . dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột ” nhằm : -Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn. VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1.Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ. cao để có thể xác định được nồng độ isoniazid trong dịch sinh học của bệnh nhân lao là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu định lượng Isoniazid trong dịch