Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát theo hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học [4] để đảm bảo phương pháp nghiên cứu là phù hợp. Tiến hành thẩm định trên các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu QC (Quality control sample) tự tạo.
Mẫu chuẩn:
+ Các dung dịch chuẩn gốc:Tiến hành cân chính xác một lượng tương ứng khoảng 20,0 mg chuẩn FEL hòa tan trong 100,0 ml MeOH để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ chính xác khoảng 200 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ FEL chính xác khoảng 400 ng/ml HT ( WS1) và 50 ng/ml HT (WS2).
+ Dung dịch chuẩn nội: Cân một lượng chính xác khoảng 40,0 mg Nifedipin chuẩn hòa tan trong 50 ml methanol. Hút 0,5 ml pha loãng trong 100,0 ml methanol để được dung dịch chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 4 µg/ml.
25
Bảng 2.1. Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2
Dung dịch Cách pha Nồng độ chính xác
khoảng
Chuẩn làm việc WS1
Lấy 20 µl dd chuẩn gốc + Huyết
tương trắng vừa đủ 10 ml 400 ng/ml Chuẩn làm việc
WS2
Lấy 1,25 ml dd WS1 + Huyết tương
trắng vừa đủ 10 ml 50 ng/ml
Từ các dung dịch chuẩn làm việc chuẩn bị các mẫu chuẩn FEL có nồng độ dự kiến 2-40 ng/ml HT theo bảng sau:
Bảng 2.2. Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương
Mẫu chuẩn S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/ml) 0.2 0.5 1 2 4 10 20 40 VWS1(µl) 0 0 0 0 10 25 50 100 VWS2(µl) 4 10 20 40 0 0 0 0 VHTT(µl) 996 990 980 960 990 975 950 900
Lắc xoáy trong 30 giây. Thêm vào các mẫu chuẩn 50 µl dung dịch IS. Lắc xoáy 30 giây.
26
Chuẩn bị mẫu kiểm tra (QC): Chuẩn bị các dung dịch làm việc WSQC1 (400 ng/ml HT) và WSQC2 (50 ng/ml HT) như mẫu chuẩn. Từ các dung dịch làm việc này chuẩn bị các mẫu chuẩn QC theo bảng sau:
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu QC
Mẫu Nồng độ (ng/ml) VWSQC1(µl) VWSQC2(µl) VHTT(µl)
LQC 0.5 0 10 990
MQC 20 50 0 950
HQC 30 75 0 925
Lắc xoáy trong 30 giây. Thêm vào các mẫu kiểm tra 50 µl dung dịch IS. Lắc xoáy 30 giây.
Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dd chuẩn làm việc độc lập.
2.4.2.1. Độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp
Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 6 mẫu chuẩn FEL trong huyết tương ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn và chuẩn nội (mẫu LLOQ). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu của FEL và IS [4].
2.4.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn FEL trong huyết tương có nồng độ từ 0,2-40 ng/ml như ở trên. Từ đáp ứng pic của FEL và IS ở các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic của FEL/IS và nồng độ của FEL có trong mẫu. Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r >0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả điểm nồng độ thấp nhất và nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm
27
trong khoảng từ 85%-115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%, đồng thời 4/6 điểm phải nằm trên đường chuẩn [4].
2.4.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Tiến hành phân tích 06 mẫu trắng, 06 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ FEL 0,2ng/ml). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu chuẩn/ mẫu trắng, tính nồng độ FEL có trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày. Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính từ đường chuẩn) với nồng độ thực.
Nồng độ được coi là LLOQ của phương pháp trên nếu sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho pic FEL tách biệt với các tạp, có độ đúng từ 80-120%; độ lặp lại với giá trị RSD ≤20% và đáp ứng pic ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng [4].
2.4.2.4. Độ đúng – độ chính xác trong ngày và khác ngày
Độ đúng – độ chính xác trong ngày
Tiến hành phân tích các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC trong cùng một ngày, mỗi lô mẫu làm 6 mẫu độc lập. Xác định kết quả của các mẫu QC dựa vào đường chuẩn chuẩn bị trong huyết tương trắng, được tiến hành trong cùng một điều kiện.
Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ % giá trị nồng độ tìm thấy so với giá trị nồng độ thực. Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng từ 85%-125%.
Độ chính xác được biểu hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các giá trị định lượng ở mỗi mức nồng độ được phân tích trong cùng một ngày. Độ chính xác phải có RSD≤15% [4].
28 Độ đúng – độ chính xác khác ngày
Tiến hành tương tự như xác định độ đúng, độ chính xác trong ngày. Tính RSD và tỷ lệ % tìm thấy trong ít nhất 3 ngày khác nhau. Yêu cầu giá trị RSD ≤15% và độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng từ 85%-115% [4].
2.4.2.5. Độ thu hồi hoạt chất và chất chuẩn nội
- Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội: xử lý 6 mẫu huyết tương trắng có chứa chất chuẩn nội ở nồng độ như đã khảo sát trong quy trình xử lý mẫu. Tiến hành phân tích, xác định diện tích pic của chất chuẩn nội. Song song, tiến hành phân tích mẫu chuẩn nội được pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) có nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu đã qua chiết tách với mẫu pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu .
- Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất: tiến hành phân tích các lô mẫu LQC, MQC, HQC không có IS. Mỗi lô mẫu làm 6 mẫu độc lập. Song song, tiến hành với các mẫu chuẩn pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) ở các nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi của FEL bằng cách so sánh đáp ứng pic FEL của mẫu QC đã qua chiết tách với các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua chiết tách) .
Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội hay FEL được xác định theo công thức sau:
Trong đó:
St : Diện tích pic của IS/FEL có trong mẫu đã qua chiết tách
Sc : Diện tích pic của IS/FEL của mẫu chuẩn pha trong dung môi chạy sắc ký n : Hệ số pha loãng của mẫu đã qua chiết tách
29
Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 30-110 %; RSD của các giá trị tỷ lệ thu hồi phải ≤15% và tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ±15%.
2.4.2.6. Nghiên cứu độ ổn định
Nghiên cứu độ ổn đinh của Felodipin trong huyết tương theo các chỉ tiêu sau: độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông, độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn, độ ổn định dài ngày và độ ổn định của mẫu sau xử lý ở hai lô LQC và HQC. Mỗi lô tiến hành 6 mẫu. Tính nồng độ của các mẫu dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng điều kiện.
- Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -40 OC và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi huyết tương tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại tủ đông đó trong khoảng 12-24 giờ, làm lặp lại 3 lần như vậy. Tiến hành xử lý và phân tích mẫu xác định nồng độ FEL có trong mẫu. So sánh nồng độ FEL xác định được trong mẫu xử lý và phân tích ngay sau khi pha. Kết quả lượng FEL có trong mẫu sau ba chu kỳ đông – rã và mẫu phân tích ngay sau khi pha phải khác nhau không có ý nghĩa thống kê [4].
- Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn: So sánh lượng FEL có trong mẫu được chiết tách ngay sau khi để rã đông và mẫu có nồng độ tương ứng sau khi đã để rã đông và để thêm 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Kết quả hai mẫu phải sai khác không có ý nghĩa thống kê [4].
- Độ ổn định dài ngày: Sau khi chuẩn bị, tiến hành bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 400C. Sau từng khoảng thời gian nhất định (bắt đầu và sau 15 và 30 ngày), tiến hành phân tích và xác định nồng độ FEL của các mẫu dựa trên đường chuẩn được phân tích cùng ngày. So sánh nồng độ hai hoạt chất trên trong các mẫu sau khi bảo quản ở các thời điểm với nồng độ FEL trong các mẫu được phân tích ngay sau khi chuẩn
30
bị. Mẫu phải ổn định tại điều kiện bảo quản trong khoảng thời gian tối thiểu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương [4].
- Độ ổn định của mẫu sau xử lý (độ ổn định trong auto-sampler ở nhiệt độ phòng): Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương ở nồng độ LQC và HQC, rồi xử lý theo quy trình đã xây dựng. Tiến hành phân tích và so sánh nồng độ của FEL trong mẫu ngay sau khi chiết tách và cùng mẫu đó nhưng để 12 giờ sau khi xử lý để trong auto-sample [4].
2.4.3. Ứng dụng định lượng trên mẫu thực
-Lựa chọn chó thí nghiệm. Cho mỗi chó uống 1 viên thuốc chứa dược chất cần phân tích. Tiến hành lấy mẫu huyết tương trong vòng 48 giờ. Lấy máu ở một thời điểm trước khi dùng thuốc và các thời điểm sau khi dùng thuốc như sau: 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 5,0; 6,0; 8,0; 10; 12; 24; 36; 48 giờ. Mẫu máu được chống đông bằng heparin và li tâm ngay để lấy huyết tương, bảo quản ở -40 oC. Khi phân tích, các mẫu được rã đông ở nhiệt độ phòng, thêm chuẩn nội và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng. Xác định nồng Felodipin trong các mẫu thử, dựa vào đường chuẩn xây dựng cùng ngày phân tích với hệ số r ≥ 0,99 tính nồng độ hoạt chất trong huyết tương. Xây dựng đường cong biến thiên nồng độ hoạt chất theo thời gian và xác định các thông số DĐH.