Tiến hành chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn FEL và IS với phương pháp chiết lỏng – lỏng.
Khảo sát lựa chọn các dung môi chiết toluen, n-hexan, và hỗn hợp dung môi n- hexan-toluen (1:1) với các thể tích khác nhau của dung môi chiết theo quy trình được tóm tắt ở sơ đồ sau:
36
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong huyết tương
Khảo sát dung môi chiết:
Tiến hành phân tích 6 mẫu chuẩn FEL pha trong huyết tương trắng có nồng độ 20 ng/ml tương ứng với mỗi dung môi khảo sát sau: Toluen, n-hexan và hỗn hợp dung môi n-hexan-toluen (1:1), với thể tích dung môi là 3,0 ml, xử lý theo quy trình đã chọn. Ghi lại diện tích pic, song song tiến hành chạy sắc kí với mẫu FEL pha trực tiếp trong MeOH như ở phần khảo sát dung môi chiết ta được kết quả ở bảng 3.1:
Hỗn hợp chiết
V2 mL lớp dung môi trên
Cắn khô
Dung dịch trong tiêm GC-MS Lắc xoáy 30 giây +V1 mL Dung môi chiết. Lắc xoáy 10 phút. Ly tâm 3000v/phút x 10 phút Cô bằng khí Nitơ Gia nhiệt 40oC +50 µL methanol, lắc xoáy 60 giây, siêu âm
phút
Huyết tương 1mL + IS 50 µL
Dung môi chiết:
1. Toluen 2. n-hexan
37
Bảng 3.1.Kết quả khảo sát dung môi chiết
Dung
Môi chiết
Mẫu
Đáp ứng pic (×106)
Toluen n-Hexan n-Hexan-Toluen (1:1) FEL pha trực tiếp trong MeOH 1 12,782 - 8,002 17,478 2 12,976 - 9,227 17,6172 3 12,879 - 9,452 17,7504 4 13,793 - 9,778 18,0312 5 13,802 - 10,034 18,2628 6 13,826 - 10,221 18,3732 TB 13,343 - 9,452 17,919 Hiệu suất* (%) 89,4 - 63,3 100
* : Hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng 3/2,5
- : Hỗn hợp dung dịch bị keo vón lại trong quá trình chiết
Nhận xét: Từ thực nghiệm và kết quả trên chúng tôi thấy đối với dung môi n-hexan, hỗn hợp sau khi chiết hầu như đều bị keo vón nên không thể lựa chọn n-hexan làm dung môi chiết. Còn đối với toluen và hỗn hợp n-hexan-toluen (1:1) thì hiệu suất chiết của toluen tinh khiết (89.4%) tốt hơn nhiều so với khi trộn lẫn nó với n-hexan (63.3%). Do đó chúng tôi quyết định lựa chọn toluen làm dung môi chiết cho quy trình xử lý mẫu.
38
Khảo sát thể tích chiết: Tiến hành xử lý mẫu chuẩn FEL pha trong huyết tương trắng có nồng độ 20 ng/ml với điều kiện thay đổi thể tích chiết khác nhau, các điều kiện khác giữ nguyên (dung môi chiết toluen) theo quy trình khảo sát ở trên. Song song, pha trực tiếp FEL trong MeOH có nồng độ tương ứng với nồng độ FEL 400ng/ml thu được theo lý thuyết tại thời điểm chạy sắc kí qua quá trình chiết tách trong huyết tương (do mẫu được cô đặc lại 20 lần) và chạy sắc kí, ghi lại diện tích pic và tính toán, ta được kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.4.
Bảng 3.2. Kết quả hiệu suất thu được với các thể tích dung môi chiết toluen khảo sát Hiệu suất (%) Mẫu V1 (ml) 1,5 2,5 3 3.5 4 4.5 1 * 80,4 89,8 93,5 94,4 95,5 2 * 81,2 90,0 92,9 93,7 94,6 3 * 82,9 89,5 93,6 95,6 96,7 4 75,3 81,7 91,6 92,2 94,8 95,3 5 74,9 82,2 90,7 93,1 94,1 94,8 6 76,5 81,6 89,6 92,3 93,5 95,1 TB 75,6 81,7 90,2 92,9 94,35 95,3
Thời gian cô
mẫu (phút) 10-15 20-30 40-45 55-60 65-70 75-80
39
Hình 3.5. Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích dung môi
Nhận xét: Từ thực nghiệm và kết quả ở trên chúng tôi thấy: Khi dùng 1,5 ml Toluen để chiết thì tỷ lệ số mẫu bị nhũ hóa cao, khi tăng thể tích dung môi chiết từ 1,5 ml-3 ml hiệu suất chiết tăng lên rõ rệt, tiếp tục tăng thể tích chiết lên tới 4,5 ml tuy nhiên hiệu suất không tăng lên nhiều, trong khi đó thời gian cô mẫu lại tăng lên đáng kể. Do đó, dựa vào hiệu suất và thời gian cô mẫu phù hợp để đảm bảo cho quy trình chiết có hiệu suất cao và thời gian thực hiện quy trình ngắn, chúng tôi lựa chọn thể tích chiết V1 cho quy trình là 3 ml.
Theo kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi đã lựa chọn được phương pháp phân tích FEL trong dịch sinh học để tiếp tục tiến hành thẩm định phương pháp như sau:
- Quy trình xử lý mẫu:
Lấy 1 ml mẫu huyết tương cho vào ống nghiệm, thêm 50µl chuẩn nội (NIF 4 µg/ml) và 3 ml toluen, lắc xoáy ở tốc độ 35 Hz trong 5 phút, ly tâm 3000 vòng/phút x 10 phút. Hút 2,5 ml lớp dung môi hữu cơ ở phía trên, cô dưới dòng khí N2 tới cắn. Hòa tan cắn trong 50µl MeOH và chuyển sang lọ đựng mẫu. Tiêm 1µl vào cột sắc ký.
40
- Chương trình sắc ký:
+ Detector: MS.
+ Cột sắc ký: RTX-5MS, 30m, d=0,25mm, chiều dày pha tĩnh 0,25µm. + Chuẩn nội: Nifedipin
+ Điều kiện sắc ký.
o Nhiệt độ buồng tiêm: 270 oC.
o Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu 100 oC, giữ trong một phút, sau đó tăng lên đến 270 oC (Tốc độ tăng 20 oC/phút) giữ trong 10 phút.
o Khí mang: N2
o Tốc độ dòng khí mang: 1,2 ml/phút.
o Thể tích tiêm mẫu: 1 µl, chế độ không chia dòng.
o Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion mẹ có m/z=238 (FEL), m/z=284 (NIF).