Xây dựng phương pháp định tính, định lượng gentiopicrin Kem VIEMDA AD sắc ký lỏng hiệu cao Tạ Văn Bình\ Lê Thị Hải Yến\ Ma Thị Hổng Nga\ Nguyễn Thị Quỳnh^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^ ^Trường Cao đẳng YHà Nội, ^Trường Đại học Dược Hà Nội SUMMARY The aim of this work is to develop ơn analysis of gentiopicrin in VIEMDA AD cream by high performance lipid chromatography The analysis process was conducted on on Inertsil Cl column (250 mm X 4.6 mm, ụm) The mobile phase of methanol: water (35:65, v/v) was pumped at the flow rate of 1ml/min Gentiopicrin was identified by UV-DAD detector at wavelength of270 nm The obtained results showed that linear range, overage recovery and precision were 0.10- 0.30 mg/ml, 100.70% and 2.07% (n = 12), respectively Consequently, this HPLC method was good linear, repeotobility and precision This validated method is appropriate to quantity gentiopicrin in VIEMDA AD creom Từkhoá: Kern VIEMDA AD, long đởm, gentiopicrin, HPLC Đặt vấn đề Viêm da địa (còn gọi chàm thể tạng - Atopic dermatitis - AD) dạng viêm da mạn tính, bệnh thường xuất trẻ em kéo dài đến tuổi trưởng thành, bệnh gặp người lớn [6], Theo nghiên cứu Christina M Gelbard Adelaide A Hebert [4] bệnh viêm da địa bệnh mãn tính ảnh hưởng đến 10 - 20% trẻ em - 3% người lớn Mỹ Các triệu chứng bệnh thường dẫn đến ngủ, tâm lý căng thẳng, lo lắng gây ảnh hưởng xấu tới công việc học tập Tại Việt Nam, theo báo cáo Viện Da liễu Trung ương, ngày khoa khám bệnh tiếp nhận từ 400 - 600 người mắc bệnh da, bệnh viêm da địa (sẩn ngứa, mày đay, chàm, tổ đ ỉa ) chiếm tới 30% số bệnh nhân Đặc biệt, bệnh viêm da địa có chiều hướng gia tăng với phát triển xã hội, ô nhiễm môi trường năm gẩn [2] Hiện nay, điểu trị chàm thể tạng chưa có thuốc đặc hiệu, chủ yếu sử dụng corticosteroid với tác dụng chống viêm giảm phản ứng dị ứng gây phản ứng phụ nguy hiểm Kem VIEMDA AD thành phần có chứa dược liệu Long đởm với dược chất gentiopicrin, nghiên cứu bào chế để dùng điều trị chàm thể tạng Để đưa thuốc vào sản xuất điều trị chất lượng thuốc cẩn tiêu chuẩn hóa kiểm tra, kiểm soát chặt chẽ Nghiên cứu thực nhằm mục tiêu xây dựng phương pháp định tính, định lượng gentiopicrin Kem VIEMDA AD sắc ký lỏng hiệu cao, từ góp phẩn xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm sản phẩm Hóa chất, thiết bị phương pháp nghiên cứu Mău thử Kem VIEMDA AD đóng tuyp 20 g, sản xuất ngày 25/04/2013 sản phẩm nghiên cứu Trường Cao Đẳng Y Hà Nội (thuộc đé tài cấp thành phố Hà Nội) Hóa chất, chất chuẩn Chất đối chiếu: gentiopicrin hàm lượng 99,0% tính theo nguyên trạng, đóng lọ 20 mg Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd (Trung Quốc) cung cấp Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho HPLC PA (Merck - Đức) Thiết bị Hệ thổng HPLC - detector u v - DAD Agilent Technologies 1260 Infinitive, Mỹ với phẩn mềm Aligent Chemstation version B Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,01 mg); Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức; Máy lắc xoáy Labinco L46, Hà Lan; Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2- 16K,Đức;Tủ lạnh Sanyo, Nhật; Nồi cách thủy WiseCircu',Tây Ban Nha Các dụng cụ thủy tinh xác 4 Phương pháp nghỉên cứu -Điều kiện sắc ký: + Cột: Inertsil c^g(5 |am, 250 mm x4,6 mm) + Pha động: Methanol - nước (35:65) + Detector: u v 270 nm +Thể tích tiêm mẫu: 10 |jl + Tốc độ dòng: ,0 ml/ phút + Nồng độ gentiopicrin dung dịch mẫu tiêm: khoảng 0,2 mg/ml - Chuẩn bị dung dịch: + Dung dịch chuẩn gốc: cân xác lượng chất chuẩn tương đương khoảng 10 mg gentiopicrin cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan vừa đủ thể tích methanol Bảo quản lọ thủy tỉnh kín - 8° c dùng vòng tháng + Dung dịch chuẩn: lấy xác ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng vừa đủ thể tích methanol Lọc qua màng lọc 0,45 Mim + Dung dịch thử: Lấy thuốc đơn vị chế phẩm chọn ngẫu nhiên Trộn Cân xác khoảng 0,50 g chế phẩm vào ống nghiệm 10 ml, thêm ml methanot siêu âm 20 phút đun cách thủy 60°c 15 phút để nguội Chuyển toàn vào bình định mức 10 ml, rửa ống nghiệm lẩn lần với khoảng ml methanol.Tập trung dịch rửa vào bình định mức Thêm methanol đến vừa đủ thể tích Lắc đểu Ly tâm phút với tốc độ 1000 vòng/ phút Lọc lớp dịch qua màng lọc 0,45 lim Định tính:ĩrên sác ký đổ dung dịch thử phải có pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu pic gentiopicrin sắc ký đổ dung dịch chuẩn Định lượng: Phương pháp so sánh với chuẩn làm song song điểu kiện Hàm lượng gentiopicrin p (%) chế phẩm tính theo công thức: Kết nghỉên cứu Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích Khảo sát lựơ chọn điểu kiện sắc ký Dựa vào đặc tính hoạt chất kết nghiên cứu định lượng gentiopicrin HPLC công bố [3 ,5 , 8], tiến hành khảo sát lựa chọn điểu kiện phân tích phù hợp khả thi - Sử dụng cột sắc ký Inertsil ODS-3 (250 X 4,6 mm, pm) nghiên cứu -Thực sắc ký gentiopicrin (dung dịch chuẩn) với hệ pha động methanol - nước với tỷ lệ thay đổi, methanol 25 - 40%, nước 75 - 60% (AC = 5%), tốc độ dòng 1,4 ml/ phút Kết cho thấy nồng độ methanol tăng thời gian lưu pỉc gentiopicrin giảm áp suất cột táng nhanh (hình ) tỷ lệ methanol 35%, nước 65% thời gian lưu khoảng phút áp suất khoảng 220 bar Để áp suất làm việc hệ thống không cao (< 200 bar), tiến hành giảm tốc độ dòng pha động từ 1,4 ml/ phút tới 1,0 ml/phút (AV = 0,1 ml) thấy tốc độ dòng pha động ml/phútvớitỷlệphađộng áp suất cột khoảng 170 bar thời gian lưu pic gentiopicrin khoảng phút Đổng thời, thể tích tiêm mẫu nhỏ (10 |jl) thực nhằm hạn chế doãng pic giảm thiểu mức độ gây bẩn cột sắc ký mẫu thử dạng cream có nguồn gốc dược liệu 250 225 Xì 200 150 20 25 30 35 40 45 Nồng độ M eO H (%) H'inh Ảnh hưởng củũ tỷ lệ thành phân phũ động tới áp suất cộĩsổc kỷ xm^ X 16 Trong đó: A^: Diện tích pic gentiopicrin sắc ký đổ dung dịch thử dung dịch chuẩn m : Khối lượng (mg) mẫu thử mẫu chuẩn, c H: Hàm lượng (%) gentỉopicrin độ ẩm (%) chất đối chiếu - Thơm định phương pháp: theo hướng dẫn ICH [7] định tính, định lượng hoạt chất chế phẩm, gồm tiêu: tính chọn lọQ khoảng nồng độ tuyến tính, độ xác, độ .a 12 It Dí) C ' •I I 20 25 30 35 40 45 Nồng độ M eO H (%) Hình Ảnh hưởng củũ tỷ lệ thònỉì phân phũ động tới thời giQíì lưu CỦQgentiopiơin Bước sóng phát lựa chọn bước sóng cực đại hấp thụ quét phổ hấp thụ pic gentiopicrin sắc ký đổ dung dịch chuẩn Từ kết khảo sát thực nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng gentiopicrin trình bày phán phương pháp nghiên cứu Xử lý mâu Gentiopicrin có khả hòa tan tốt methanol mặt khác methanol dung môi thành phần pha động methanol lựa chọn dung môi dùng xử lý mẫu Tiến hành khảo sát thực nghiệm với thể tích dung môi 10 -2 ml (AV = ml), thời gian siêu âm thời gian thủy phân 10 -3 phút (At = phút), nhiệt độ thủy phân cố định 60°c nhỏ nhiệt độ sôi methanol để lựa chọn quy trình xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao loại tạp với thời gian xử lý ngắn.Từ kết thu quy trình xử lý mẫu lựa chọn trình bày phần phương pháp nghiên cứu (Dung dịch thử) Thẩm định phương pháp Tiến hành thẩm định tiêu chí theo hướng dẫn ICH [7] Tính chọn lọc Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu placebo, dung dịch chuẩn gentiopicrin, dung dịch thử (Kem VIEMDA AD) Kết trình bày hình Kết hình cho thấy thời gian lưu pic sắc đồ dung dịch mẫu thử trùng với thời gian lưu pic gentiopicrin dung dịch chuẩn (8,16 phút) sắc ký đồ mẫu placebo không xuất pic khoảng - phút Như phương pháp có tính chọn lọc cao Tính thích hợp hệ thống Được xác định dựa vào độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic thời gian lưu gentiopicrin sắc ký lẩn liên tiếp dung dịch chuẩn gentiopicrin nồng độ 0,2 mg/ml Kết cho thấy RSD diện tích pic thời gian lưu pic gentiopỉcrin lẩn lượt 0,18% 0,23% (n = 6) đểu thấp 2,0% hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng gentiopicrin Khoảng nổng độ tuyến tính Của phương pháp xác định dựa mối tương quan hồi quy nồng độ diện tích pic gentỉopicrin khoảng nồng độ khảo sát 0,10 0,30 mg/ml Kết trình bày bảng •bÁÒVo-S;;;ã>Ò4Ri«^(AHffeSÚWAtk'.YÂÌN mAU 120 100 10 mAU ĩ 80 lỊ 60 40 20 ^ () ^ - -2 Kinh Sâc ký đổ mẫu: a Plũcebo; b genĩiopicrin chuổn; c Kem VIEMDA AD _ ỉ 10 12 14 12 14 Bỏng I Kết quỏ khỏo sát khoỏng nống độ tuyến tính Nồng độ gentiopicrin (mg/ml) 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Diện tích pic (mAU giây) 1123,6 1912,5 2332,4 2853,8 3294,8 Phương trình hổi quy: y = 10567 X - 189,9 Hệ sỗtương quan: r = 0,9930 Độ xác Của phương pháp xác định dựa vào phân tán số liệu (RSD) tiến hành phân tích lần riêng biệt ngày (độ lặp lại) thực tương tự ngày phân tích khác (độ xác khác ngày) mẫu chế phẩm Kem VIEMDA AD theo quỵ trình Kết trình bày bảng Báng Kết quở độ xác CỦQ phương pháp Ngày phân tích Ngày phân tích Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng gentiopicrin (%) TT Khối lượng (g) (g) Diện tích pic (mAU.s) Hàmlượng gentiopicrin (%) 0,5100 2507,0 0,386 0,5030 2437,6 0,380 0,5096 2534,3 0,390 0,5012 2427,8 0,380 0,5042 2454,1 0,382 0,5090 2538,2 0,391 0,5009 2385,7 0,374 0,5011 2439,3 0,382 0,5038 2417,3 0,376 0,5053 2548,3 0,396 0,5083 2400,9 0,371 0,5040 2530,2 0,394 TT Khối lương Trung bình 0,3787 Trung bình 0,3872 RSD(%) 1,94 RSD(%) 1,87 Hàmlượng trung bình gentiopicrin với n = 12 là: 0,383% RSDvớin = 12là:2,07% Độ Được xác định theo phương pháp thêm chuẩn cách thêm lượng xác chuẩn gentiopicrin vào mẫu thử (khối lượng 0,50 g) mức 0,2 mg; 0,4 mg 0,6 mg (thêm 1,00 ml; 2,00 ml 3,00 ml dung dịch gentiopicrin chuẩn có nồng độ 0,2 mg/nnl) tương ứng lượng gentiopicrin thêm vào khoảng 10 %; 20% 30% lượng hoạt chất có mẫu thử Xử lý mẫu tiến hành sắc ký Kết trình bày bảng Bỏng Két quở khâo sớt độ (n=3) Mức thêm Lượng gentiopiain thêm vào (mg) Lượng gentiopicrin tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hổi (%) RSD% 10% 0,20 0,1975 98,8 0,84 20% 0,40 0,3940 98,5 0,63 30% 0,60 0,5976 99,6 1,91 Bàn luận Kem VIEMDA AD chế phẩm thuốc bào chế từ dược liệu, chứng minh có tác dụng tốt điểu trị viêm da địa Thành phần chế phẩm dược liệu Long đởm với dược chất gentiopicrin [3] Để đưa thuốc vào sản xuất đăng ký lưu hành cẩn tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm Dược điển Việt Nam IV [1], chuyên luận "Long đởm" để cập tới phương pháp định tính Long đởm dựa vào chuẩn dược liệu chuẩn sắc ký lớp mỏng hóa học Các nghiên cứu xác định (định tính, định lượng) gentiopicrin dược liệu thường thực phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao [3,5 , 8] Định tính, định lượng gentiopicrỉn Kem VIEMDA AD - chế phẩm bào chế từ dược liệu Long đởm - thực phương pháp HPLC cho phép tách hoạt chất khỏi nển mẫu phức tạp (tá dược thuốc cream, thành phần khác dược liệu Long đởm), định tính dựa vào thời gian lưu pic gentiopicrin sắc ký đổ dung dịch chuẩn bị từ mẫu chế phẩm dung dịch chuẩn gentiopicrin; định lượng theo phương pháp chuẩn ngoại chuẩn hóa điểm dựa so sánh diện tích pic gentỉopicrỉn dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn, nổng độ gentiopicrin dung dịch mẫu chuẩn lượng mẫu thử đem định lượng Quá trình tách, định tính, định lượng hoạt chất thực thời phép phân tích nên phương pháp thực nhanh, có tính kinh tế với độ xác cao Phương pháp định tính, định lượng gentỉopicrin chế phẩm xây dựng đơn giản cán sử dụng thiết bị HPLC detector uv loại detector phổ biến phòng phân tích Phương pháp có tính chọn lọc cao (pic gentiopicrin tách khỏi pic cản trở, cân thời gian lưu khoảng 8,10 phút), xác (độ lặp lại ngày có RSD < 2,0% với n = độ xác khác ngày RSD < 3,0% với n = 12), khoảng nồng độ tuyến tính phù hợp (khoảng nồng độ 0,10 - 0,30 mg/ml với r > 0,99), độ nằm khoảng cho phép 98,0 -102% theo qui định vể thẩm định phương pháp phân tích [7] Xu hướng ứng dụng phương pháp phân tích đại - đặc biệt phương pháp HPLC để tiêu chuẩn hóa dược liệu chế phẩm từ dược liệu với chất đánh dấu có hoạt tính sinh học nhằm đánh giá góp phần kiểm soát chất lượng dược liệu Khi thực nghiên cứu, trước tiên phải xác định chất đánh dấu có hoạt tính sinh học để tiêu chuẩn hóa, mặt khác phải có chất chuẩn Nhưng khó khăn chất chuẩn dược liệu đắt tiền (đắt - 10 lẩn so với chất chuẩn có nguổn gốc tổng hợp) Do đó, để nâng cao chất lượng kiểm nghiệm dược liệu chế phẩm có nguổn gốc từ dược liệu việc cắn trọng thiết lập chất chuẩn có nguồn gốc dược liệu tạo điểu kiện cho nhà sản xuất nhà phân tích có hội sử dụng chuẩn với giá thành hạ dễ dàng Kết luận Phương pháp HPLC định tính, định lượng gentiopicrin Kem VIEMDA AD - chế phẩm bào chế từ dược liệu Long đởm - xây dựng đơn giản, có tính chọn lọc cao, độ xác, độ đảm bảo phù hợp với điểu kiện thiết bị phòng phân tích phương pháp có tính ứng dụng cao Kết sở để hoàn thiện Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm hổ sơ xin đăng ký sản phẩm nhằm sớm đưa thuốc thị trường phục vụ cộng TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009), DƯỢC điển Việt Nam IV, tr 812-813 Lê Hữu Doanh (2009), Tinh hình viêm da địa viện Da liễu Quốc gia từ 1995 đến 2005, Tạp chíYhọc thực hành, (12) Chinese Pharmacopoeia Commission (2010), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, pp 204-205 Christina M Gelbard, Adelaide A Hebert (2008) Patient Preference and Adherence, Vol.2, p 387-392 Huang z, Lin s (2005), Determination gentiopicrin in biyanqingdugmnuloe by SPE-HPLC, Zhong Yoo Col, 28(6), pp 507-8 Donald Y.M Leung, Mark Boguniewicz, Michael D Howell, Ichiro Nomura, and Qutayba A Hamid (2004), The Journal of Clinical Investigation, Vol 113(5), pp 651-657 ICH Q2(R2) Validation of analytical procedures (2005): Text and Methodolody Analytical Method Validation Yin H,ZhaoQ,Sun FM, AnT (2009),Gentiopicrin-producingendophyticfungusisolatedfromGenf/ữnơmứcrop/7y//a,P/73^omed/c/ne.,l 6(8), pp 793 92 ! Nghiên cứuduợcThòng tin thuốc I Số 3/2014 ... chuẩn sắc ký lớp mỏng hóa học Các nghiên cứu xác định (định tính, định lượng) gentiopicrin dược liệu thường thực phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao [3,5 , 8] Định tính, định lượng gentiopicrỉn Kem VIEMDA. .. thành hạ dễ dàng Kết luận Phương pháp HPLC định tính, định lượng gentiopicrin Kem VIEMDA AD - chế phẩm bào chế từ dược liệu Long đởm - xây dựng đơn giản, có tính chọn lọc cao, độ xác, độ đảm bảo... cao Phương pháp định tính, định lượng gentỉopicrin chế phẩm xây dựng đơn giản cán sử dụng thiết bị HPLC detector uv loại detector phổ biến phòng phân tích Phương pháp có tính chọn lọc cao (pic gentiopicrin