Nghiên cứu định lượng Isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột

Chuơng 1.TỔNG QUAN.......................................................................................31.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM........................................31.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới.........................................................31.1.2. Tình hình bệnh lao tại Việt Nam.......................................................51.1.3.Phác đồ điều trị lao.............................................................................61.2.TỔNG QUAN VỀ ISONIAZID.......................................................................71.2.1.Tác dụng sinh học ..............................................................................71.2.2.Tính chất hóa lý..................................................................................81.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid ...........................................101.3.VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO..........................................121.3.1.Khái niệm.........................................................................................121.3.2.Một số thông số đặc trưng................................................................131.3.3.Các phương pháp định lượng bằng HPLC.......................................161.4.VÀI NÉT VỀ TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP................................................171.4.1.Một số khái niệm..............................................................................171.4.2.Các phương pháp tối ưu hoá ............................................................181.5.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG DỊCH SINH HỌC...............191.5.1.Khái niệm.........................................................................................191.5.2.Nội dung thẩm định..........................................................................20Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến

TS.Nguyễn Thị Kiều Anh – phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội và TS.Phạm Thị Thanh Hà – bộ môn Hóa phân tích-Kiểm

nghiệm trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở Phòng đào tạo sau đại học, Bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình

học tập và nghiên cứu

Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Dược trường Đại học Y Dược Huế đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè,đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình

và say mê nghiên cứu khoa học

Hà Nội, tháng 12 năm 2009

Học viên

Đào Thị Cẩm Minh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chuơng 1

TỔNG QUAN

1.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3

1.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới

1.1.2 Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

1.1.3.Phác đồ điều trị lao

1.2.TỔNG QUAN VỀ ISONIAZID 7

1.2.1.Tác dụng sinh học

1.2.2.Tính chất hóa lý

1.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid

1.3.VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 12

1.3.1.Khái niệm

1.3.2.Một số thông số đặc trưng

1.3.3.Các phương pháp định lượng bằng HPLC

1.4.VÀI NÉT VỀ TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP 16

1.4.1.Một số khái niệm

1.4.2.Các phương pháp tối ưu hoá

1.5.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG DỊCH SINH HỌC 19

1.5.1.Khái niệm

1.5.2.Nội dung thẩm định

2.1.NGUYÊN – VẬT LIỆU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 22

2.1.1.Hoá chất

2.1.2.Thiết bị

2.2.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22

2.2.1.Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

2.2.2.Trong xác định nồng độ INH trong dịch sinh học của bệnh nhân lao uống thuốc có chứa INH

2.3.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.4.1.Xây dựng và tối ưu hóa quá trình tạo dẫn chất trong phương pháp phân tích

2.4.2.Thẩm định phương pháp

2.4.3.Định lượng INH trong dịch sinh học

Chương 3

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1.KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TẠO DẪN CHẤT TRONG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 29

3.1.1.Khảo sát điều kiện sắc ký

3.1.2.Xây dựng qui trình dẫn chất hoá

3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 38

3.2.1.Tính chọn lọc

Tiến hành như mục 2.4.2, kết quả sắc ký đồ của dịch sinh học trắng, dịch sinh học có thêm INH, và dịch sinh học có thêm INH, PZA, RMP được trình bày ở các hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8

3.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính

3.2.3.Độ chính xác

3.2.5.Độ tìm lại

3.2.6.Giới hạn định lượng (LOQ)

3.2.7.Độ ổn định

3.3.ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC CỦA BỆNH NHÂN LAO 47

3.3.1.Nồng độ INH trong huyết tương bệnh nhân

3.3.2.Nồng độ INH trong dịch màng phổi của bệnh nhân

Chương 4

BÀN LUẬN

4.1.VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ISONIAZID TRONG DỊCH SINH HỌC 53

4.1.1.Về quá trình tạo dẫn chất hóa

4.1.2.Về xây dựng điều kiện sắc ký

4.1.3.Thẩm định phương pháp phân tích

4.2.VỀ ỨNG DỤNG 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

AFB : Trực khuẩn kháng cồn kháng acid

The United States Food and Drug Administration

Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do lao trên thế giới

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng INH trong dịch sinh học

Bảng 2.1: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn

Bảng 3.1: Các biến đầu vào và các mức

Bảng 3.2: Các biến đầu ra

Bảng 3.3: Mô hình thiết kế thí nghiệm và kết quả

Bảng 3.4: Các hệ số hồi quy của Y1

Bảng 3.5: Các hệ số hồi quy của Y2

Bảng 3.6: Phân tích phương sai cho Y1

Bảng 3.7: Phân tích phương sai cho Y2

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của INH

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ tìm lại của phương pháp

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát giới hạn định lượng

Bảng 3.14: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong dịch màng phổi bệnh nhân

Bảng 3.15: Kết quả nồng độ INH (µg/ml) trong huyết tương bệnh nhân

Hình 3.1: Sắc đồ của dịch sinh học trắng (a), dịch sinh học có INH (b), và phổ UV

của pic ứng với INH (c)

Hình 3.2: Sắc đồ mẫu định lượng với nồng độ TCA 20 %

Hình 3.3a: Các đường đồng mức của Rs với nồng độ CA là 1%

Hình 3.3b: Các đường đồng mức của S với nồng độ CA là 1%

Hình 3.4: Các đường đồng mức của diện tích S pic INH (a) và độ phân giải Rs (b) với nồng độ CA là 1%

Hình 3.5: Sắc đồ mẫu huyết tương trắng (a) và dịch màng phổi trắng (b)

Hình 3.6: Sắc đồ mẫu thêm INH vào huyết tương trắng (a), dịch màng phổi trắng (b)

Hình 3.7: Sắc đồ mẫu thêm INH, PZA, RMP vào huyết tương trắng(a), dịch màng phổi trắng (b)

Hình 3.8: Phổ hấp thụ cực đại tại thời gian lưu ứng với pic INH trong mẫu huyết tương (a), dịch màng phổi (b)

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ INH trong huyết tương

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ INH trong dịch màng phổi

Hình 3.11: Biểu đồ minh họa giá trị RSD % của các nồng độ INH so với yêu cầu phân tích thuốc

Hình 3.12: Biểu đồ minh họa độ ổn định của INH trong huyết tương

Hình 3.13: Biểu đồ minh họa độ ổn định của INH trong dịch màng phổi

Hình 3.14: Sắc đồ của huyết tương bệnh nhân 2VL87 (a), dịch màng phổi bệnh nhân T5 (b)

Hình 3.15: Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo nồng độ INH trong huyết tương

Hình 3.16: Tỷ lệ % bệnh nhân (có nồng độ INH trong huyết tương) ở các khoảng điều trị

Hình 3.17: Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo nồng độ INH trong dịch màng phổi

Hình 3.18: Tỷ lệ % bệnh nhân (có nồng độ INH trong dịch màng phổi) ở các khoảng điều trị

tài liệu [11]

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lao là một bệnh truyền nhiễm, đã được y học nói đến với cái tên đáng

sợ “dịch hạch trắng” vì rất dễ dàng lây từ người này sang người khác Mộtngười bị lao có thể lây truyền cho 10 – 15 người khác trong một năm Do sựphát minh ra các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn

và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y giới, làmlãng quên căn bệnh nguy hiểm này Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại

và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gâymắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển

Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặcnhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân có thể là do nhiều bệnh nhân khônghợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị, hay do thầy thuốc kê đơnkhông đúng, do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốckhông đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian

… Để đạt được hiệu quả điều trị cần giám sát nồng độ thuốc trong dịch sinhhọc để sớm có điều chỉnh kịp thời đạt hiệu quả điều trị Isoniazid là một trongnhững thuốc thiết yếu của phác đồ điều trị lao trong chương trình chống laoquốc gia (CTCLQG) Đã có nhiều phương pháp định lượng các hoạt chấttrong những dạng thuốc phối hợp (có isoniazid) điều trị lao ở dạng chế phẩm[6],[7],[9],[10],[17],[19] Còn trong dịch sinh học, việc định lượng isoniazidtiến hành chủ yếu ở huyết tương hay nước tiểu của người [11], [23], [26], mà

ít có những phương pháp định lượng isoniazid tại cơ quan tổn thương cụ thể

là phổi, dịch màng phổi Bên cạnh đó, khi tiến hành định lượng các hoạt chất

ở dạng phối hợp thì isoniazid lại cho kết quả chỉ dạng vết, khó xác định nồng

độ một cách chính xác, nhất là trong dịch màng phổi của bệnh nhân lao sau

khi uống thuốc này [11],[16] Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng

mà giới hạn định lượng INH với độ nhạy cao để có thể xác định được nồng độisoniazid trong dịch sinh học của bệnh nhân lao là rất cần thiết

Xuất phát từ thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định lượng Isoniazid trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột ” nhằm :

-Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isoniazid trong dịchsinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo dẫn chất hóa trước cột

-Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng nồng độ isoniazidtrong dịch sinh học (huyết tương và dịch màng phổi) của bệnh nhân lao uốngthuốc này

Chuơng 1 TỔNG QUAN

1.1.TÌNH HÌNH BỆNH LAO THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3dân số thế giới) Bệnh lao mới mắc hàng năm trên toàn cầu là trên 8 triệu,tổng số lao cũ và mới đang lưu hành là trên 16 triệu Số người chết vì laohằng năm là 2 triệu trong đó có 300.000 trẻ em và 700.000 phụ nữ trong độtuổi sinh sản, chết do lao gấp 2 lần số chết do nguyên nhân sản khoa và phụkhoa Mỗi năm có 640.000 bệnh lao mới mắc có nhiễm HIV Dịch HIV/AIDS

là một nguyên nhân làm cho bệnh lao lan truyền nhanh hơn trong cộng đồngnhất là tại Châu Phi và Châu Á WHO xác nhận lao hiện nay là bệnh giếtnhiều người nhất trong các bệnh nhiễm Đến nay bệnh lao đã gia tăng nhiềutại các nước đang phát triển với hình thức khó chẩn đoán hơn, phát bệnh sớmhơn, chết nhanh hơn ở bệnh nhân lao có nhiễm HIV và dưới hình thức nguyhiểm hơn đó là lao kháng thuốc và kháng đa thuốc lao Tại các nước nghèohiện nay lao kháng đa thuốc thì không có khả năng chữa trị được [31], [32].Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thunhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánhnặng bệnh lao cao

Tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ pháthiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnhnhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, vàtheo ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bịnhiễm lao (65 triệu người)

Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông-Nam Châu Á.Dưới đây là ước tính tỷ lệ mắc và tử vong do lao ở các khu vực (WHO, 2004).

Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do lao trên thế giới

Khu vực Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000

Tử vong do lao (bao gồm cả nhiễm HIV)

Các thể

Các thể (%)

AFB (+)

Các thể

AFB (+)

SL (nghìn) TL/100000

10 bệnh có số chết đứng hàng đầu tại các nước đang phát triển Mắc bệnh lao và

tử vong vì lao chủ yếu ở thiếu niên và người lớn trong tuổi lao động sản xuất,những người làm ra của cải vật chất nuôi sống gia đình và xã hội Chính bệnhlao đã làm cho xã hội nghèo khổ không phát triển được, ngoài ra xã hội còn phảitiếp nhận số trẻ mồ côi mà những phần tử trụ cột trong gia đình đã chết vì lao để

lại và chính bản thân những người bị lao cũng chịu các di chứng tàn phế nếu họđược phát hiện bệnh trễ và điều trị không đúng nguyên tắc [33].

Lao hiện nay là vấn đề khẩn cấp của sức khỏe toàn cầu

1.1.2 Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Tại Việt Nam dịch lao là một vấn đề y tế công cộng quan trọng Năm

1999, WHO xếp Việt Nam ở vị trí thứ 11 trong số 22 nước trên toàn thế giới

có tổng số bệnh lao nhiều nhất (80% tổng số lao toàn cầu) Năm 2000 cả nước(có 61 tỉnh với 76 triệu dân) đã phát hiện và điều trị 90.756 bệnh lao các thểtrong đó có 53.169 lao phổi mới có vi khuẩn lao trong đàm Tình hình vikhuẩn lao kháng thuốc ban đầu ở Việt Nam cũng rất cao 32,5% kháng từ 1 –

4 thuốc cơ bản Streptomycin, Isoniazid, Rifampicin, Ethambutol trong đó có2,3% lao đa kháng thuốc lao (điều tra năm 1997) Dịch HIV/AIDS đã tăngnhanh trong các năm gần đây Tổng số người Việt Nam nhiễm HIV từ 1990 –

2000 có báo cáo là 28.661 (trong đó có 4.728 ca AIDS và 2510 tử vong) Sốbệnh lao có nhiễm thêm HIV cả nước có báo cáo là 1564 ca Tỷ lệ tử vong ởbệnh nhân lao có nhiễm HIV là rất cao 31,3% Chương trình chống lao ViệtNam đã triển khai thực hiện chiến lược Hóa trị liệu ngắn ngày có giám sáttrực tiếp (DOTS) điều trị lao với phác đồ hóa ngắn ngày trong vòng 8 tháng

có kiểm soát tại quận huyện phường xã từ 1989 và đạt được kết quả lành bệnhlao các thể khoảng 90% [31]

Điều mà CTCLQG cần làm là sự đồng tình hỗ trợ của mọi người, mọigia đình và mọi đoàn thể trong nước và quốc tế cùng với chính quyền trongviệc thực hiện chiến lược chống lao DOTS điều trị lao có kiểm soát với phác

đồ hóa ngắn ngày cho 100% bệnh nhân lao trong cả nước Đó là biện phápduy nhất có được để ngăn chặn dịch lao trong tình hình hiện nay

1.1.3.Phác đồ điều trị lao

Lao là bệnh nhiễm khuẩn lây truyền có từ lâu đời và tác nhân gây bệnhchính là trực khuẩn hình que được nhà bác học Robert Kock tìm ra trong đàmcủa người bị lao phổi từ năm 1882 Bệnh lao có 2 thể: lao phổi và lao ngoàiphổi Lao phổi chiếm từ 70% đến 80% trong tổng số lao chung Lao phổi làthể lây chủ yếu theo đường hô hấp từ người bệnh sang người lành Ngườibệnh lao khi ho khạc hay hắt hơi làm bắn ra bên ngoài nhiều vi khuẩn lao nằmtrong các hạt đàm nhớt li ti bay lơ lửng trong không khí Con người sẽ bịnhiễm lao nếu hít phải không khí có chứa vi khuẩn lao Lao phổi tìm có vikhuẩn lao trong đàm soi trực tiếp là nguồn lây lao chính cho cộng đồng Mỗibệnh nhân lao phổi có thể lây cho 20 – 30 người lành trong 2 năm nếu khôngđược điều trị lành.

Các phác đồ chính điều trị lao hiện nay được áp dụng ở Việt Nam [5],[7], [15]

- Lao phổi mới ở người lớn: 2 (Streptomycin, Isoniazid, Pyrazinamid)/

6 (Isoniazid, Ethambutol)

- Lao phổi tái phát, lao phổi mạn tính và thể lao nặng: 2 (Streptomycin ,Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol)/ 1 (Rifampicin, Isoniazid,Pyrazinamid, Ethambutol)/ 5 (Rifampicin, Isoniazid Ethambutol)

Lao mới là bệnh nhân chưa được điều trị lao bao giờ hoặc đã điều trịchưa được 1 tháng

Lao phổi tái trị là những bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc lao trướcđây, được điều trị (đủ hoặc chưa đủ thời gian) với kết quả triệu chứng đã hếthoặc thuyên giảm trong 1 tháng hoặc hơn Bệnh nhân quay lại với triệu chứnglâm sàng và (hoặc) xét nghiệm (ví dụ AFB dương tính) của một bệnh đangtiến triển Lao tái trị bao gồm:

+Điều trị lại sau bỏ trị: Bệnh nhân không dùng thuốc 2 tháng trong quá

trình điều trị, nay quay lại điều trị với AFB (+) trong đờm.

+Tái phát: Bệnh nhân được điều trị lao đủ thời gian, được thầy thuốcxác định khỏi bệnh hoàn thành điều trị nay mắc bệnh trở lại

+Thất bại: Bệnh nhân có AFB (+) trong đờm sau điều trị thuốc lao

Isoniazid là một trong những thuốc hóa học đầu tiên được chọn trong

điều trị lao Thuốc có tính đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại Mycobacterium tuberculosis và Mycobacterium không điển hình khác như: M.bovis, M.kansasii Cho đến nay thế giới vẫn coi Isoniazid là một trong những thuốc

quan trọng nhất được sử dụng trong điều trị tất cả các thể lao [4]

1.2.1.1.Dược động học

INH được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa Thời gian sau uống liều

300 mg nồng độ tối đa trong huyết tương đạt tới 3-8 µg/ml Thức ăn và cácthuốc chứa nhôm làm giảm hấp thu thuốc INH khuếch tán nhanh vào các tếbào, dịch màng phổi, dịch cổ trướng và dịch não tủy Nồng độ INH trong dịchnão tủy tương đương với nồng độ trong máu [4] Sau khi uống thuốc 2 giờ,phần lớn các cá thể có nồng độ INH cao nhất, Cmax của INH là 3-6 µg/ml

INH chuyển hóa qua gan bằng phản ứng acetyl hóa, tốc độ phản ứngphụ thuộc vào yếu tố di truyền

Thận là cơ quan thải trừ chủ yếu của INH Sau dùng 24giờ, INH thải

trừ khoảng 75-95% dưới dạng đã chuyển hóa Một lượng nhỏ thải qua phân.Thuốc có thể loại khỏi máu bằng thẩm phân thận nhân tạo hay thẩm phânmàng bụng [7].

INH được chỉ định phòng và điều trị mọi thể lao trong và ngoài phổi,

sơ nhiễm và tái phát

Liều tấn công: 5mg/kg/24h dùng hàng ngày

Liều duy trì: 10mg/kg/lần x 3 lần/tuần hoặc 15mg/kg/24h x 2lần/tuần.Tốt nhất là uống thuốc trước khi ăn 1h hoặc sau ăn 2h Có thể uống thuốccùng với bữa ăn nếu bị kích ứng đường tiêu hóa [9]

1.2.2.Tính chất hóa lý

1.2.2.1.Công thức hóa học

-Công thức phân tử: C6H7N3O ; M=137,1

-Công thức cấu tạo:

-Tên khoa học: 4-pyridin carboxylic acid hydrazid (hydrazid của acid

1.2.2.2.Tính chất vật lý

Bột kết tinh màu trắng, không mùi, dễ tan trong nước (1/8), hơi tantrong ethanol 96% (1/45), khó tan trong cloroform (1/1000), rất khó tan trongether Độ chảy 170-174ºC [9]

Hấp thụ UV: λmax = 266 nm (trong nước), E1cm1% = 378

λmax = 265 nm (trong HCl 0,001 N), E1cm1% = 420

Phổ hấp thụ hồng ngoại có các đỉnh tại bước sóng 1653, 1541, 1621,

676, 992, 845 cm-1 (đĩa KBr)

1.2.2.3.Tính chất hóa học và khả năng tạo dẫn chất

Isoniazid có khả năng tham gia vào các phản ứng hóa học do các yếu tốcấu trúc là nhân pyridin và nhóm hydrazin [9], [28]

-Phản ứng của nhân pyridine:

 Đun chế phẩm với natri carbonat khan, giải phóng pyridin có mùiđặc biệt

 Dung dịch chế phẩm trong nước, tác dụng với đồng sulfat tạo phứcmàu xanh da trời

 Ngoài ra còn tạo phức với carbon, kẽm, mangan

-Phản ứng của nhóm chức hydrazin

 Tác dụng với dung dịch bạc nitrat và tạo tủa đen của bạc kim loại

+ AgNO3 → +Ag↓ +N2↑+H2O

 Phản ứng ngưng tụ với aldehyd, ceton tạo hydrazon ít tan trong nước,

có điểm chảy xác định Phản ứng này được ứng dụng để tạo ra nhiều dẫn chấtcủa INH

1.2.3.Các phương pháp định lượng Isoniazid

a.Đối với nguyên liệu, chế phẩm:

 Phương pháp đo Brom :

Trong môi trường acid với sự có mặt của kali bromid, chuẩn độ chậmbằng dung dịch kali bromat 0,1N, dùng chỉ thị màu đỏ methyl hoặcethoxychrysoidin, hoặc xác định điểm kết thúc bằng đo thế [9]

 Chuẩn độ trong môi truờng khan :

Chuẩn độ bằng acid percloric trong môi trường acid acetic có mặt củaanhydrid acetic, chỉ thị p-naphtholbenzein [7]

 Định lượng bằng phương pháp đo iod :

Oxy hóa INH bằng brom thừa trong môi trường acid, sau đó thêm mộtlượng KI dư rồi chuẩn độ iod giải phóng bằng natri thiosulfat với chỉ thị hồtinh bột [9]

 Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại:

Cho isoniazid phản ứng với dung dịch 6-methyl-2-pyridinecarboxaldehyd0,025 % trong ethanol và đệm KCl/HCl pH 1, để nóng hỗn hợp này trong nước

10 phút sau đó hoà loãng với nước Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng

328 nm [19]

Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và thử trong môi trường dungdịch acid hydrocloric loãng ở bước sóng 267±1nm trong cốc đo dày 1 cm,mẫu trắng là acid hydrocloric 0,1 N [19]

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng INH trong dịch sinh học

Tài

liệu Mẫu thử Pha động Pha tĩnh

Tốc độ dòng

Bước sóng (λmax)

Nhận xét

11 Huyết tương

người

Acetonitril, đệm phosphate pH 7,5, chạy theo chương trình

Cột Inertsil OSD

(250x4,6mm;5 μm)

1,3 ml/phút

Cột Li 100-CN (250x4,6mm;5 μm)

1,0 ml/phút

330nm -Dẫn chất bằng

cinnamaldehyd -LOQ=0,1 μg/l

18 Huyết tương

chuột

Isopropanol:nước (5:95)

YMC-ODS (150x4,6mm; 5 μm)

1,3 ml/phút

337nm -Dẫn chất bằng

2- carboxaldehyd.

1,0 ml/phút

Hiện nay, sắc ký phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quảtách tốt đối với nhiều đối tượng phân tích [2], [12]

Tùy thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc kýkhác nhau Trong đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến sắc ký phân bố pha đảo.

-Sắc ký phân bố pha đảo gồm có: Sắc ký lỏng – lỏng

Sắc ký pha liên kếtTrong sắc ký phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hóa học với chấtmang tạo nên dẫn chất Siloxan; nếu pha tĩnh là những nhóm chức không phâncực (C8, C18, …) dung môi phân cực như: Methanol, Acetonitril thì ta có sắc

ký pha đảo

Trong sắc ký pha đảo thứ tự rửa giải các chất là : chất phân cực ratrước, các chất ít phân cực và không phân cực ra sau

Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký là tổng của các mối tương tác:

-Giữa chất phân tích và pha tĩnh

-Giữa chất phân tích và pha động

-Giữa pha tĩnh và pha động

1.3.2.Một số thông số đặc trưng

1.3.2.1.Hệ số dung lượng k’

Quá trình tách trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất phân tíchvới pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất củaquá trình sắc ký là sự phân bố chất tan giữa hai pha Sự phân bố này được đặctrưng bằng hệ số dung lượng k’; k’ được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất

Chất tan (A,B,…)

tan trong pha tĩnh và pha động theo công thức sau:

)M(Q

)S(Q'

kề, số đĩa lý thuyết của cột

Tùy theo tính chất, cấu trúc của chất phân tích mà người ta sử dụng cácdetector khác nhau để phát hiện như: huỳnh quang, UV-Vis, điện hóa …Trong đó, UV-Vis được dùng phổ biến nhất vì nó đơn giản, khả năng ứngdụng rộng, độ nhạy cao đáp ứng nhu cầu phân tích và kinh tế

1.3.2.2.Thời gian lưu (t R )

Thời gian lưu của một chất (tính bằng phút, giây) là thời gian tính từlúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc

của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động [1], [2], [12].

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau:

2 R

W

t16N

R

W

t54.5

Trong đó: tR: thời gian lưu (phút)

W: chiều rộng của pic đo ở đáy pic (phút)

W1/2: chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh (phút)Tùy từng phép phân tích mà yêu cầu N khác nhau Trong thực tế N nằm trongkhoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000

1.3.2.4.Độ phân giải R S

Là đại lượng biểu thị mức độ tách của các chất ra khỏi nhau trong điềukiện sắc ký đã cho Độ phân giải của 2 pic cạnh nhau được tính theo côngthức sau:

B A

A R, B R, S

WW

)t2(tR

+

−

) B ( 2 / 1 ) A ( 2 / 1

A , R B , R

)tt(18,1R

+

−

=

Trong đó:

tR,A, tR,B: thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B

WA,WB: độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B

W1/2(A), W1/2(B): độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A và B

Trong thực tế nếu các pic cân đối tuân theo phân bố chuẩn (Gauss) thì

độ phân giải để 2 pic có độ lớn bằng nhau tối thiểu là 1,0 Trong phép địnhlượng Rs=1,5 là phù hợp

1.3.3.Các phương pháp định lượng bằng HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên

tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký [1], [2]:

-Phương pháp chuẩn ngoại

-Phương pháp chuẩn nội

-Phương pháp chuẩn hóa diện tích

-Phương pháp thêm chuẩn

Trong đề tài này, tôi chỉ trình bày phương pháp chuẩn ngoại:

Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó

cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

So sánh diện tích (hay chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (haychiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn một điểm hoặc nhiều điểm

+ Chuẩn hóa 1 điểm: chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ củamẫu thử Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

S

S X X

S

CS

ở đây Cx: Nồng độ mẫu thử

Cs: Nồng độ mẫu chuẩn

Sx: Diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử

Ss: Diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

+ Chuẩn hóa nhiều điểm: Tiến hành qua các bước sau:

Chuẩn bị một dãy các nồng độ tăng dần của mẫu chuẩn rồi tiến hành sắc ký.Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc các chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn

Thiết lập sự tương quan giữa diện tích hoặc chiều cao của pic với nồng

độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toánnồng độ của các chất cần xác định

1.4.VÀI NÉT VỀ TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP

1.4.1.Một số khái niệm

1.4.1.1.Biến đầu vào và biến đầu ra

 Biến đầu ra còn gọi là biến phụ thuộc hay đáp ứng: Là kết quả của thínghiệm mà người làm thí nghiệm thấy cần phải đo đạc và đánh giá

 Biến đầu vào còn gọi là biến độc lập hay yếu tố: Là những biến màngười làm thí nghiệm có thể thay đổi giá trị của nó khi tiến hành thínghiệm và sự thay đổi này có thể kéo theo sự thay đổi giá trị của biếnđầu ra [13]

1.4.1.2.Tối ưu hoá

Tối ưu hoá một công thức hay một quy trình là việc tìm công thức,thông số (hay điều kiện tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chấtlượng tốt nhất trong phạm vi có thể [13]

Để tối ưu hoá phải mô tả được mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầuvào Có hai cách chính để mô tả quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu vào:

- Dùng mô hình (phương trình) toán học: Đây là cách mô tả đơn giản

và dễ hiểu nhất Phương trình thường có dạng đa thức bậc nhỏ hơn hoặc bằng

2 và được gọi là phương trình hồi qui

- Dùng mạng thần kinh nhân tạo (Artificial Neural Network – ANN)

1.4.1.3.Thiết kế thí nghiệm

Thiết kế thí nghiệm là phương pháp lập kế hoạch và tiến hành thựcnghiệm để thu nhận được thông tin tối đa từ tập hợp các dữ liệu thí nghiệmtrong sự có mặt của nhiều yếu tố có thể làm biến đổi kết quả thí nghiệm với

số thí nghiệm tối thiểu

1.4.1.4.Trình tự thiết kế thí nghiệm về tối ưu hoá

Việc thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá gồm những bước cơ bản sau:

- Xác định các biến đầu ra (biến phụ thuộc) cần tối ưu hoá và yêu cầucủa chúng

- Xác định biến đầu vào (biến độc lập) có khả năng ảnh hưởng đến cácbiến đầu ra.

- Sàng lọc: Thiết kế và tiến hành các thí nghiệm sơ bộ nhằm phân tíchảnh hưởng của các biến đầu vào lên các biến đầu ra để loại bỏ các biến đầuvào không hoặc ít ảnh hưởng

- Thiết kế và tiến hành thí nghiệm để phân tích ảnh hưởng của các biếnđầu vào còn lại lên các biến đầu ra Từ các kết quả thí nghiệm, xây dựng cácmối quan hệ giữa các biến đầu ra và các biến đầu vào Mối quan hệ này có thểbiểu diễn dưới dạng phương trình hồi qui dạng đa thức có bậc nhỏ hơn hoặcbằng 2 hoặc mạng thần kinh nhân tạo Những mối quan hệ này cho phép dựđoán giá trị của các biến đầu ra khi biết giá trị của các biến đầu vào mà khôngcần làm thêm thí nghiệm

- Tối ưu hoá các biến đầu ra dựa trên các mối quan hệ đã xây dựng đểtìm các giá trị tối ưu của các biến đầu vào

- Làm thí nghiệm theo các giá trị tối ưu của các biến đầu vào vừa tìmđược để kiểm tra và điều chỉnh nếu cần

1.4.2.Các phương pháp tối ưu hoá

1.4.2.1.Tối ưu hoá một biến đầu ra

Nếu chỉ có một biến đầu ra, quá trình tối ưu hoá chính là việc xác địnhtập hợp các giá trị của các biến đầu vào để biến đầu ra đó dần đến giá trịmong muốn nhất Giá trị mong muốn nhất đó có thể là giá trị cực đại, cực tiểuhay giá trị đích nào đó (trong một giới hạn sai số cho phép)

1.4.2.2.Tối ưu hoá đồng thời nhiều biến đầu ra

Trong thực tế, nhiều khi phải tối ưu hoá không phải là 1 mà là đồngthời nhiều biến đầu ra

Tập hợp các giá trị của biến đầu vào để biến đầu ra này đạt giá trị tối ưuchưa chắc làm cho các biến đầu ra khác đạt giá trị tối ưu [13] Trong trường

hợp này, người ta thường chuyển mỗi biến đầu ra cần tối ưu hoá thành mộthàm hy vọng riêng (partial desirability function) rồi kết hợp các hàm hy vọngriêng này thành hàm hy vọng chung (global desirability function) và thườngđược tính theo công thức sau:

1

Trong đó: D: hàm hy vọng chung

r: số biến đầu ra cần tối ưu hoá

di: hàm hy vọng riêng của biến đầu ra thứ i cần tối ưu hoá

pi: trọng số của biến đầu ra thứ i cần tối ưu hoá và được

chuẩn hoá sao cho ∑

1.5.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG DỊCH SINH HỌC

1.5.1.Khái niệm

Thẩm định một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là quátrình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặctrưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứngdụng phân tích thực tế Các đặc điểm phân tích đặc trưng cần được thẩm địnhbao gồm: độ đúng, độ chính xác, độ chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạnđịnh lượng, khoảng nồng độ tuyến tính Ngoài ra có thể có những yêu cầukhác tùy theo loại phương pháp và đối tượng nghiên cứu

Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là một quátrình nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và cókhả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát

1.5.2.Nội dung thẩm định

1.5.2.1.Tính chọn lọc

Tính chọn lọc của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệtcác chất trong mẫu thử dùng khi tách và định lượng hai hay nhiều thành phầntrong một hỗn hợp của phương pháp đó [29]

1.5.2.2.Khoảng nồng độ tuyến tính

Khoảng nồng độ tuyến tính là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng

đo được y và nồng độ đã biết x của chất phân tích trong một khoảng nồng độ

xác định [29]

Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b

Và hệ số tương quan tuyến tính r Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng

và giá trị hệ số r phải không nhỏ hơn 0,99

1.5.2.3.Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quảriêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp nhiều lần trên cùngmột mẫu đồng nhất Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (σ) hay

độ lệch chuẩn tương đối (RSD%), hoặc sai số tương đối (εr%) Độ chính xácgồm có:

Độ lặp lại (repeatability): Độ lặp lại được tính khi phép phân tích đượclặp lại trong cùng một phòng thí nghiệm, trong khoảng thời gian ngắn, và docùng một người phân tích

Độ tái hiện (reproducibility): Độ tái hiện được xác định bằng lặp lạiphép phân tích đó ở một phòng thí nghiệm khác (thường trong nghiên cứuhợp tác giữa nhiều phòng thí nghiệm)

Độ chính xác trung gian: là độ chính xác được xác định ở cùng mộtphòng thí nghiệm, nhưng trong ngày khác, hoặc với người phân tích khác,hoặc trên thiết bị khác [28]

1.5.2.4.Độ đúng

Độ đúng của 1 phương pháp phân tích là một mức độ gần sát của kếtquả phân tích với giá trị thực của chất phân tích Độ đúng có thể thay đổi từ 0-100% [28].

Đánh giá kết quả: Độ đúng được biểu thị bằng phần trăm của giá trịtrung bình so với giá trị thực

Giá trị trung bình thu được sau khi phân tích phải sai lệch không quá15% so với giá trị thực, riêng tại nồng độ LOQ sai lệch không quá 20%

1.5.2.5.Độ ổn định

Độ ổn định của chất phân tích được khảo sát cả trong dung dịch chuẩngốc và trong mẫu sinh học, trong điều kiện và thời gian bảo quản dài, trongquá trình xử lý mẫu và sắc ký Để đánh giá độ ổn định, người ta thường sosánh kết quả phân tích mẫu bảo quản với các mẫu mới chuẩn bị Kết quả saikhác không quá 5% [29]

1.5.2.6.Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thểđịnh lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận LOQ được chấpnhận nếu đạt các điều kiện: Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lầnđáp ứng của mẫu trắng; Pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt vàgiá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác 20% [29]

1.5.2.7.Độ tìm lại

Độ tìm lại của phương pháp phân tích sinh học được biểu hiện là hiệusuất chiết của quá trình chuẩn bị mẫu Xác định bằng phần trăm giữa đáp ứngcủa chất phân tích trong huyết tương so với đáp ứng của chất phân tích trongdung môi pha mẫu (không qua xử lý) [29]

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.NGUYÊN – VẬT LIỆU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

2.1.1.Hoá chất

- Chất đối chiếu: INH (hàm lượng 100,1%) (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

- Methanol (MeOH), acetonitril (MeCN) loại dùng cho HPLC (Merck-Đức)

- Natri acetat, acid acetic băng (Merck- Đức, loại PA)

- Dịch sinh học: huyết tương không có thuốc (Viện huyết học truyền máuTW), dịch màng phổi trắng (không có thuốc) (Viện lao và bệnh phổi TW)

- Thuốc thử: Cinnamaldehyd (CA) (99%), acid tricloroacetic (TCA) tinhkhiết phân tích

2.1.2.Thiết bị

- Máy HPLC Thermo-Finnigan, detector UV-DAD (Mỹ): bộ phận loạikhí chân không SCM1000, bơm cao áp P4000, bộ phận tiêm mẫu tự động và

lò cột AS3000, detector UV6000LP, phần mềm ChromQuest 4.0

- Máy lắc xoáy Labinco (Hà Lan)

- Máy siêu li tâm Sartorius (Đức )

- Cân phân tích Mettler (Thụy Sỹ)

- Tủ lạnh sâu Sanyo (Nhật)

- Pipet tự động 1000µl, 100µl, 10µl

- Các dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

2.2.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1.Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

Mẫu trắng dịch sinh học: huyết tương (Viện huyết học và truyền máu),dịch màng phổi trắng (Bệnh viện Lao và bệnh phổi TW)

Mẫu thử: hòa tan chất đối chiếu INH trong methanol được dung dịchgốc, rồi pha loãng ra các nồng độ thích hợp Cho các dung dịch có nồng độxác định vào trong mẫu trắng.

2.2.2.Trong xác định nồng độ INH trong dịch sinh học của bệnh nhân lao uống thuốc có chứa INH

Mẫu trắng: Dịch sinh học (huyết tương hay dịch màng phổi không có INH) Mẫu thử: Dịch sinh học (huyết tương hay dịch màng phổi) của bệnhnhân sau khi uống đồng thời INH, PZA, RMP Nghiên cứu được tiến hànhtrên dịch sinh học của bệnh nhân lao phổi có AFB (+): bệnh nhân 16 tuổi trởlên, chức năng gan thận bình thường (biểu hiện bằng các chỉ số ure, creatinin,ALT, AST trong giới hạn bình thường), điều trị bằng phác đồ có RMP, INH,PZA Bệnh nhân đang điều trị nội trú tại Bệnh viện Lao và bệnh phổi Trungương và Bệnh viện Lao và bệnh phổi Hải Phòng Chấp thuận tình nguyệntham gia nghiên cứu, và đã thông qua hội đồng Y đức

2.3.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Xây dựng phương pháp định lượng INH trong dịch sinh học bằngHPLC:

-Quá trình xử lý mẫu: khảo sát các điều kiện xử lý mẫu INH trong dịchsinh học: các thuốc thử kết tủa protein với các thể tích khác nhau, thời gianlắc xoáy, tốc độ ly tâm, và thời gian ly tâm để lựa chọn phương pháp xử lýmẫu thích hợp

-Quá trình tạo dẫn chất hóa: lựa chọn thuốc thử tạo dẫn chất, nồng độthuốc thử, thể tích thuốc thử, thời gian tạo dẫn chất

-Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảoINH tách riêng và tách khỏi các thuốc uống kèm và các thành phần tạp trongdịch sinh học, cho phép định lượng INH có trong mẫu theo yêu cầu phân tíchdịch sinh học

-Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn FDA với các chỉtiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ chínhxác, độ đúng, độ tìm lại, độ ổn định.

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng xác định nồng độ INH trong huyếttương hay dịch màng phổi của bệnh nhân lao khi uống thuốc có INH

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1.Xây dựng và tối ưu hóa quá trình tạo dẫn chất trong phương pháp phân tích

Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình trong tài liệu [11]: dịch sinh học 500 µl,thêm 1000 µl acetonitril, lắc xoáy 5 phút, siêu ly tâm 15 phút (15000 vòng/phút) ở

4 0C, dịch nổi trên được lọc qua màng lọc 0,22 µm, thu được dịch lọc

Quá trình tạo dẫn chất: lựa chọn thuốc thử tạo dẫn chất; khảo sát sơ bộnồng độ thuốc thử; thời gian tạo dẫn chất; rồi tối ưu hóa quá trình bằngphương pháp tối ưu theo phần mềm Umetrics modde 5.0

Khảo sát các điều kiện sắc ký như:

-Cột sắc ký (pha tĩnh) C8, C18, CN

-Dung môi pha động khác nhau: MeCN - đệm Na2HPO4 pH=7,5(58:42 tt/tt) ; MeCN – isopropanol (4:1 tt/tt); MeOH - Đệm acetat pH=4,5(1:1 tt/tt): hoà tan 0,25 g CH3COONa trong 100 ml nước, thêm 450 mlMeOH, thêm 10 ml acid acetic băng, nước cất vừa đủ 1000 ml

Lựa chọn detector UV: Quét phổ UV của pic ứng với dẫn chất củaINH, bước sóng lựa chọn là cực đại hấp thụ

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút; 1,5 ml/phút

Thể tích tiêm: 10, 20, 50, 100 µl

Từ các khảo sát trên, lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng INHtrong mẫu dịch sinh học của bệnh nhân

2.4.2.Thẩm định phương pháp

Phương pháp tiến hành gồm có các tiêu chí: tính chọn lọc, khoảng nồng

độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, độ ổn định, giới hạn định lượng, độ tìm lại

 Pha dung dịch chuẩn:

Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn Isoniazid cho vào bình địnhmức, hoà tan trong MeOH vừa đủ 10 ml, được dung dịch có nồng độ 1mg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng trong MeOH thành các dung dịchA1→A7 có nồng độ: 500-375-250-175-25-12,5-6,25 µg/ml

Cân chính xác khoảng 80 mg chất chuẩn Pyrazynamid cho vào bìnhđịnh mức, hoà tan trong MeOH vừa đủ 10 ml, được dung dịch có nồng độ 8mg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng trong MeOH thành dung dịch cónồng độ 400 µg/ml

Cân chính xác khoảng 30 mg chất chuẩn Rifampicin cho vào bình địnhmức, hoà tan trong MeOH vừa đủ 10 ml, được dung dịch có nồng độ 3mg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng trong MeOH thành dung dịch cónồng độ 150 µg/ml

 Tính chọn lọc

Chuẩn bị 5 mẫu dịch sinh học (huyết tương hay dịch màng phổi) nhưsau, mỗi mẫu làm song song 2 lần:

Mẫu 1: dịch sinh học trắng

Mẫu 2: dịch sinh học trắng thêm INH được nồng độ 10 µg/ml

Mẫu 3: dịch sinh học trắng thêm PZA, INH được nồng độ 80 µg/ml, 10 µg/ml.Mẫu 4: dịch sinh học trắng thêm RMP, INH được nồng độ 30 µg/ml, 10 µg/ml.Mẫu 5: dịch sinh học trắng thêm INH, PZA, RMP được nồng độ 10 µg/ml, 80µg/ml, 30 µg/ml

So sánh sắc đồ của mẫu phân tích (mẫu 2, 3, 4, 5) với sắc đồ của mẫudịch sinh học trắng (mẫu 1)

 Độ chính xác

Chuẩn bị các mẫu ở 3 nồng độ khác nhau (C2-C3-C5) Mỗi nồng độ làm

6 lần song song Xử lí mẫu và tiến hành sắc ký Tính RSD % nồng độ của INH

 Độ đúng

Chuẩn bị các mẫu ở 3 nồng độ khác nhau (C2-C3-C5) Mỗi nồng độ

làm 6 lần song song Xử lí mẫu và tiến hành sắc ký Độ đúng được tính bằngphần trăm giữa giá trị thu được và giá trị thực của chất phân tích trong dịchsinh học dựa vào đường chuẩn.

Độ tìm lại được xác định bằng phần trăm giữa đáp ứng phân tích thuđược của mẫu dịch sinh học và mẫu trong MeOH

 Độ ổn định

Chuẩn bị các mẫu ở 3 nồng độ khác nhau (C2-C3-C5) Mỗi nồng độlàm 6 lần x 4 song song Bảo quản ở -35ºC trong khoảng thời gian 15 ngày.Phân tích trước và sau 5, 10, 15 ngày lấy mẫu huyết tương ra để rã đông Tiếnhành xử lí mẫu và đem phân tích

Xác định hàm lượng thuốc thay đổi theo thời gian bảo quản bằng cách

so sánh nồng độ chất phân tích sau khoảng thời gian bảo quản với mẫu đượcphân tích ngay sau khi chuẩn bị

Nồng độ % thuốc thay đổi

O

i O C

C

( −

=

Trong đó : C là nồng độ thuốc ban đầu

C là nồng độ thuốc sau thời gian bảo quản (i = 5, 10, 15 ngày)

2.4.3.Định lượng INH trong dịch sinh học

Áp dụng phương pháp phân tích đã thẩm định để định lượng Isoniazidtrong huyết tương hay dịch màng phổi bệnh nhân lao

2.4.3.1.Lấy mẫu, vận chuyển, bảo quản mẫu huyết tương bệnh nhân

Bệnh nhân lao uống viên nén hỗn hợp Tuberzid gồm 3 thành phầnRMP 150 mg; INH 75 mg; PZA 400mg Lấy mẫu ở ngày điều trị thứ 5 là thờiđiểm thuốc INH đạt được trạng thái có nồng độ thuốc ổn định trong huyếttương Ở thời điểm 2 giờ sau khi uống thuốc trên, lấy máu tĩnh mạch khoảng3ml cho vào ống nghiệm chứa chất chống đông Heparin

Số lượng máu cần thiết cho mỗi mẫu định lượng nồng độ thuốc là 3 ml máutĩnh mạch chống đông bằng Heparin Ly tâm tách huyết tương trong vòng 15phút ngay sau khi lấy máu

Ống nghiệm đựng mẫu huyết tương bằng propylen, nút kín có dãn nhãn và

mã hóa, bọc kín bằng giấy bạc, để trong phích đá vận chuyển về phòng thí nghiệm

Điều kiện bảo quản: bảo quản ở tủ lạnh -35ºC cho đến khi định lượng.Nơi tiến hành: khám lâm sàng, xét nghiệm, uống thuốc và lấy máu tạikhoa lao phổi mới, khoa lao phổi tái trị, bệnh viện Lao và bệnh phổi trung ương

2.4.3.2.Lấy mẫu, vận chuyển và bảo quản dịch màng phổi bệnh nhân

Bệnh nhân lao uống viên hỗn hợp 3-FDC do chương trình chống laoquốc gia (CTCLQG) cấp phát.Tên thương mại Turbezid 625 mg (RMP 150

mg + INH 75 mg + PZA 400mg)

Số lượng dịch màng phổi (được lấy sau khi uống thuốc 2 giờ) cần thiếtcho mỗi mẫu định lượng nồng độ thuốc là 3 ml dịch màng phổi Mỗi mẫu dịchmàng phổi đều tách thành 2 mẫu nhỏ Một mẫu để phân tích Isoniazid Mẫucòn lại để dự trữ sau khi phân tích số liệu, nếu nghi ngờ có thể phân tích lại

Dịch màng phổi tách ra cho vào ống nghiệm 5 ml bằng nhựa, nút kín,dán nhãn có mã hóa mẫu, bọc mẫu bằng giấy nhôm để tránh ánh sáng

Vận chuyển: cho mẫu vào phích đá vận chuyển, thời gian vận chuyển

tố đa là 4 giờ

Bảo quản mẫu trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -35ºCđể phân tích

Nơi tiến hành: khám lâm sàng, xét nghiệm, uống thuốc và lấy dịchmàng phổi tại bệnh viện Lao và bệnh phổi Hải Phòng

Chương 3

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1.KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TẠO DẪN CHẤT TRONG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Chọn quá trình xử lý mẫu theo tài liệu [11]: dịch sinh học 500 µl; thêm

1000 µl acetonitril, lắc xoáy 5 phút, siêu ly tâm 15 phút (15000 vòng/phút),dịch nổi trên được lọc qua màng lọc 0,22 µm, thu được dịch lọc

3.1.1.Khảo sát điều kiện sắc ký

Qua tham khảo tài liệu và dựa trên các điều kiện sắc ký có sẵn chúngtôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như cột sắc ký, pha động, bướcsóng phát hiện, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, cách xử lý mẫu, điều kiện dẫnxuất hoá cho phép tách được tốt nhất Isoniazid trong dịch sinh học (trước khitối ưu hóa)

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc để tiến hành khảo sát: Cân chính xáckhoảng 10mg chất chuẩn Isoniazid cho vào bình định mức, hoà tan trongMeOH vừa đủ 10ml Từ đó, pha thành nồng độ 5 µg/ml

- Phenomenex Gemini 5 µm C18 110A (4,6 x 250 mm, 5 µm)

Kết quả cho thấy cột Zorbax SB-CN (4,6 x 150 mm, 5 µm) là có khảnăng tách tốt và chọn lọc với Isoniazid trong dịch sinh học

Chọn pha động (thành phần, tỷ lệ)