BÀN LUẬN
4.1. VỀ ỨNG DỤNG CE TRONG KIỂM SOÁT ĐIỀU TRỊ [36]
Ngày càng có nhiều thuốc được phân tích bằng phương pháp CE để phục vụ những mục đích khác nhau như: phân tích độc tính trong pháp y, kiểm tra độ tinh khiết hoặc nghiên cứu chuyển hóa thuốc. Kiểm soát điều trị (Therapeutic Drug Monitoring: TDM) là công việc phân tích định lượng thuốc phục vụ cho việc điều chỉnh liều ở từng bệnh nhân nhằm tối ưu hóa đáp ứng lâm sàng. CE có 4 ưu điểm khi ứng dụng trong TDM đó là: tốc độ, sự đơn giản, chi phí phân tích 1 mẫu thấp và có tính chọn lọc cao. Tuy nhiên có 3 nhược điểm nổi bật đó là chịu ảnh hưởng của hiệu ứng nền, độ nhạy kém và độ chính xác không được như mong muốn.
4.1.1. Độ nhạy
Hầu hết các thuốc được phân tích trong TDM đều có nồng độ trong huyết tương từ 1-30 àg/mL. Để có thể định lượng nồng độ thấp trong sự có mặt của protein với nồng độ cao (g/L), thuốc phải được làm tăng nồng độ ở bên ngoài hoặc ở bên trong mao quản. Một số thuốc như theophillin hay phenobarbital có thể xử lý mẫu đơn giản và dễ dàng nhưng cũng có những thuốc đòi hỏi phải quá trình chiết và cô đặc mẫu phức tạp. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn và thiết bị, hóa chất có nhiều hạn chế nên chúng tôi chưa có điều kiện nghiên cứu kỹ qui trình làm đặc mẫu qua đó cải thiện LOD và LOQ.
4.1.2. Hiệu ứng nền
Trong phân tích CE, độ phân giải và số đĩa lý thuyết bởi các chất nền có trong mẫu, đặc biệt là các ion vô cơ và các protein. Không giống như HPLC, hiệu ứng nền ảnh hưởng rất lớn tới sự phân tích mẫu do đó phân tích bằng CE với các chất chuẩn rất dễ nhưng phân tích trong huyết tương sẽ rất khó khăn.
Trong huyết tương chứa một lượng lớn protein (60 mg/mL)và muối (140 mmol/mL) . Muối làm pic bị doãng trong khi protein bám vào thành mao quản gây ra các phản ứng thứ cấp ảnh hưởng rất lớn đến độ lặp lại. Hiệu ứng này rất đáng kể khi lượng mẫu phân tích tăng nhiều.Để hạn chế hiệu ứng nền, chủng tôi tiến hành lọc mẫu qua màng lọc 0,2 àm sau khi đó dựng MeOH để loại bỏ protein, tuy nhiên không thể loại được muối do đó chúng tôi tiến hành dùng đệm phosphat pH 6,8 là đệm có sức ion lớn để làm giảm ảnh hưởng của muối trong huyết tương.
4.1.3. Độ chính xác và độ lặp lại
Với CE, 2 thông số quan trọng để đánh giá độ chính xác đó là diện tích pic (hoặc chiều cao pic) với phân tích định lượng và thời gian dịch chuyển cho phân tích định tính. Độ chính xác khi so sánh 2 thông số này thông thường kém hơn so với phương pháp HPLC.
Sự kém chính xác về diện tích hoặc chiều cao của pic do 2 yếu tố chính ảnh hưởng đó là lượng mẫu tiêm và hiệu ứng thành mao quản. Sự chính xác về diện tích pic hoặc chiều cao pic được đánh giá bởi thông số RSD. Thông thường trong các trường hợp thông số diện tích pic hay được dùng hơn do có độ chính xác cao hơn. Tuy nhiên, khi dùng nội chuẩn, độ chính xác đã được cải thiện, RSD của diện tích pic hiệu chỉnh thu được cũng nhỏ hơn 5%, tương đương với phương pháp HPLC [43]. RSD còn liên quan trực tiếp tới nồng độ hoạt chất trong mẫu, do đú dùng kỹ thuật cô đặc mẫu có thể cải thiện thêm thông số này. Tuy nhiên do thời gian nghiên cứu có hạn, mặt khác hệ số RSD =2,67% đã là khá tốt với phân tích dịch sinh học.
4.2. VỀ QUY TRÌNH CHIẾT LOẠI BỎ PROTEIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
4.2.1. Chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn
Chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn đã được ứng dụng nhiều trong HPLC và GC, cũng có thể ứng dụng để loại protein và muối trong mẫu huyết tương.
Phương pháp này có lợi là vừa làm sạch được mẫu, loại bỏ hiệu ứng nền vừa cô đặc được mẫu. Tuy nhiên trong trường hợp của cefixim, 2 phương pháp này bộc lộ nhiều nhược điểm.
Vì cefixim là chất phân cực nên không thích hợp với phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi không phân cực.
Chiết pha rắn có thể làm sạch mẫu và cô đặc được mẫu do đó cải thiện được LOD và LOQ. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi thời gian phân tích một mẫu khá lớn nên không phù hợp khi phân tích mẫu trong trường hợp bệnh nhân cấp cứu, mặt khác đầu tư trang thiết bị ban đầu và cột chiết pha rắn rất đắt nên không có tính kinh tế và không phù hợp với các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ.
4.2.2. Loại protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ
Hai dung môi hữu cơ thường được dùng để loại protein huyết tương là MeCN và MeOH.
MeCN vẫn thường xuyên được dùng để loại protein trong HPLC. Với kỹ thuật CE, ngoài loại protein, MeCN kết hợp với lượng NaCl cao trong mẫu (50 mmol/L) còn cho phép cô đặc mẫu tới 5-30 lần. Tuy nhiên trong quá trình làm thực nghiệm khi chiết cefixim trong huyết tương bằng MeCN hoặc hỗn hợp MeCN và MeOH với các tỉ lệ khác nhau chúng tôi không thu được kết quả như mong muốn.
Vì cefixim tan tốt trong MeOH nên MeOH rất thích hợp để tách loại protein khỏi huyết tương. Nếu dùng tỉ lệ thể tích huyết tương: MeOH = 1:1 thì mẫu chưa đủ sạch, cản trở quá trình phõn tớch, con nếu tỉ lệ này là 1:4 thì mẫu bị pha loãng quá nhiều do đó làm giảm độ nhạy của phương pháp do đó tỉ lệ 1:2 là hợp lý. Tuy nhiên khi dùng theo tỉ lệ này, huyết tương đã bị pha loãng ra 3 lần do đó làm giảm độ nhạy của phương pháp nên mặc dù chúng tôi đã tăng tối đa thời gian tiêm mẫu lên 10 giây xong LOQ thu được vẫn chỉ
là 1 àg/mL, chỉ thích hợp để nghiên cứu cá thể hóa điều trị, chưa thể dùng để nghiên cứu dược động hoặc và tương đương sinh học.
4.3. VỀ SO SÁNH 2 KỸ THUẬT HPLC VÀ CE VỚI PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT TRONG CHẾ PHẨM VÀ TRONG HUYẾT TƯƠNG TRONG CHẾ PHẨM VÀ TRONG HUYẾT TƯƠNG
4.3.1. Trong chế phẩm
Thực nghiệm đã cho thấy khi phân tích cefixim trong chể phẩm bằng phương pháp HPLC và phương pháp CE kết quả thu được là hoàn toàn tương đương, trong khi đó kỹ thuật CE dựng ớt hóa chất và dung môi đắt tiền và độc hại hơn do đó kỹ thuật này rất phù hợp để phân tích kiểm nghiệm chất lượng thuốc ở các cơ sở sản xuất, nghiên cứu cũng như tại các trung tâm kiểm nghiệm.
4.3.2. Trong huyết tương
Hiện nay trên thế giới cũng như tại Việt Nam chưa có một cụng tỡnh nào về nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương được công bố. Tuy nhiên các nghiên cứu trờn cỏc thuốc khác cho thấy nhìn chung kỹ thuật CE trong phân tích dịch sinh học có ưu điểm là nhanh hơn và dễ dàng thực hiện hơn, cho độ phân giải cao hơn với các chất có tính phân cực. Bên cạnh đó chi phí thực hiện một mẫu cũng ít hơn. Trái lại, kỹ thuật HPLC có ưu điểm là có độ tuyến tính, độ chính xác tốt hơn, đường nền đẹp hơn và giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tốt hơn.
Từ thực nghiệm phân tích cefixim trong huyết tương bằng kỹ thuật CE và so sánh với các phương pháp định lượng bằng HPLC chúng tôi nhận thấy về độ tuyến tính, tính chính xác và nhiễu đường nền là tương đương, tuy nhiên độ nhạy kém hơn. Với kỹ thuật HPLC, thông thường LOQ là 0,2 àg/mL trong khi với kỹ thuật CE chỉ số này là 1 àg/mL, do đó kỹ thuật này chỉ có thể dùng để nghiên cứu cá thể hóa điều trị mà chưa thể áp dụng để nghiên cứu dược động học và tương đương sinh học. Để nghiên cứu được cần khảo sát thêm qui trình chiết cũng như nghiên cứu kỹ thuật làm tăng nồng độ chất phân tích.