Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản

ĐẶT VẤN ĐỀ Cefixim là thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có nhiều ưu điểm nổi bật so với các cephalosporin thế hệ trước đó như tác dụng mạnh hơn với các chủng vi khuẩn Gram (), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khả năng khuyờ́ch tán tới các cơ quan mà các cepholosporin khác khó thâm nhập vào được và có thời gian bán hủy lâu hơn. Đặc biệt cefixim rất dễ hấp thụ và đạt được nồng độ điều trị trong máu bằng đường uống thay vì phải sử dụng đường tiêm như nhiều kháng sinh khác nờn rất dễ sử dụng. Chính vì thế trong vài năm trở lại đây Cefixim đã được sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam dưới nhiều dạng bào chế như viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch. Tuy nhiên, cefixim lại là một trong những kháng sinh có tỷ lệ thuốc kém chất lượng cao nhất. Trong năm 2008 và 2009, rất nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chỉ lưu hành vì không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng như viên bao phim Massime (cefixim 200 mg, Ấn Độ), viờn nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viờn nén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc). Hiện nay dược điển Việt Nam chưa có chuyờn luận về Cefixim, việc kiểm nghiệm chỉ dựa trên tiêu chuẩn cơ sở. Trong các dược điển BP 2008 và USP 32, cefixim được định lượng bằng kỹ thuật HPLC. Việc định lượng Cefixim trong huyết tương người bằng kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ưu điểm của kỹ thuật HPLC là có khả năng tách tốt, độ lặp lại và độ chính xác cao, tuy nhiên có nhược điểm là chi phí cao, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất độc hại. Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích hiện đại, đang được nghiên cứu và được đưa vào sử dụng tại nhiều nước trên thế giới với nhiều ưu điểm như hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn ít dung môi, ít độc hại. Cho đến nay, tại Việt Nam, điện di mao quản vẫn là một kỹ thuật khá mới trong lĩnh vực phân tích và đang được nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế. Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” với mục tiêu: 1. Xây dựng một chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương. 2. Định lượng hoạt chất này trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường cũng như xác định nồng độ hoạt chất này trong mẫu huyết tương thỏ nhằm phục vụ công tác nghiên cứu kiểm soát điều trị.

LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” là kết quả của quá trình học tập và nghiên cứu của bản thân tôi tại trường Đại học Dược Hà Nội trong suốt hơn hai năm qua. Để có được kết quả cuối cùng này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô tại trường đại học Dược Hà Nội, những người đã truyền đạt những kiến thức làm nền tảng cho tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Tử An, người đã dành rất nhiều tâm huyết, trí tuệ và thời gian giỳp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Phạm Thị Thanh Hà, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Phương, người đã nhiệt tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn bộ môn Phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội, trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm & Mỹ phẩm Hà Nội, phòng Kiểm nghiệm Viện Dinh dưỡng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đó luụn động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2009 Đỗ Lan Phương MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AUC : Diện tích dưới đường cong (Area Under Curve) BP : Dược điển Anh (British Pharmacopoeia) C max : Nồng độ thuốc tối đa (Maximum Concentration) CZE : Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) CE : Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) CPDASP : 3-[(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulphonat HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Perfomance Liquid Chromatography) IS : Chuẩn nội (Internal Standard) LOQ : Giới hạn định lượng ( Limit of Quantification) LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) MEKC : Sắc ký điện động Mixen ( Micellar Electrokinetic Chromatography) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol PA : Tinh khiết phõn tích (Pure for Analysis) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SDS : Sodium dodecyl sulfat SKS : Số kiểm soát S/N : Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise) STT : Số thứ tự TBAOH : Tetrabutyl amoni hydroxyd T max : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa TLTK : Tài liệu tham khảo USP : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia) DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Cefixim là thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có nhiều ưu điểm nổi bật so với các cephalosporin thế hệ trước đó như tác dụng mạnh hơn với các chủng vi khuẩn Gram (-), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khả năng khuyờ́ch tán tới các cơ quan mà các cepholosporin khác khó thâm nhập vào được và có thời gian bán hủy lâu hơn. Đặc biệt cefixim rất dễ hấp thụ và đạt được nồng độ điều trị trong máu bằng đường uống thay vì phải sử dụng đường tiêm như nhiều kháng sinh khác nờn rất dễ sử dụng. Chính vì thế trong vài năm trở lại đây Cefixim đã được sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam dưới nhiều dạng bào chế như viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch. Tuy nhiên, cefixim lại là một trong những kháng sinh có tỷ lệ thuốc kém chất lượng cao nhất. Trong năm 2008 và 2009, rất nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chỉ lưu hành vì không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng như viên bao phim Massime (cefixim 200 mg, Ấn Độ), viờn nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viờn nén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc). Hiện nay dược điển Việt Nam chưa có chuyờn luận về Cefixim, việc kiểm nghiệm chỉ dựa trên tiêu chuẩn cơ sở. Trong các dược điển BP 2008 và USP 32, cefixim được định lượng bằng kỹ thuật HPLC. Việc định lượng Cefixim trong huyết tương người bằng kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ưu điểm của kỹ thuật HPLC là có khả năng tách tốt, độ lặp lại và độ chính xác cao, tuy nhiên có nhược điểm là chi phí cao, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất độc hại. Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích hiện đại, đang được nghiên cứu và được đưa vào sử dụng tại nhiều nước trên thế giới với nhiều ưu điểm như hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn ít dung môi, ít độc hại. Cho đến nay, tại Việt Nam, điện di mao quản vẫn là một kỹ thuật khá mới trong lĩnh vực phân tích và đang được nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế. Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” với mục tiêu: 1. Xây dựng một chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương. 2. Định lượng hoạt chất này trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường cũng như xác định nồng độ hoạt chất này trong mẫu huyết tương thỏ nhằm phục vụ công tác nghiên cứu kiểm soát điều trị. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN Điện di mao quản (capillary electrophoresis: CE) là một kỹ thuật tỏch cỏc chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các tiểu phân trong mao quản chứa dung dịch chất điện ly nền dưới tác dụng của điện trường 1.1.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản [4], [6], [25], [37] Sơ đồ hệ thống điện di được trình bày ở hình 1.1 Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100 cm, đường kính trong 25 - 100 àm, đường kính ngoài 300 - 400 àm. Sử dụng áp suất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản. Điện thế một chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tỏch: cỏc chất phân tích được phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di chuyển về một đầu mao quản. Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diod DAD. Vị trí phát hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”. Cửa sổ này có được bằng cách đốt đi một đoạn lớp bao polyimid để mao quản đó trở thành ống thủy tinh trong suốt. 1.1.2. Đặc điểm của điện di mao quản [4], [6], [25], [37] - Có hiệu lực tỏch cỏc chất rất cao trong ống mao quản thủy tinh hoặc Teflon có đường kính trong 25 - 100 àm. - Điện thế rất cao, thường từ 10 - 30 kV (200 - 500 V/cm) được đặt ở hai đầu ống mao quản. - Số đĩa lý thuyết của cột mao quản rất lớn, thường từ 10 5 - 10 6 nên có khả năng tách rất tốt các mẫu chứa hỗn hợp phức tạp. - Thể tích mẫu tiêm rất nhỏ, cỡ 5 - 50 nl nên tiết kiệm mẫu. - Có rất nhiều kiểu CE nên khả năng ứng dụng vào thực tế rất đa dạng. - Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có mặt của chất điện ly nền nên rất kinh tế và không độc hại. - Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng khi phân tích số lượng mẫu lớn. 1.1.3. Phân loại điện di mao quản [4] Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau. Mỗi kiểu có cơ chế tách riêng. Bảng 1.1 tóm tắt 4 kiểu điện di hay được sử dụng trong phân tích. Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản Kiểu điện di Cơ chế tách 1. Điện di mao quản vùng (capillary zone elctrophoresis) Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộc điện tích và kích cỡ ion). 2. Sắc ký điện động mixen MEKC (micellar electrokinetic chromatography) Tương tác phân cực / không phân cực với hạt mixen trong dung dịch và linh độ của chất. 3. Điện di mao quản gel CGE (capillary gel electrophoresis) Linh độ của chất và tương tác loại cỡ với hạt gel. 4. Điện sắc ký mao quản CEC (capillary electrochromatography) Sự phân bố chất phân tích vào pha tĩnh (hạt nhồi) hoặc pha động (dung dịch điện ly nền) và linh độ khác nhau của các chất. Trong đó điện di mao quản vùng (CZE) là kiểu điện di đơn giản nhất, được sử dụng khá rộng rãi. Kỹ thuật CZE được sử dụng trong nghiên cứu này. 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM 1.2.1. Cấu trúc hóa học [3], [14] N S CH 2 HO O H H O N H O N N S H 2 N O OH O 3H2O 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 1 2 3 4 . - Công thức phân tử: C 16 H 15 N 5 O 7 S 2 .3H 2 O - Khối lượng phân tử: 507,5 - Tên khoa học: - Acid (6R,7R)-7-[(Z)-(2-amino-4-thiazolyl)-2- (carboxymethoxyimino)acetamido]-8-oxo-3-vinyl-5-thia-1- azabicyclo[4,2,0]-oct-2-ene-2-carboxylic trihydrat. 1.2.2. Tính chất vật lý [3], [14] Bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm, nóng chảy ở khoảng 220°C kèm phân hủy. Dễ tan trong methanol, propylen glycol, dimethyl sulfoxid, glycerin. Rất ít tan trong aceton, ethanol, nước. Không tan trong diethyl ether, ethylacetat, aceton và hexan. Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1mL H 2 O có pH từ 2,6 đến 4,1. Hệ số phân bố octanol/nước của cefixim trihydrat là 0,0029. Theo [14] cefixim trihydrat có 3 hằng số ion hóa: pK a1 = 2,10 do nhóm -COOH của cephem ở vị trí số 2, pK a2 = 2,69 do nhóm -NH 2 ở vị trí số 4 của nhóm amino-thiazol , pK a3 = 3,73 do nhóm -COOH của mạch nhánh gắn vào vị trí số 7. Cefixim trihydrat có 2 đồng phân Z và E trong đó đồng phân Z có phổ [...]... KẾT QUẢ 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP Phương pháp được xây dựng sao cho có thể định lượng được đồng thời cả cefixim ở trong chế phẩm và trong huyết tương Vì định lượng hoạt chất trong huyết tương gặp khó khăn hơn trong chế phẩm do phải loại protein và nồng độ hoạt chất trong huyết tương rất nhỏ do đó chúng tôi ưu tiên khảo sát các điều kiện điện di trong huyết tương sau đó thẩm định lại trong chế phẩm 3.1.1... của phương pháp và của thiết bị Do hàm lượng hoạt chất trong dịch sinh học rất thấp, mặt khác phải loại protein ra khỏi mẫu trước khi phân tích nên so với phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC thì định lượng trong huyết tương có một số khác biệt: nếu định lượng trong chế phẩm, pha động là hỗn hợp của MeCN và TBAOH, pH của pha động thường trung tính thì định lượng trong huyết. .. giá: Phương pháp này có ưu điểm là có độ chọn lọc cao, độ nhạy cao nên có thể ứng dụng để định lượng cefixim trong dịch sinh học qua đó nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm có chứa Cefixim Tuy nhiên phương pháp này phải dùng dung môi, hóa chất đắt tiền, và đôi khi phải xử lý mẫu tương đối phức tạp và mất nhiều thời gian * Phương pháp điện di mao quản [19] Định lượng cefixim. .. pháp điện di mao quản [19] Định lượng cefixim trong dịch sinh học bằng phương pháp điện di mao quản chưa được nghiên cứu nhiều so với các phương pháp khác, mới chỉ có 1 tài liệu nghiên cứu định lượng cefixim và các chất chuyển hóa của nó trong nước tiểu với một số chương trình sau: Bảng 1.5: Một số chương trình định lượng cefixim bằng điện di mao quản Điện thế Cột λ (nm) tm (phút) Dung dịch đệm (kV)... cao Trong hầu hết dược điển các nước đều đưa ra quy trình định lượng cefixim trong chế phẩm Các dược điển đều dùng sắc ký lỏng pha liên kết C18 có chiều dài khác nhau trong pha động TBAOH có pH 6,5 được điều chỉnh bằng H3PO4 và MeCN Bảng sau trình bày 1 số phương pháp trong các dược điển: 15 Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC 16 1.3.2 Các phương pháp. .. xây dựng quy trình định lượng CZE phù hợp để có thể vừa định lượng hoạt chất trong chế phẩm vừa định lượng hoạt chất trong huyết tương Lựa chọn điều kiện điện di và thẩm định phương pháp Ứng dụng định lượng hoạt chất trong chế phẩm và trong huyờ́t tương của thỏ dùng thuốc 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu Xây dựng phương pháp để định lượng cefixim trong chế phẩm và trong. .. hưởng bởi tá dược và các tạp chất Phương pháp này cũn cú ưu điểm là rất nhanh chóng, chỉ mất dưới 5 phút cho một mẫu do đó đây là phương pháp phân tích tốt để phân tích cefixim trong chế phẩm và trong dịch sinh học và có thể dùng thay phương pháp HPLC trong kiểm soát điều trị *Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đây là phương pháp thông dụng nhất trong các nghiên cứu định lượng Cefixim trong dịch sinh học... việt của điện di trong định lượng cefixim trong dịch sinh học 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG Có 3 phương pháp xử lý mẫu hay được sử dụng với các mẫu dịch sinh học: tủa protein với dung môi hữu cơ hoặc acid, chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn Tùy thuộc vào điều kiện của phòng thí nghiệm và đặc điểm của từng chất phân tích để lựa chọn phương pháp phù... chương trình điện di thích hợp, cụ thể là:  Xây dựng quy trình xử lý mẫu trong huyết tương  Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di  Xác định bước sóng ,  Xác định chất nôi chuẩn,  Thành phần hệ đệm: loại đệm, nồng độ đệm, pH,  Xác định điện thế,  Xác định điều kiện rửa mao quản 2.3.2.2 Thẩm định phương pháp Phương pháp phân tích đang xây dựng được thẩm định các tiêu chí sau: ... độ dòng điện qua mạch điện phân, E là điện thế đặt lên hai điện cực Phõn tích cefixim theo kỹ thuật Vụn-ampe trên nguyên tắc oxi hóa cefixim và quá trình khuyếch tỏn cú kiểm soát phụ thuộc vào pH Dùng đệm phosphat pH 4,5 cho phép phát hiện cefixim nồng độ 6.10 -6 đến 2.10-4 trong huyết tương, 8.10-6 đến 2.10-4 trong nước tiểu và 6.10-6 đến 10-4 trong sữa Nhận xét: Kết quả phân tích bằng phương pháp vụn-ampe . LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản là kết quả của quá trình học tập và nghiên cứu của bản thân tôi. với phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC thì định lượng trong huyết tương có một số khác biệt: nếu định lượng trong chế phẩm, pha động là hỗn hợp của MeCN và TBAOH,. bày 1 số phương pháp trong các dược điển: Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC 15 1.3.2. Các phương pháp ngoài Dược điển Bên cạnh các phương pháp chính