xây dựng phương pháp định lượng tenofovir trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ

P[BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DƢƠNG ÁNH HIỆP XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG TENOFOVIR TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DƢƠNG ÁNH HIỆP XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG TENOFOVIR TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Tạ Mạnh Hùng HÀ NỘI 2020 LỜI CẢM ƠN Tôi xin đƣợc bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Tạ Mạnh Hùng - Phó viện trưởng, Giám đốc Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tận tình hƣớng dẫn quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô cơng tác Bộ mơn Hóa Phân tích - độc chất giúp đỡ thời gian học tập trƣờng Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Viện Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương chia sẻ giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ động viên để tơi có đủ nghị lực, tâm hoàn thành luận văn Hà nội, ngày 30 tháng năm 2020 Học viên: Dƣơng Ánh Hiệp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 TENOFOVIR 1.1.1 Cơng thức cấu tạo tính chất lý hóa 1.1.2 Tác dụng dƣợc lý dƣợc động học 1.1.3 Một số phƣơng pháp định lƣợng Tenofovir 1.2 SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 1.2.1 Nguyên lý hoạt động thiết bị phân tích khối phổ 1.2.2 Máy sắc ký lỏng khối phổ 1.3 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 10 1.3.1 K thuật x lý mẫu 11 1.3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích thuốc dịch sinh học 12 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 17 2.1.1 Hóa chất, chất chuẩn 17 2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 17 2.2 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Xây dựng thẩm định phƣơng pháp phân tích hệ thống LC-MS/MS 18 2.3.2 Xác định nồng độ TFV mẫu huyết tƣơng ngƣời tình nguyện 23 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 25 3.1.1 Chọn điều kiện khối phổ chuẩn nội để định lƣợng Tenofovir 25 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 31 3.1.3 Nghiên cứu quy trình x lý mẫu huyết tƣơng 33 3.1.4 Kết xây dựng phƣơng pháp định lƣợng TFV huyết tƣơng 35 3.1.5 Kết thẩm định phƣơng pháp 37 3.2 KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG TFV TRONG HUYẾT TƢƠNG NTN 55 Chƣơng BÀN LUẬN 60 4.1 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG TFV TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI 60 4.1.1 Xây dựng phƣơng pháp phân tích 60 4.1.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 61 4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƢƠNG NTN 622 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 64 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục Kết khảo sát đƣờng chuẩn theo mơ hình weighting 1/x2 PL1 Phụ lục Kết khảo sát độ xác khác ngày (n = 5) PL3 Phụ lục Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi IS PL4 Phụ lục Bản chấp thuận đề cƣơng nghiên cứu danh sách Hội đồng đạo đức PL5 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Tenofovir Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo máy săc ký lỏng khối phổ Hình 1.3 Cấu tạo chế hoạt động phổ khối tứ cực chập ba Hình 3.1 Phổ khối [TFV H + 25 Hình 3.2 Phổ khối [TFV-H]- 26 Hình 3.3 Giản đồ tối ƣu điện phận thu mẫu chế độ ESI ( ) 26 Hình 3.4 Giản đồ tối ƣu điện phận thu mẫu chế độ ESI (-) 27 Hình 3.5 Phổ ion phân mảnh ion m/z=288 chế độ ESI ( ) 27 Hình 3.6 Giản đồ tối ƣu lƣợng phân mảnh tín hiệu MRM 288 >> 176 28 Hình 3.7 Phổ ion phân mảnh ion m/z = 286 chế độ ESI (-) 28 Hình 3.8 Giản đồ tối ƣu lƣợng phân mảnh tín hiệu MRM 286 >> 134 29 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa TFV IS với cột C18 (50 x 3mm; 2,5 m) 31 Hình 3.10 SKĐ mẫu chuẩn chứa TFV IS với cột C18 (150 x 4,6mm; m) 31 Hình 3.11 SKĐ phân tích TFV IS với cột Luna C18 (150 x 4,6mm; 3µm) 32 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa TFV IS với điều kiện sắc ký xây dựng 33 Hình 3.13 Quy trình x lý mẫu 35 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu huyết tƣơng chứa TFV IS chế độ ESI ( ) 36 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu huyết tƣơng chứa TFV IS chế độ ESI (-) 36 Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu huyết tƣơng trắng (Blank) 38 Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu huyết tƣơng trắng có pha IS (Zero) 38 Hình 3.18 SKĐ mẫu HTT có pha IS chuẩn TFV nồng độ ng/mL (LLOQ) 39 Hình 3.19 Đồ thị phần dƣ đƣờng chuẩn thực nghiệm theo mơ hình 1/x2 40 Hình 3.20 SKĐ mẫu huyết tƣơng NTN trƣớc uống thuốc 57 Hình 3.21 SKĐ mẫu huyết tƣơng NTN trƣớc uống thuốc có thêm IS 57 Hình 3.22 SKĐ mẫu huyết tƣơng NTN thời điểm 12 sau uống thuốc 57 Hình 3.23 SKĐ mẫu huyết tƣơng NTN thời điểm 24 sau uống thuốc 57 Hình 3.24 Đƣờng cong nồng độ TFV - thời gian NTN 58 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các nghiên cứu định lƣợng TFV huyết tƣơng ngƣời Bảng 2.1 Các lô huyết tƣơng trắng s dụng 17 Bảng 2.2 Các thiết bị s dụng để thẩm định phƣơng pháp phân tích 18 Bảng 2.3 Cách chuẩn bị đƣờng chuẩn huyết tƣơng 21 Bảng 2.4 Cách chuẩn bị mẫu QC huyết tƣơng 21 Bảng 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 30 Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ định lƣợng TFV IS 37 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng mẫu trắng thời điểm trùng tR TFV IS 39 Bảng 3.4 Kết khảo sát đƣờng chuẩn theo mơ hình weighting 1/x2 41 Bảng 3.5 Độ - độ xác mẫu LLOQ 41 Bảng 3.6 Kết đánh giá ảnh hƣởng mẫu 42 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ nhiễm chéo 43 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ - độ xác ngày 44 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ - xác khác ngày (n = 5) 46 Bảng 3.10 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi TFV 47 Bảng 3.11 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc TFV thời gian dài 48 Bảng 3.12 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn nội gốc thời gian dài 48 Bảng 3.13 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn 49 Bảng 3.14 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn nội gốc thời gian ngắn 49 Bảng 3.15 Kết độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn 50 Bảng 3.16 Kết độ ổn định mẫu huyết tƣơng sau chu kỳ đông–rã 51 Bảng 3.17 Kết độ ổn định mẫu huyết tƣơng thời gian ngắn 52 Bảng 3.18 Độ ổn định mẫu huyết tƣơng thời gian dài 53 Bảng 3.19 Kết độ ổn định mẫu sau x lý - bảo quản autosampler 54 Bảng 3.20 Kết nồng độ TFV huyết tƣơng NTN 55 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3TC : Lamivudin AA : Acid acetic ACY : Acyclovir AIDS : Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immuno Deficiency Syndrome) AmA : Amoni acetat AN : Chất phân tích AUC : Diện tích dƣới đƣờng cong (Area under the curve) CC : Đƣờng chuẩn CV : Hệ số biến thiên Cmax : Nồng độ đỉnh EMA : Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu FA : Acid formic GLP : Thực hành tốt phịng thí nghiệm (Good Laboratory Practices) HA : Hydroxylamin HD : Hạn dung HIV : Vi rút gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human Immunodeficiency Virus) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao IS : Chất chuẩn nội LC-MS/MS : Sắc ký lỏng hai lần khối phổ LLE : Chiết lỏng – lỏng LLOQ : Giới hạn định lƣợng dƣới LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MQC : Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình NTN : Ngƣời tình nguyện NRTI : Thuốc ức chế enzyme chép ngƣợc nucleosid (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor) PPT : Tủa protein PTHQ : Phƣơng trình hồi quy QC : Mẫu kiểm tra SĐK : Số đăng kí SKD : Sinh khả dụng SKĐ : Sắc ký đồ SPE : Chiết pha rắn TBAC : Tetrabutyl ammonium chloride TBAHS : Tetrabutylammonium hydrogen sulphate TCA : Tricloro acetic TĐSH : Tƣơng đƣơng sinh học TFA : Triflouro acetic TFV : Tenofovir Tmax : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa máu tR : Thời gian lƣu US-FDA : Hiệp hội thực dƣợc phẩm M VKNTTW Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ƣơng WHO : Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) WSS - CC : Dung dịch chuẩn làm việc huyết tƣơng ZDV : Zidovudin ĐẶT VẤN ĐỀ Tenofovir (TFV) thuốc kháng virus thuộc nhóm ức chế men chép ngƣợc loại nucleotid (NRTI), có nhiều phác đồ điều trị HIV/AIDS tổ chức Y tế giới (WHO) điều trị viêm gan virus B [12] Phác đồ điều trị HIV/AIDS thƣờng kết hợp nhiều thuốc phải điều trị kéo dài suốt đời với loại thuốc có nhiều tác dụng phụ chi phí cao Vì vậy, việc điều trị HIV/AIDS thách thức lớn, quốc gia nghèo đói có tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS cao Tenofovir đƣợc khuyến cáo s dụng rộng rãi nhƣ lựa chọn đầu tay hƣớng dẫn điều trị HIV/AIDS giới, đặc tính: an tồn, dung nạp tốt, hiệu lực cao phác đồ phối hợp, s dụng tiện lợi (1 viên/ngày) giúp tăng tuân thủ điều trị [30] Hiện nay, số doanh nghiệp dƣợc nƣớc khu vực nghiên cứu sản xuất chế phẩm chứa TFV Theo thông tƣ 08/2010/TT-BYT Hƣớng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tƣơng đƣơng sinh học đăng ký thuốc Bộ Y tế ban hành, thuốc kháng virus thuộc danh mục nhóm tác dụng dƣợc lý ƣu tiên thuốc đƣợc s dụng chƣơng trình mục tiêu quốc gia cần báo cáo số liệu nghiên cứu tƣơng đƣơng sinh học đăng ký thuốc nên nhu cầu nghiên cứu tƣơng đƣơng sinh học điều cần thiết xuất phát từ thực tế [2 Mặt khác, để đánh giá chất lƣợng thuốc nhƣ hiệu điều trị lâm sàng thuốc, cần thiết phải thực nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) đánh giá tƣơng đƣơng sinh học (TĐSH) [2] Kết đánh giá SKD TĐSH giúp bác sĩ có thêm sở để lựa chọn thuốc thay hiệu hay hiệu chỉnh liều dùng cho phù hợp với bệnh nhân Một nội dung quan trọng nghiên cứu đánh giá SKD TĐSH xây dựng quy trình chiết tách, x lý mẫu phân tích định lƣợng nồng độ thuốc dịch sinh học Q trình phân tích thuốc dịch sinh học thƣờng gặp tiêu: độ chọn lọc (hình 3.16, 3.17 bảng 3.3), đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính (bảng 3.4), xác định giới hạn định lƣợng dƣới (bảng 3.5), ảnh hƣởng mẫu (bảng 3.6), độ nhiễm chéo (bảng 3.7), độ độ xác ngày (bảng 3.8), độ độ xác khác ngày (bảng 3.9), tỷ lệ thu hồi chuẩn nội (bảng 3.10) chất phân tích (bảng 3.11), nghiên cứu độ ổn định chất phân tích huyết tƣơng bảo quản điều kiện khác (từ bảng 3.12 đến bảng 3.20) Trong nghiên cứu này, khoảng tuyến tính đƣợc đánh giá đƣờng chuẩn riêng biệt để lựa chọn hệ số weighting phù hợp (1/x2) Với hệ số weighting lựa chọn, đƣờng chuẩn có hệ số tƣơng quan tuyến tính r > 0,995 nồng độ tính đƣợc từ đƣờng chuẩn so với nồng độ lý thuyết n m giới hạn cho phép Điều chứng tỏ có tƣơng quan tuyến tính nồng độ đƣờng chuẩn tỉ lệ đáp ứng pic TFV/IS Do có khoảng tuyến tính rộng (3 – 600 ng/mL), phƣơng pháp ứng dụng để đánh giá tƣơng đƣơng sinh học chế phẩm chứa TFV nhiều hàm lƣợng khác Do khoảng tuyến tính rộng nên quy trình thẩm định phƣơng pháp đánh giá thêm mức nồng độ SQC nh m đảm bảo có mẫu QC n m khoảng nồng độ NTN Ngoài ra, kết thẩm định tiêu độ đúng, độ xác (đƣợc đánh giá ngày khác với mức nồng độ bao gồm LLOQ) cho thấy phƣơng pháp có độ đúng, độ xác ngày khác ngày n m giới hạn cho phép 4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƢƠNG NTN Áp dụng phƣơng pháp xây dựng để định lƣợng TFV huyết tƣơng ngƣời tình nguyện, kết cho thấy: Trên SKĐ mẫu huyết tƣơng NTN s dụng 01 viên TFV 300 mg (trừ mẫu HT thời điểm trƣớc s dụng thuốc) xuất pic tƣơng ứng 62 với pic TFV IS mẫu chuẩn Nhƣ vậy, phƣơng pháp LC-MS/MS nghiên cứu có tính đặc hiệu - chọn lọc cao Tất mẫu có nồng độ TFV giá trị LLOQ, giá trị Cmax b ng khoảng 2/3 nồng độ cao đƣờng chuẩn khoảng 125 lần giá trị LLOQ, mẫu n m khoảng tuyến tính đƣợc thẩm định (3 – 600 ng/mL) Có nồng độ QC khoảng nồng độ NTN nhƣ phƣơng pháp phân tích đáp ứng yêu cầu EMA phân tích thuốc dịch sinh học [14] Giá trị Cmax, Tmax, T1/2 AUC phù hợp với tài liệu công bố [29] Do vậy, phƣơng pháp xây dựng áp dụng nghiên cứu TĐSH chế phẩm chứa TFV 63 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu đạt đƣợc mục tiêu đề xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng TFV huyết tƣơng ngƣời b ng k thuật sắc ký lỏng khối phổ, ứng dụng để đánh giá tƣơng đƣơng sinh học cho chế phẩm chứa TFV Dựa kết thực nghiệm, rút số kết luận sau:  Xây dựng th m định phương pháp phân tích: Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích định lƣợng TFV huyết tƣơng ngƣời b ng phƣơng pháp LC-MS/MS với thông số nhƣ sau: - Chất chuẩn nội: Acyclovir - Điều kiện khối phổ: Kiểu phổ khối MS/MS, nguồn ion hóa ESI (-) - Điều kiện sắc ký: + Cột: Luna C18 (150×4,6 mm; µm); + Pha động: MeOH : amoni bicarbonat10 mM (10:90, v/v) + Tốc độ dịng: 0,8 mL/phút; + Thể tích tiêm mẫu: 20 L Nhiệt độ autosampler: 20°C - Qui trình x lý mẫu: Hút 0,5 mL mẫu huyết tƣơng, thêm 0,25 mL dung dịch acid acetic 1M, thêm mL dung môi hữu MeCN Lắc, ly tâm 6000 vịng/phút x phút Lấy 0,5 mL dịch trong, bay dung mơi, hịa tan cắn 0,5 mL nƣớc tiêm sắc ký Đã tiến hành thẩm định đầy đủ theo hƣớng dẫn US-FDA EMA thẩm định phƣơng pháp phân tích thuốc dịch sinh học Kết thẩm định cho thấy, phƣơng pháp xây dựng có độ chọn lọc cao với TFV; có giới hạn định lƣợng dƣới thấp ng/mL (khoảng 1/100 Cmax mức liều 300 mg); khoảng nồng độ tuyến tính rộng (3 – 600 ng/mL) khoảng từ 1/100 – 1/50 Cmax đến – 3Cmax ; không bị ảnh hƣởng mẫu với giá trị CV đạt yêu cầu (< 15%); không bị nhiễm chéo; độ cao (giá trị trung bình 64 độ khác ngày từ 95,1% đến 106,1%); độ lặp lại tốt với CV 15%; tỷ lệ thu hồi hoạt chất cao ổn định (trên 74%) ổn định điều kiện bảo quản khác (6 nhiệt độ phịng, 47 autosampler, sau chu kì đơng - rã 90 ngày nhiệt độ -35 ± 5°C)  Xác định nồng độ TFV mẫu huyết tương người tình nguyện: Đã áp dụng phƣơng pháp để xác định đƣợc nồng độ TFV mẫu huyết tƣơng NTN thời điểm khác với liều 300 mg Kết cho thấy phƣơng pháp phân tích xây dựng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính phù hợp để định lƣợng nồng độ TFV mẫu huyết tƣơng ngƣời KIẾN NGHỊ Sau thực đề tài này, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Tiếp tục triển khai áp dụng phƣơng pháp nghiên cứu SKD TĐSH chế phẩm có chứa dƣợc chất TFV với hàm lƣợng khác nhau, chế phẩm đa thành phần có chứa TFV theo dỗi nồng độ TFV điều trị - K thuật LC-MS/MS có ƣu điểm vƣợt trội độ nhạy, tính đặc hiệu chọn lọc Do vậy, k thuật nên đƣợc áp dụng nghiên cứu SKD TĐSH, đặc biệt cho chế phẩm có hàm lƣợng, liều dùng thấp 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bộ Y tế (2012), Ho phân t ch, tập 2, tr.107-121, 295-318, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2010), Thông tƣ 08/2010/TT-BYT, Hướng dẫn b o c o số liệu nghiên cứu sinh dụng/tương ương sinh h c ăng ý thuốc Bộ Y tế (2009), Dược iển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, PL 14 Lê Thị La (2017), “Nghiên cứu ịnh lượng Indipamid huyết tương người LC-MS/MS phục vụ nh gi tương ương sinh h c” Luận văn Thạc s dƣợc học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Phạm Luận (2014), Phương ph p phân t ch sắc ý chiết t ch Nhà xuất Bách khoa Hà Nội, tr 28-99, 193-314, 364-368 Tạ Mạnh Hùng, Lê Thị Thu Huyền cộng (2013), “Hướng dẫn th m ịnh phương ph p sắc ý lỏng hiệu cao ể phân t ch thuốc huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương ương sinh h c”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, tập 11 (số 40), tr.1- II Tài liệu nƣớc A.C Moffat, J.V.Jackson, M.S.Moss, B.Widdop (2004), “Clar e’s Isolation and Indentification of Drug”, 2rd Edition, 681 Annesley, Thomas M (2003) "Ion Suppession in Mass Spectromerty" Clinical Chemistry 49 (7), 1041-1044 A.C Moffat, J.V.Jackson, M.S.Moss, B.Widdop (2004), “Clar e’s Isolation and Indentification of Drug”, 3rd Edition, Pharmaceutical Press 2003 10 ASEAN (2015), Asean guidances for the conduct of Bioequivalence studies 11 Benetto Hood, C; Long, MC; Acosta, E.P; “Development of a Sensitive and Specific Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Method for the Determination of Tenofovir in Human Plasma”; Rapid Communications in Mass Spectrometry 2007, 21, 2704 - 2716 12 Chemicalbook, 147127-20-6 13 Delahunty T., Bushman L., Fletcher C V.,“Sensitive assay for determining plasma tenofovir concentrations by LC/MS/MS” Journal of Chromatography B 830 (2006) 6-12 14 European Medicines Agency (2012), Guideline on bioanalytical method validation 15 FDA, Viread - full prescribing information http://labels.fda.gov 16 Food and Drug Administration-United states (2001), Guidance for industryBioanalytical method validation 17 Food and Drug Administration-United states (2003): Guidance for Industry – Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products – General Consideration 18 Food and Drug Administration-United states (2019), Guidance for industryBioanalytical method validation, Draft Guidance 19 Jullien, V.; Treluyer, J.M.; Pons, G “Determination of Tenofovir in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography With Spectrofluorimetric Detection”, Journal of Chromatography B 785 (2003) 377–381 20 Muluwa, M; Rheeder, M; Duplesis, L; “Development and Validation of High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for Determination of Tenofovir in Small Volumes of Human Plasma”; Journal of Chromatography B 2015 21 Narit Wiriyakosol, Apichaya Puangpech, Weerawut Manosuthi, Sasinapha Tomongkon, Chonlaphat Sukasem and Darawan Pinthong “A LC/MS/MS method for determination of tenofovir in human plasma and its application to toxicity monitoring” Journal of Chromatography B Volume 1085, 2018, Pages 89-95 22 P B Kandagal, D H Manjunatha, J Seetharamappa, and S S.Kalanur, “RP-HPLC method for the determination of tenofovir in pharmaceutical formulations and spiked human plasma,” Analytical Letters, 2008 23 Somenath Mitra (2003), Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry John Wiley & Sons Publication, 37-131 24 Sparidans, R.W.; Crommentuyn, K.M.L.; Schellens, J.H.M “Liquid Chromatographic Assay for the Antiviral Nucleotide Analogue Tenofovir in Plasma Using Derivatization With Chloroacetaldehyde”, Journal of Chromatography B 791 (2003) 227–233 25 Sentenac, S.; Fernandez, C.; Thuillier, “A Sensitive Determination of Tenofovir in Human Plasma Samples Using Reversed-Phase Liquid Chromatography Technol” Journal of Chromatography B 793 (2003) 317–324 26 Takahashi, M; Kudaka, Y; Okumura, N; Hirano, A; Banno, K and Kaneda, T; “Determination of plasma tenofovir concentrations using a conventional LCMS method,” Biological and Pharmaceutical Bulletin, 30 (2007) 1784 - 1786 27 The United states pharmacopoeia 38 (2015), Invitro and invivo evaluation of dosage forms; Assessment of Invivo bioequivalence Drug product guidelines,Vol.I, performance – , Bioavaiability, Bioequivalence and dissolution, Vol.I, 28 Venn, R.F.(2008), Principles and Practice of Bioanalysis, CRC Press, London 29 Xiang Xie, Rui Zhou, Peng Yu, “Selective determination of tenofovir in human plasma by LC-MS-MS method” Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 2016, 25 (9), 676 - 682 30 World Health Organization (2013), “Consolidated guidelines on the use of antiretroviral drugs for treating and preventing HIV infection”, p 91-155 31 Wilfried M.A Niessen (2006), Liquid Chromatography – Mass Spectrometry Third Edition, Taylor and Francis Group LLC, 23-150 PHỤ LỤC Phụ lục Kết khảo sát đƣờng chuẩn theo mơ hình weighting 1/x2 CC1 Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/mL) 3,0 6,0 15,1 30,2 60,4 120,8 302,1 604,1 TFV 40676 80635 200700 390344 834026 1624168 4089097 8133195 IS 2390746 2571659 2587407 2669585 2534633 2561551 2498653 2590719 TFV/IS 0,017 0,031 0,078 0,146 0,329 0,634 1,637 3,139 Độ (%) 102,3 97,2 97,6 92,6 104,7 101,0 104,4 100,2 PTHQ y = 0,0052 x + 0,0011; r = 0,9989 CC2 Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/mL) 3,0 6,0 15,1 30,2 60,4 120,8 302,1 604,1 TFV 41853 86912 208796 411641 886059 1745256 4521981 8916135 IS 2432503 2657400 2651716 2635159 2604251 2730317 2587285 2583449 TFV/IS 0,017 0,033 0,079 0,156 0,340 0,639 1,748 3,451 Độ (%) 102,2 98,4 94,9 94,4 103,0 96,8 105,8 104,5 PTHQ y = 0,0055 x + 0,0004; r = 0,9987 CC3 Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/mL) 3,0 6,0 15,1 30,2 60,4 120,8 302,1 604,1 TFV 44798 88049 214259 464041 912156 1859659 4482401 9114675 IS 2721310 2715965 2623719 2663033 2679177 2531131 2551245 2538719 TFV/IS 0,016 0,032 0,082 0,174 0,340 0,735 1,757 3,590 Độ (%) 102,5 97,1 94,8 100,2 97,6 105,0 100,3 102,5 PTHQ y = 0,0058 x - 0,0014; r = 0,9992 CC4 PL1 Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/mL) 3,0 6,0 15,1 30,2 60,4 120,8 302,1 604,1 TFV 44637 91011 224493 467062 831342 1906765 4760850 9815149 IS 2436510 2429223 2622351 2694460 2218212 2576302 2684319 2793079 TFV/IS 0,018 0,037 0,086 0,173 0,375 0,740 1,774 3,514 Độ (%) 99,3 103,5 95,0 96,6 104,7 103,4 99,2 98,3 PTHQ y = 0,0059 x + 0,0007; r = 0,9992 CC5 Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/mL) 3,0 6,0 15,1 30,2 60,4 120,8 302,1 604,1 TFV 48337 100611 247700 490874 1074844 2098266 5313123 10551844 IS 2417322 2553613 2668453 2642915 2632291 2675694 2628337 2552565 TFV/IS 0,020 0,039 0,093 0,186 0,408 0,784 2,021 4,134 Độ (%) 101,4 100,2 94,0 94,1 103,5 99,4 102,5 104,8 PTHQ y = 0,0065 x + 0,0001; r = 0,9989 PL2 Phụ lục Kết khảo sát độ xác khác ngày (n = 5) LLOQ (≈ ng/mL) Ngày LQC (≈ ng/mL) SQC (≈ 90 ng/mL) MQC (≈ 240 ng/mL) HQC (≈ 480ng/mL) Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độ Độ (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) 2,9 96,5 8,7 95,1 82,8 91,0 244,3 100,6 493,5 101,6 2,8 94,1 8,2 90,0 87,5 96,2 240,4 99,0 497,3 102,4 2,8 93,2 9,1 99,5 82,9 91,1 230,0 94,7 511,1 105,2 2,9 96,4 8,0 88,4 93,0 102,2 251,6 103,6 501,9 103,3 2,9 95,1 8,2 89,7 84,5 92,9 247,3 101,8 494,5 101,8 2,9 97,0 8,6 94,2 80,0 87,9 241,2 99,3 495,2 102,0 3,6 118,4 8,8 96,7 98,0 107,4 225,3 92,7 483,6 99,5 3,0 99,4 9,1 100,3 90,7 99,5 236,8 97,4 480,1 98,7 3,2 106,5 9,4 103,5 93,6 102,6 209,6 86,2 456,7 93,9 3,1 102,5 9,1 100,1 92,9 101,8 224,1 92,2 451,8 92,9 3,5 115,7 9,5 104,4 94,5 103,6 227,9 93,7 422,5 86,9 3,0 99,0 9,4 103,6 87,3 95,8 215,3 88,5 438,8 90,2 3,9 129,9 9,3 101,1 92,8 100,5 247,1 100,4 493,8 100,3 3,7 124,4 8,9 97,2 90,5 98,1 262,8 106,7 533,8 108,4 3,3 109,1 8,6 93,0 93,3 101,1 227,6 92,4 485,2 98,6 3,1 102,4 9,3 101,1 95,3 103,2 246,9 100,3 481,0 97,7 3,0 101,5 8,7 94,2 95,5 103,5 238,5 96,9 500,8 101,7 3,1 103,2 9,4 101,9 90,6 98,1 249,1 101,2 420,5 85,4 3,3 107,9 9,1 98,7 90,6 98,1 272,7 110,8 492,8 100,1 3,2 104,6 9,8 106,5 96,0 104,0 213,6 86,7 480,1 97,5 3,4 108,2 8,9 96,9 93,3 101,1 232,8 94,6 486,0 98,7 3,1 101,2 9,5 103,8 98,5 106,7 228,7 92,9 479,7 97,4 3,4 110,7 9,3 101,1 92,6 100,3 232,5 94,4 494,6 100,5 3,1 98,5 9,5 103,7 94,3 102,1 232,5 94,4 473,1 96,1 3,6 115,5 9,2 99,5 87,9 95,4 225,5 91,8 420,4 85,6 3,7 119,2 9,1 98,7 88,1 95,6 210,1 85,6 434,6 88,5 3,4 108,7 9,2 100,4 87,2 94,7 206,7 84,1 431,6 87,9 3,2 104,7 9,3 101,2 89,2 96,8 222,1 90,4 425,6 86,6 3,3 106,6 8,8 95,2 81,3 88,2 209,3 85,2 400,9 81,6 3,5 111,9 9,4 102,3 83,6 90,8 230,4 93,8 394,5 80,3 TB 106,1 - 98,7 - 98,3 - 95,1 - 95,7 CV 8,6 - 4,7 - 5,3 - 6,8 - 7,7 I II III IV V PL3 Phụ lục Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi IS STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 TB CV (%) Tỷ lệ thu hồi (%) Đáp ứng pic IS Trong huyết tƣơng Trong mẫu 2672064 2824380 2643534 2633697 2635714 2807753 2780738 2731080 2604963 2738469 2625427 2664220 2497836 2666157 2522491 2769779 2524073 2762110 2516896 2775369 2572975 2638825 2527493 2806263 2448258 2756084 2569642 2747779 2441746 2731245 2447312 2741516 2428303 2639552 2505926 2737132 2553633 2731745 3,7 2,2 93,5 PL4 Phụ lục Bản chấp thuận đề cƣơng nghiên cứu danh sách Hội đồng đạo đức PL5 PL6 PL7 PL8 ... tài: ? ?Xây dựng phương pháp định lượng Tenofovir huyết tương người sắc ký lỏng khối phổ? ?? với mục đích xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích phù hợp, đáp ứng quy định, định lƣợng đƣợc TFV mẫu huyết. .. là: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Tenofovir huyết tƣơng ngƣời b ng sắc ký lỏng khối phổ Ứng dụng định lƣợng Tenofovir huyết tƣơng ngƣời tình nguyện b ng phƣơng pháp vừa thẩm định. .. KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 1.2.1 Nguyên lý hoạt động thiết bị phân tích khối phổ Sắc ký lỏng khối phổ k thuật phân tích dựa kết hợp khả phân tách chất hệ thống sắc ký lỏng khả phân tích khối detector khối