Xây dựng phương pháp định lượng gentoipicrin trong chế phẩm kem viêm da AD bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DỊU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DỊU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Ds Nguyễn Thị Quỳnh Nơi thực hiện: 1.Bộ mơn Hóa phân tích-Độc chất 2.Viện cơng nghệ Dược Phẩm Quốc Gia HÀ NỘI - 2014 Lời cảm ơn Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, hướng dẫn trực tiếp, bảo tận tình giải khó khăn giúp em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể thầy cô giáo mơn Hóa Phân Tích độc chất tạo điều kiện cho em bảo vệ khóa luận mơn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến DS Nguyễn Thị Quỳnh DS.Ngô Quang Trung, người trực tiếp giúp đỡ bảo em trình thực đề tài Em xin đồng cảm ơn thầy cô anh chị làm việc Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, thầy cô mơn Vật lý-hóa lý tạo điều kiện cho em tiến hành thực nghiệm phịng thí nghiệm Và khơng thể thiếu, em xin chân thành cảm ơn gửi lới chúc sức khỏe đến tồn thể thầy trường Đại học Dược Hà nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em suốt năm năm học trường Cuối cùng, em xin giửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, theo sát động viên em suốt thời gian qua Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 20 tháng năm 2014 Sinh viên NGUYỄN THỊ DỊU MỤC LỤC Danh mục kí hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ đồ thị Đặt vấn đề CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 1.2 1.3 Long đởm Kem Viemda AD Tổng quan phương pháp Sắc ký lỏng hiệu cao 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Cấu tạo hệ thống máy HPLC 1.3.3 Các thông số đặc trưng trình sắc ký yếu tố ảnh hưởng……………………………………………………………………… 1.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký sắc ký phân bố .10 1.3.5 Phương pháp định lượng HPLC .14 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG- HÓA CHẤT- THIẾT BỊ-NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Thiết bị - hóa chất .16 2.2.1 Thiết bị…………………………………………………………… 16 2.2.2 Hóa chất…………………………………………………………… 16 2.3 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 16 Nghiên cứu điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp 16 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin chế phẩm Kem Viemda AD 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Điều kiện xử lý mẫu 17 2.4.2 Điều kiện chạy sắc ký .18 2.4.3 Thẩm định phương pháp định lượng 19 2.4.4 Đánh giá kết quả…………………………………………………….22 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin……………23 3.1.1 Lựa chọn quy trình xử lý mẫu 23 3.1.2 Lựa chọn điều kiện chạy sắc ký 25 3.1.3 Kết lựa chọn…………………………………………………… 29 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng băng HPLC 29 3.3 Định lượng gentiopicrin mẫu thử kem Viemda AD…………….34 BÀN LUẬN……………………………………………………………… 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AD: Viêm da địa DĐVN IV: Dược điển Việt Nam IV HPLC: Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao DĐTQ: Dược điển Trung Quốc H2O: Nước MeOH: Methanol EtOH: Ethanol A: diện tích pic m : khối lượng cân tt/tt: thể tích thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Thành phần công thức kem Viemda AD 3.1 Kết khảo sát thời gian chiết mẫu 23 3.2 Kết khảo sát thời gian đun cách thủy 24 3.3 Kết khảo sát thành phần pha động 26 3.4 Kết khảo sát tốc độ dòng pha động 26 3.5 Kết tính thích hợp hệ thống 29 3.7 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 31 3.8 Kết độlặp lại phương pháp 32 3.9 Kết độ xác khác ngày phương pháp 33 3.10 Kết độ thu hồi phương pháp 34 3.11 Bảng định lượng gentiopicrin mẫu thử 34 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Cơng thức cấu tạo Gentiopicrin 1.2 Bao bì chế phẩm kem Viemda AD 1.3 Cấu tạo hạt silica silan hóa 11 1.4 Cấu trúc cột LC-DB 12 1.5 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 13 3.1 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc A/m vào thời gian chiết 24 3.2 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc A/m vào thời gian đun cách thủy 25 3.3 Sắc ký đồ chất phân tích tốc độ dòng chọn 28 3.4 Phổ hấp thụ cực đại chất phân tích 28 3.5 Sắc ký đồ mẫu placebo 30 3.6 Sắc ký đồ mẫu gentiopicrin chất chuẩn 30 3.7 Đồ thị mẫu Gentiopicrin kem Viemda AD 31 3.8 Đồ thị đường chuẩn gentiopicrin 32 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chế phẩm kem Viemda AD 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm da địa (còn gọi chàm thể tạng - Atopic dermatitis - AD), bệnh viêm da mạn tính, bệnh thường xuất trẻ em kéo dài đến tuổi trưởng thành, ngồi bệnh gặp người lớn [10] Chàm thể tạng bệnh liên quan đến yếu tố di truyền, miễn dịch môi trường Ngày nay, phát triển xã hội, ô nhiễm mơi trường làm cho bệnh chàm thể tạng có xu hướng tăng [6] Điều trị chàm thể tạng chưa có thuốc đặc hiệu, chủ yếu sử dụng corticosteroid với tác dụng chống viêm giảm phản ứng dị ứng Tuy nhiên, nhóm thuốc gây nhiều tác dụng phụ như: lệ thuộc thuốc, dị ứng thuốc, viêm nhiễm mắc kèm, Do vậycần phát triển thuốc có khả điều trị chàm thể tạng khơng có tác dụng phụ Một biện pháp nghiên cứu chế phẩm từ dược liệu Trong đó, Long đởm biết đến y học cổ truyền có tác dụng điều trị vàng da, viêm gan, viêm miệng, bệnh viên nhiễm khác [2], [4] Chế phẩm kem Viemda AD điều chế từ cao đặc long đởm có thành phần gentiopicrin nghiên cứu để dùng điều trị chàm thể tạng Để đưa thuốc vào sản xuất sử dụng cần đảm bảo yêu cầu chất lượng theo quy định Để góp phần vào cơng tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung tiêu chuẩn hóa chế phẩm sản xuất từ dược liệu nói riêng chúng tơi thực đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng gentiopicrin chế phẩm kem Viemda AD HPLC” Với mục tiêu: Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích gentiopicrin Kem viemda AD HPLC Thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin chế phẩm CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Long đởm Long đởm thuộc họ long đởm (gentianaceae) Trong hay dùng đơng y lồi Gentiana lutea Tại Việt Nam, có hai loài sử dụng làm thuốc G Loureirii phân bố cao nguyên Lang Biang - Đà Lạt - Lâm Đồng G Rigescens có Tây Nguyên [2] Vị thuốc Long đởm sử dụng thân rễ rễ, thu hái vào mùa thu mùa xuân, mùa thu tốt Đào lấy thân rễ rễ, rửa sạch, phơi âm can, cắt đoạn 2-3cm phơi sấy khô Theo Muscre’,[3] hàm lượng gentiopicrin rễ tươi đạt 2,48%, sấy tủ sấy tỉ lệ giảm 2,10%, rễ sấy gác bếp 1,61%, rễ lên men cịn lại vết Do đó, thu hái rễ long đởm cần rửa sấy khô sớm (dưới ngày) Thành phần hóa học rễ long đởm: - Dược liệu họ gentianaceae thường chứa iridoid glucosid monoterpen alcaloid Iridoid (chiếm khoảng 85% iridoid) xác định gentiopicrosid (gentiopicrin - C16H20O9), hàm lượng rễ khoảng 0,35% [5] - Ngồi cịn có: gentioflavin, gentisin, scabrosid, triflorosid Hàm lượng gentiocrosid phụ thuộc vào tuổi thời gian thu hái, cao đạt 7,8% (lúc tuổi), phần mặt đất đạt khoảng 1% [2] Gentiopicrin có cơng thức hóa học sau: Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo Gentiopicrin 27 Bảng 3.4: Kết khảo sát tốc độ dòng pha động Tốc độ dòng 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 12,733 11,564 10,364 9,534 8,923 168 183 203 221 234 (ml/phút) TR(phút) Áp suất cột (bar) Nhận xét:  Tốc độ dịng lớn thời gian lưu giữ chất phân tích giảm ( tR nhỏ)  Tốc độ dịng lớn áp suất cột cao: áp suất cột cao 200 bar dễ gây hỏng cột, kết không ổn định Từ kết trên, nhận thấy tốc độ dịng giảm áp suất cột giảm, lưu lượng dòng 1,0 ml/phút hệ MeOH : H2O (30 : 70) áp suất cột không cao (p = 168 bar) tR dài 12,7 phút; dùng hệ MeOH : H2O (35 : 75), tR hợp lý 6,08 phút lưu lượng lớn 1,4 ml/phút nên áp suất cột cao (221 bar) Do chúng tơi tiến hành chạy sắc ký với tỷ lệ pha động MeOH : H2O (35 : 65) tốc độ dòng 1,0ml/phút thu kết sắc ký đồ có tR = 8,146 phút (Hình 3.3), áp suất cột khoảng 169 - 173 bar 28 Hình 3.3: Sắc ký đồ gentiopicrin chuẩn điều kiện sắc ký lựa chọn  Phổ cực đại hấp thụ Tiến hành quét phổ hấp thụ pic gentiopicrin mẫu chuẩn điều kiện sắc ký khảo sát thu kết trình bày Hình 3.4 Hình 3.4: Phổ hấp thụ chất phân tích Từ phổ hấp thụ thu ta thấy gentiopicrin mẫu chuẩn cho cực đại hấp thụ bước sóng 270 - 275 nm Trong phạm vi đề tài lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại 270 nm tiến hành sắc ký  Kết quả: sắc ký tiến hành điều kiện:  Cột: Cột phân tích pha đảo Inertsil C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm)  Detector: UV 270 nm  Pha động: MeOH : H2O  Tỷ lệ pha động: 35 : 65  Tốc độ dịng: 1ml/phút  Thể tích tiêm mẫu: 10µl  Nồng độ gentiopicrin dung dịch mẫu tiêm: khoảng 0,2mg/ml 3.1.3 Quy trình phân tích Từ kết thu đề xuất quy trình phân tích 29 gentiopicrin kem Viemda AD sau: 1) Xử lý mẫu Cân lượng xác khoảng 0,5 g mẫu thử cho vào ống nghiệm 10 ml Thêm khoảng ml MeOH, lắc xoáy, siêu âm 20 phút, đậy giấy bạc, đun cách thủy 600C 15 phút Ly tâm, lấy phần dịch phía lọc qua màng lọc đường kính lỗ 0,45 µm, dịch lọc thu đem tiến hành sắc ký 2) Điều kiện sắc ký Cột Inertsil C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm) với thông số: detector UV 270 nm; tốc độ dòng 1ml/phút; pha động MeOH - H2O (35:65), thể tích tiêm 10 µl; nồng độ gentioptcrin dung dịch mẫu tiêm 0,2 mg/ml; thời gian phân tích 15 phút 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin điều kiện chọn trình bày mục 3.1.3  Kiểm tra tính thích hợp hệ thống Tiến hành chạy sắc ký lần liên tiếp mẫu gentiopicrin chuẩn pha dẫn pha dung dịch chuẩn mục 2.4.3 Kết trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5: Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống Lần RSD (%) TR 8,161 8,151 8,171 8,163 8,136 8,135 0,182 (phút) Diện tích 2539,79 2560,37 2560,18 pic (mAU*s) 2555,29 2566,61 2568,49 0,234 30 Nhận xét: RSD thời gian lưu 0,182 (