Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu…) thường chứa một tỉ lệ lớn các protein làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất. Vì vậy mẫu phải được loại tạp trước khi tiến hành phân tích. Hiện nay, để xử lý mẫu huyết tương người ta hay áp dụng ba kỹ thuật cơ bản đó là: tủa protein, chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn.
1.4.1.1. Kỹ thuật tủa protein
Nguyên tắc của kỹ thuật là sử dụng tác nhân tạo tủa để loại đi phần lượng lớn protein có trong nền mẫu. Một số thuốc thử để gây tủa hoặc loại protein là:
- Acid mạnh như acid tricloroacetic, percloric, muối amoni sulfat hoặc ion kim loại như Zn+2.
19
Kết tủa protein là kỹ thuật đơn giản, kinh tế và dễ tiến hành. Tuy nhiên nhược điểm của kỹ thuật này là nền mẫu thu được thường không sạch (vì trong mẫu còn có các thành phần không phải protein chưa được loại đi), mẫu bị pha loãng khi tủa bằng dung môi hữu cơ hoặc hoạt chất bị biến đổi khi thêm acid vào trong mẫu. Đặc biệt khi tiến hành phân tích định lượng bằng kỹ thuật khối phổ, các tạp chất còn lại trong nền mẫu có thể đồng rửa giải với chất phân tích gây nên hiện tượng khử ion (ion suppression) và làm suy giảm cường độ tín hiệu thu được. Ngoài ra do mẫu không sạch nên cột hay bị tắc và tuổi thọ của cột giảm.
Như vậy tùy thuộc vào bản chất lý hóa của hoạt chất và điều kiện phân tích cụ thể mà xem xét đến việc lựa chọn kỹ thuật này.
1.4.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
Nguyên tắc của kỹ thuật chiết lỏng – lỏng trong xử lý mẫu huyết tương là chuyển chất phân tích từ nền mẫu huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu cơ không đồng tan với nước. Các bước thực hiện cơ bản là:
- Chuyển chất phân tích sang dạng trung tính (các chất có bản chất base sẽ được kiềm hóa, các chất có bản chất acid sẽ được acid hóa).
- Dùng dung môi hữu cơ thích hợp để chiết chất phân tích. - Lắc, ly tâm và hút lấy lớp dung môi hữu cơ.
- Bốc hơi dung môi để thu cắn.
- Hòa tan cắn trong dung môi thích hợp (pha động) để tiêm sắc ký.
Như vậy, so với kỹ thuật tủa protein thì xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng phức tạp hơn và trong một số trường hợp cho tỉ lệ thu hồi thấp hơn. Những ưu điểm của kỹ thuật này là mẫu thu được tương đối sạch và có thể làm giàu mẫu (hòa tan cắn
20
trong một lượng nhỏ pha động để làm tăng nồng độ hoạt chất có trong mẫu). Trên thực tế, người ta có thể phối hợp giữa kỹ thuật tủa protein với kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để tăng hiệu quả của quá trình chiết tách mẫu (tăng độ sạch và khả năng thu hồi hoạt chất của mẫu).
Điểm quan trọng khi áp dụng kỹ thuật chiết lỏng- lỏng là chọn được hệ dung môi thích hợp, hòa tan được chất phân tích nhưng không hòa tan hoặc hòa tan rất ít tạp chất và dễ bay hơi. Trong thực nghiệm, các dung môi như dicloromethan, diethyl ether, tertbutyl ether, cloroform…hay được lựa chọn. Các dung môi này có thể dùng riêng rẽ hoặc phối hợp với tỉ lệ thích hợp tùy theo từng chất phân tích.
1.4.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE- solid phase extraction)
Đây là kỹ thuật được phát triển dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật tách sắc ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được rửa giải nhờ một hệ dung môi thích hợp).
Các bước thực hiện cơ bản là hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa tạp và rửa giải chất phân tích. Tiến hành bay hơi dung môi có trong dung dịch rửa giải để thu được cắn. Hòa tan cắn trong pha động, lọc và tiêm sắc ký.
Ngoài ra người ta cũng có thể chiết tách mẫu theo kiểu lưu giữ tạp chất trên cột và cho hoạt chất đi qua.
So với hai kỹ thuật trên, kỹ thuật SPE phức tạp nhất, đòi hỏi người phân tích phải được đào tạo và có kinh nghiệm trong việc chọn cột và dung môi thích hợp để rửa tạp và rửa giải. Tuy nhiên, kỹ thuật này có ưu điểm là nền mẫu thu được tương đối sạch, có thể làm giàu mẫu.
21
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
- Chất chuẩn :
Felodipin (FEL): Chuẩn làm việc, hàm lượng 99,76%, độ ẩm 0,01% của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.
- Chất chuẩn nội:
+ Nifedipin (NIF): Chuẩn làm việc, hàm lượng 99,51%, độ ẩm 0,02% của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.
+ Amlodipin (AMLO): Chuẩn làm việc, hàm lượng 99,71%, độ ẩm 0,00% của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.
- Dung môi hóa chất: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Methanol, toluen, n-hexan,...đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho GC-MS.
- Huyết tương trắng không có Felodipin: được lấy từ chó khỏe mạnh chưa dùng thuốc.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
- Máy sắc ký khí khối phổ Brucker Scion SQ, Mỹ. - Cân phân tích Sartorius (d= 0,1 mg; e = 0,1 mg), Đức. - Máy ly tâm EBA 20 – Hettich, Đức.
- Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí nitơ có gia nhiệt Reacti-Therm III (Thermo scientific), Mỹ.
- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP Scientifica (3000 vòng/phút), Đức. - Tủ lạnh sâu ( -40 oC), Sanyo MDF -236, Nhật.
22
- Bình định mức, dụng cụ thủy tinh (class A) dùng trong phân tích.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương trắng của chó không có Felodipin.
Mẫu tự tạo: Cho một lượng dung dịch Felodipin chuẩn vào huyết tương trắng, lắc xoáy 30 giây để được các mẫu có nồng độ thích hợp.
Viên thử: Felutam CR tablets (Vellpharm Co), số lô sản xuất 12005, hạn sử dụng 07.2015, hàm lượng ghi nhãn Felodipin 5 mg .
Mẫu thử: là các mẫu huyết tương chó sau khi cho uống thuốc. Súc vật: Chó khỏe mạnh, giống đực, cân nặng 9-10 kg.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương chó bằng phương pháp GC-MS: lựa chọn chất chuẩn nội, điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu để chiết tách FEL từ huyết tương.
Thẩm định phương pháp phân tích: thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu - chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng– độ chính xác, độ ổn định.
Ứng dụng định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương chó sau khi uống chế phẩm chứa Felodipin.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Xây dựng phương pháp phân tích
23
Dựa vào công thức hóa học, tính chất lý hóa của các chất để lựa chọn chất chuẩn nội (IS), đảm bảo IS bền vững, có thể tách chiết cùng chất phân tích, đồng thời phù hợp khi phân tích cùng felodipin. Dự kiến nội chuẩn lựa chọn gồm Nifedipin (NIF) và Amlodipin (AMLO) [12], [14],[17],[24]. Hai chất này được pha trong MeOH (800 µg/ml) sau đó được pha loãng bằng MeOH thành nồng độ 4 µg/ml và được tiêm trực tiếp vào máy GC-MS để xác định mảnh phổ và thời gian lưu cùng với FEL.
Pha hỗn hợp ba chất Felodipin (1 µg/ml), Nifedipin (4 µg/ml) và Amlodipin (4 µg/ml) trong MeOH và được tiêm trực tiếp vào máy GC để xác định diện tích pic và hình ảnh pic của ba chất, từ đó lựa chọn IS phù hợp.
2.4.1.2. Khảo sát chương trình sắc ký
Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống GC-MS với các điều kiện sắc ký như:
+ Cột mao quản, nhiệt độ cột, chương trình nhiệt độ.
+ Tiêm mẫu chia dòng, không chia dòng, nhiệt độ buồng tiêm. + Thể tích tiêm mẫu.
+ Detector, nhiệt độ Detector. +Lựa chọn khí mang: N2, H2, He. +Tốc độ khí mang.
2.4.1.3. Khảo sát quy trình xử lí mẫu
Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu, chiết tách felodipin từ huyết tương trên các mẫu chuẩn pha trong dung môi phù hợp; mẫu huyết tương trắng và các mẫu huyết tương chứa felodipin có nồng độ xấp xỉ Cmax,
24 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi hữu cơ (toluen, n-hexan, hỗn hợp toluen-n-hexan(1:1),…) [19].
Từ kết quả khảo sát, sơ bộ tiến hành lựa chọn phương pháp phân tích FEL gồm lựa chọn chất chuẩn nội, điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu phù hợp.
2.4.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát theo hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học [4] để đảm bảo phương pháp nghiên cứu là phù hợp. Tiến hành thẩm định trên các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu QC (Quality control sample) tự tạo.
Mẫu chuẩn:
+ Các dung dịch chuẩn gốc:Tiến hành cân chính xác một lượng tương ứng khoảng 20,0 mg chuẩn FEL hòa tan trong 100,0 ml MeOH để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ chính xác khoảng 200 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ FEL chính xác khoảng 400 ng/ml HT ( WS1) và 50 ng/ml HT (WS2).
+ Dung dịch chuẩn nội: Cân một lượng chính xác khoảng 40,0 mg Nifedipin chuẩn hòa tan trong 50 ml methanol. Hút 0,5 ml pha loãng trong 100,0 ml methanol để được dung dịch chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 4 µg/ml.
25
Bảng 2.1. Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2
Dung dịch Cách pha Nồng độ chính xác
khoảng
Chuẩn làm việc WS1
Lấy 20 µl dd chuẩn gốc + Huyết
tương trắng vừa đủ 10 ml 400 ng/ml Chuẩn làm việc
WS2
Lấy 1,25 ml dd WS1 + Huyết tương
trắng vừa đủ 10 ml 50 ng/ml
Từ các dung dịch chuẩn làm việc chuẩn bị các mẫu chuẩn FEL có nồng độ dự kiến 2-40 ng/ml HT theo bảng sau:
Bảng 2.2. Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương
Mẫu chuẩn S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/ml) 0.2 0.5 1 2 4 10 20 40 VWS1(µl) 0 0 0 0 10 25 50 100 VWS2(µl) 4 10 20 40 0 0 0 0 VHTT(µl) 996 990 980 960 990 975 950 900
Lắc xoáy trong 30 giây. Thêm vào các mẫu chuẩn 50 µl dung dịch IS. Lắc xoáy 30 giây.
26
Chuẩn bị mẫu kiểm tra (QC): Chuẩn bị các dung dịch làm việc WSQC1 (400 ng/ml HT) và WSQC2 (50 ng/ml HT) như mẫu chuẩn. Từ các dung dịch làm việc này chuẩn bị các mẫu chuẩn QC theo bảng sau:
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu QC
Mẫu Nồng độ (ng/ml) VWSQC1(µl) VWSQC2(µl) VHTT(µl)
LQC 0.5 0 10 990
MQC 20 50 0 950
HQC 30 75 0 925
Lắc xoáy trong 30 giây. Thêm vào các mẫu kiểm tra 50 µl dung dịch IS. Lắc xoáy 30 giây.
Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dd chuẩn làm việc độc lập. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2.1. Độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp
Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 6 mẫu chuẩn FEL trong huyết tương ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn và chuẩn nội (mẫu LLOQ). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu của FEL và IS [4].
2.4.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn FEL trong huyết tương có nồng độ từ 0,2-40 ng/ml như ở trên. Từ đáp ứng pic của FEL và IS ở các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic của FEL/IS và nồng độ của FEL có trong mẫu. Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r >0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả điểm nồng độ thấp nhất và nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm
27
trong khoảng từ 85%-115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%, đồng thời 4/6 điểm phải nằm trên đường chuẩn [4].
2.4.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Tiến hành phân tích 06 mẫu trắng, 06 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ FEL 0,2ng/ml). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu chuẩn/ mẫu trắng, tính nồng độ FEL có trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày. Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính từ đường chuẩn) với nồng độ thực.
Nồng độ được coi là LLOQ của phương pháp trên nếu sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho pic FEL tách biệt với các tạp, có độ đúng từ 80-120%; độ lặp lại với giá trị RSD ≤20% và đáp ứng pic ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng [4].
2.4.2.4. Độ đúng – độ chính xác trong ngày và khác ngày
Độ đúng – độ chính xác trong ngày
Tiến hành phân tích các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC trong cùng một ngày, mỗi lô mẫu làm 6 mẫu độc lập. Xác định kết quả của các mẫu QC dựa vào đường chuẩn chuẩn bị trong huyết tương trắng, được tiến hành trong cùng một điều kiện.
Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ % giá trị nồng độ tìm thấy so với giá trị nồng độ thực. Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng từ 85%-125%.
Độ chính xác được biểu hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các giá trị định lượng ở mỗi mức nồng độ được phân tích trong cùng một ngày. Độ chính xác phải có RSD≤15% [4].
28 Độ đúng – độ chính xác khác ngày
Tiến hành tương tự như xác định độ đúng, độ chính xác trong ngày. Tính RSD và tỷ lệ % tìm thấy trong ít nhất 3 ngày khác nhau. Yêu cầu giá trị RSD ≤15% và độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng từ 85%-115% [4].
2.4.2.5. Độ thu hồi hoạt chất và chất chuẩn nội
- Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội: xử lý 6 mẫu huyết tương trắng có chứa chất chuẩn nội ở nồng độ như đã khảo sát trong quy trình xử lý mẫu. Tiến hành phân tích, xác định diện tích pic của chất chuẩn nội. Song song, tiến hành phân tích mẫu chuẩn nội được pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) có nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu đã qua chiết tách với mẫu pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu .
- Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất: tiến hành phân tích các lô mẫu LQC, MQC, HQC không có IS. Mỗi lô mẫu làm 6 mẫu độc lập. Song song, tiến hành với các mẫu chuẩn pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) ở các nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi của FEL bằng cách so sánh đáp ứng pic FEL của mẫu QC đã qua chiết tách với các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua chiết tách) .
Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội hay FEL được xác định theo công thức sau:
Trong đó:
St : Diện tích pic của IS/FEL có trong mẫu đã qua chiết tách
Sc : Diện tích pic của IS/FEL của mẫu chuẩn pha trong dung môi chạy sắc ký n : Hệ số pha loãng của mẫu đã qua chiết tách
29
Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 30-110 %; RSD của các giá trị tỷ lệ thu hồi phải ≤15% và tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ±15%.
2.4.2.6. Nghiên cứu độ ổn định
Nghiên cứu độ ổn đinh của Felodipin trong huyết tương theo các chỉ tiêu sau: độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông, độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn, độ ổn định dài ngày và độ ổn định của mẫu sau xử lý ở hai lô LQC và HQC. Mỗi lô tiến hành 6 mẫu. Tính nồng độ của các mẫu dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng điều kiện.
- Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -40 OC và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi huyết tương tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại tủ đông đó trong khoảng 12-24 giờ, làm lặp lại 3 lần như vậy. Tiến hành xử lý và phân
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});