Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương nhằm bước đầu đánh giá sinh khả dụng in vivo của viên nén felodipin tác dụng kéo dài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ QUỲNH NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NHẰM BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA VIÊN NÉN FELODIPIN TÁC DỤNG KÉO DÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ QUỲNH NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NHẰM BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA VIÊN NÉN FELODIPIN TÁC DỤNG KÉO DÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT MÃ SỐ 60720410 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2. TS. Nguyễn Xuân Trường HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng và sự chân thành, tôi xin được bày tỏ niềm biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phó trưởng phòng Quản lý khoa học, Trường Đại Học Dược Hà Nội và TS. Nguyễn Xuân Trường- Phó giám đốc Trung tâm Giám định Ma túy, viện Khoa học Hình sự, Bộ Công An - những người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân Tích và Độc chất – Trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị ở Trung tâm Giám Định Ma Túy – Viện Khoa học Hình Sự đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt, dạy bảo tận tình trong suốt những năm tôi học tập tại đây. . Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày 24 tháng 08 năm 2014 Học viên Ngô Thị Quỳnh Nga MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cương về Felodipin 3 1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa 3 1.1.2. Dược động học 4 1.1.3. Tác dụng dược lý 4 1.1.4. Chỉ định 5 1.1.5. Chống chỉ định 5 1.1.6. Liều lượng và cách dùng 5 1.1.7. Một số chế phẩm trên thị trường 6 1.2. Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong dịch sinh học 7 1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 13 1.3.1. Khái niệm sắc kí khí 13 1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng 13 1.3.4. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí khối phổ 14 1.4. Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học 17 1.4.1. Kỹ thuật xử lý mẫu 18 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Nguyên vật liệu thiết bị 21 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 21 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 21 2.2. Đối tượng nghiên cứu 22 2.3. Nội dung nghiên cứu 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1. Xây dựng phương pháp phân tích 22 2.4.2. Thẩm định phương pháp phân tích 24 2.4.4. Xử lý và biểu thị kết quả nghiên cứu 30 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1. Kết quả xây dựng phương pháp phân tích 31 3.1.1. Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội. 31 3.1.2. Khảo sát chương trình sắc ký 34 3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 35 3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 40 3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc. 40 3.2.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 45 3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 46 3.2.4. Tỷ lệ thu hồi 48 3.2.5. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 50 3.2.6. Độ ổn định 53 3.2.7. Bước đầu ứng dụng định lượng Felodipin trên mẫu thực 57 3.3. Bàn luận 62 3.3.1. Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích Felodipin bằng GC – MS. 62 3.3.2. Về xây dựng phương pháp định lượng. 62 3.3.3. Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng. 63 3.3.4. Về bước đầu đánh giá sinh khả dụng trên chó 64 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1. Kết luận 66 4.2. Kiến nghị. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMLO Amlodipin DC Dược chất FEL Felodipin GC Sắc kí khí HQC Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control Sample) HT Huyết tương HTT Huyết tương trắng IS Nội chuẩn (Internal Standard) LLOQ Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantitation) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LQC Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample) MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Medium Quality Control Sample) MS Phương pháp phổ khối lượng NIF Nifedipin RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) SKD Sinh khả dụng của thuốc TDSH Tương đương sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trường 6 Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng GC 7 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao. 10 Bảng 1.4 Cách tiêm mẫu trong sắc kí khí 15 Bảng 2.1 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2 25 Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương 25 Bảng 2.3 Cách chuẩn bị mẫu QC 26 Bảng 3.1 Thể tích dung môi chiết toluen khảo sát 37 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết 38 Bảng 3.3 Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp. 44 Bảng 3.4 Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính. 45 Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới 47 Bảng 3.6 Tỷ lệ thu hồi của IS 48 Bảng 3.7 Tỷ lệ thu hồi của FEL 49 Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày 50 Bảng 3.9 Độ đúng, độ chính xác khác ngày 51 Bảng 3.10 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau ba chu kì đông rã. 53 Bảng 3.11 Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng. 54 Bảng 3.12 Độ ổn định của mẫu sau xử lý 55 Bảng 3.13 Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 56 Bảng 3.14 Nồng độ FEL trong các mẫu thực 60 Bảng 3.15 Một số thông số dược động học của FEL trên chó 60 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hình Tên hình Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Felodipin 3 Hình 1.2 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí khối phổ 14 Hình 3.1 Sắc kí đồ hỗn hợp ba chất Fel, NIF, AMLO trong methanol 31 Hình 3.2 Phổ khối của Felodipin 33 Hình 3.3 Phổ khối của Nifedipin 33 Hình 3.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng 36 Hình 3.5 Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích chiết 39 Hình 3.6 Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng 41 Hình 3.7 Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng thêm IS 42 Hình 3.8 Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn FEL 43 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa tỉ lệ diện tích FEL /IS với nồng độ FEL trong huyết tương (ng/ml) 46 Hình 3.10 Sắc kí đồ mẫu huyết tương chó trước khi uống thuốc 58 Hình 3.11 Sắc kí đồ mẫu huyết tương chó tại thời điểm 2,5 giờ sau khi uống thuốc 59 Hình 3.12 Đường cong dược động học của chó sau khi uống viên Felutam 61 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch là bệnh khá phổ biến, là gánh nặng sức khỏe chính yếu, để lại nhiều tàn phế và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Trong đó, tăng huyết áp là bệnh rất tiêu biểu và thường gặp nhất. Nếu không được chẩn đoán và điều trị có thể gây ra các biến chứng và di chứng nặng nề, ảnh hưởng xấu đến chất lượng cuộc sống người bệnh, trở thành gánh nặng cho gia đình và cho xã hội. Do vậy, thuốc điều trị bệnh tim mạch cũng như tăng huyết áp ngày càng chiếm tỷ trọng lớn, có vai trò quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp dược phẩm trong và ngoài nước trong nhiều năm gần đây, dạng bào chế viên tác dụng kéo dài đã ra đời để phù hợp với đặc thù điều trị các bệnh tim mạch là phải sử dụng thường xuyên, lâu dài mà giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi nhiều nhất như: viên nén, viên nang, thuốc tiêm giải phóng kéo dài, giải phóng tại đích. Nhiều dược chất được dùng trong các dạng bào chế này như: diltiazem, lercanidipin, nicardipin, nifedipin, verapamil, metoprolol, felodipin…Ở nước ta, felodipin là một trong những thuốc đang được sử dụng rộng rãi, là chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu và đang được nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo dài. Để có thể đưa thuốc vào điều trị, theo quy định của Cục Quản lý Dược Việt Nam: thuốc dạng rắn của 12 dược chất và thuốc phóng thích có kiểm soát cần phải đánh giá sinh khả dụng hoặc tương đương sinh học. Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng quy trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích, định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu ). Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu 2 thường rất thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dược chất có thể bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tương tự với dược chất nên việc phân tách để định lượng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được xây dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phân tích thuốc trong dịch sinh học sử dụng sắc ký khí (GC). Nhưng ở Việt Nam, vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố. Để góp phần nghiên cứu SKD cuả một chế phẩm thuốc mới, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “xây dựng phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương nhằm bước đầu đánh giá sinh khả dụng in vivo của viên nén Felodipin tác dụng kéo dài” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương chó bằng GC-MS. 2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng Felodipin trong huyết tương chó sau khi cho chó uống viên felodipin 5 mg tác dụng kéo dài. [...]... 1.1: Mt s ch phm Felodipin trờn th trng Vit Nam [3], [6] STT Tờn bit Thnh dc phn Dng thuc Nh sn xut Viờn nộn 1 Enfelo-5 Felodipin phúng thớch chm-5mg Aegis., Ltd - Kibris Viờn nộn bao 2 Felodil ER Felodipin phim gii Korea United Pharm Inc phúng chm - Hn Quc 5 mg Felodipin 3 Stada 10 mg retard Felodipin Viờn nộn gii phúng chm Stadapharm GmbH c Felodipin 4 Stada 5 mg retard Felodipin Viờn nộn tỏc dng... Viờn nộn gii 5 Felutam Felodipin phúng cú kim soỏt Stadapharm GmbH c Cụng ty TNHH Dc phm Vellpharm Vit Nam Vit Nam Viờn nộn 6 Plendil Felodipin phúng thớch chm-5 mg 6 Astra Zeneca-Thy S 1.2 Mt s nghiờn cu nh lng Felodipin trong dch sinh hc Trờn th gii, nhiu phng phỏp ó c xõy dng nh lng FEL trong dch sinh hc c tng hp bng 1.2 v bng 1.3 sau: Bng 1.2 Mt s nghiờn cu nh lng Felodipin trong huyt tng bng GC... tỏc dng ca t trng, in trng i n detector Detector:cú nhim v chuyn cỏc ion ó n thnh tớn hiu in o bng h in t ca mỏy khi ph B x lý d liu: tớn hiu in t detector c khuch i trc khi chuyn thnh tớn hiu s phc v x lý d liu theo yờu cu khỏc nhau nh: ghi ph khi, so sỏnh vi th vin ph, nh lng, 1.4 Phng phỏp phõn tớch thuc trong dch sinh hc Trong cỏc nghiờn cu v Dc ng hc, Sinh kh dng, Tng ng sinh hcphng phỏp nh... thụng qua cỏc phn ng húa hc vi cỏc ion trong mụi trng ny -K thut ion húa in trng (Field ionization): L k thut s dng mt in trng mnh (8-12 kV) gia hai in cc to ra cỏc ion t cỏc phõn t pha khớ Cỏc phõn t mu pha khớ tin gn ti b mt in cc cú in th (+) cao Khi in trng b mt ny mnh, mt in t ca phõn t mu s chuyn vo in cc, kt qu l to thnh cation gc M+ Ion ny b in cc y v phớa in cc õm vi mt khe nh cỏc ion cú th... ú, khi tin hnh xõy dng mt phng phỏp phõn tớch thuc trong dch sinh hc cn chỳ trng ba vn c bn ú l: k thut x lý mu, k thut phõn tớch nh lng v cỏch tin hnh thm nh phng phỏp phõn tớch nhm m bo tin cy ca phng phỏp 1.4.1 K thut x lý mu Cỏc mu dch sinh hc (mỏu, huyt tng, nc tiu) thng cha mt t l ln cỏc protein lm cn tr kh nng phỏt hin v nh lng dc cht Vỡ vy mu phi c loi tp trc khi tin hnh phõn tớch Hin nay,... lý Tỏc dng h ỏp ng mch: Felodipin l thuc chn kờnh calci chm cú tớnh cht chn lc thuc nhúm dihydropyridin Felodipin lm gim trng lc ng mch (nht l trờn tiu ng mch), dn n tỏc dng gión mch gõy h huyt ỏp [1], [25], [29] Tỏc dng chng au tht ngc: Felodipin ci thin s cõn bng trong cung v cu oxy ca c tim Lu lng ng mch vnh cng nh lng cung cp oxy cho c tim tng lờn nh gión mch vnh Felodipin gim huyt ỏp ton thõn... chun : Felodipin (FEL): Chun lm vic, hm lng 99,76%, m 0,01% ca Vin Kim nghim thuc trung ng - Cht chun ni: + Nifedipin (NIF): Chun lm vic, hm lng 99,51%, m 0,02% ca Vin Kim nghim thuc trung ng + Amlodipin (AMLO): Chun lm vic, hm lng 99,71%, m 0,00% ca Vin Kim nghim thuc trung ng - Dung mụi húa cht: Methanol, toluen, n-hexan, t tiờu chun tinh khit dựng cho GC-MS - Huyt tng trng khụng cú Felodipin: c... chớnh xỏc trong ngy v khỏc ngy ỳng chớnh xỏc trong ngy Tin hnh phõn tớch cỏc lụ mu QC bao gm LQC, MQC v HQC trong cựng mt ngy, mi lụ mu lm 6 mu c lp Xỏc nh kt qu ca cỏc mu QC da vo ng chun chun b trong huyt tng trng, c tin hnh trong cựng mt iu kin ỳng c xỏc nh bng t l % giỏ tr nng tỡm thy so vi giỏ tr nng thc ỳng ca phng phỏp phi nm trong khong t 85%-125% chớnh xỏc c biu hin qua lch chun... k thut c bn ú l: ta protein, chit lng-lng, chit pha rn 1.4.1.1 K thut ta protein Nguyờn tc ca k thut l s dng tỏc nhõn to ta loi i phn lng ln protein cú trong nn mu Mt s thuc th gõy ta hoc loi protein l: - Acid mnh nh acid tricloroacetic, percloric, mui amoni sulfat hoc ion kim loi nh Zn+2 - Dung mụi hu c nh methanol, acetonitril 18 Kt ta protein l k thut n gin, kinh t v d tin hnh Tuy nhiờn nhc im... hcphng phỏp nh lng hot cht/cht chuyn húa trong dch sinh hc úng vai trũ rt quan trng, quyt nh n kh nng thnh cụng ca cỏc nghiờn cu ny So vi 17 cỏc phng phỏp phõn tớch thuc trong ch phm bo ch, phng phỏp phõn tớch thuc trong dch sinh hc cú nhiu im khỏc bit: ú l nn mu phc tp, khong nng bin thiờn rng, nng hot cht thp cú th n c ng/ml Ngoi ra lng mu thng rt ớt nờn khụng th tin hnh nh lng lp li nhiu ln v s lng . tài: xây dựng phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương nhằm bước đầu đánh giá sinh khả dụng in vivo của viên nén Felodipin tác dụng kéo dài với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và. THỊ QUỲNH NGA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NHẰM BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA VIÊN NÉN FELODIPIN TÁC DỤNG KÉO DÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC. thẩm định phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương chó bằng GC-MS. 2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng Felodipin trong huyết tương chó sau khi cho chó uống viên felodipin