Chương 3 KẾT QUẢ
3.1.1.Khảo sát quy trình chiết cefixim trong huyết tương [8], [9], [14], [24], [27], [30], [36]
[24], [27], [30], [36]
Khảo sát qui trình chiết
Làm sạch huyết tương là bước cơ bản trong quá trình phân tích mẫu. Một điều quan trọng trong việc chuẩn bị mẫu huyết tương là loại bỏ các protein tan trong nước. Các phương pháp thông dụng là chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn và kết tủa protein. Do cefixim là một chất rất phân cực, tan trong nước và lưỡng tính nờn rất khó chiết khỏi huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng như với cefazolin, cephalothin, cefamandon, cefoxitin, cefuroxim, cefotaxim và cefoperazon hoặc chiết bằng cách tạo cặp ion với muối amoni bậc bốn như với cephalothin.
Phương pháp kết tủa protein thường cho lượng thuốc tìm lại cao hơn so với chiết lỏng-lỏng đối với các chất có độ phân cực cao. Do đó mẫu được loại protein bằng cách kết tủa protein. Tiến hành khảo sát kết tủa protein bằng một số kỹ thuật thông dụng:
Kết tủa bằng acid
Kết tủa protein bằng acid có ưu điểm hơn so với các phương pháp khác đó là mẫu thu được sạch hơn do loại protein tốt hơn.
Tiến hành kết tủa protein bằng một số loại acid : acid tricloracetic và acid percloric cho thấy với acid percloric, hoạt chất bị phân hủy do đó không tìm lại được cefixim trong mẫu sau khi loại bỏ protein. Khi chiết bằng acid tricloracetic 6% rất khó bốc hơi dung môi và làm khô, mặt khác nếu tiờm trực tiếp dịch chiết thì hình dáng pic không đẹp và giới hạn phát hiện rất cao.
Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Khảo sát chiết cefixim trong huyết tương bằng methanol, acetonitril và hỗn hợp methanol và acetonitril.
Khảo sát chiết cefixim bằng acetonitril ( tỉ lệ huyết tương: MeCN=1:2), đem mẫu sau khi xử lý đi phân tích thì nhận thấy đường nền thu được rất nhiễu, có rất nhiều pic tạp xuất hiện chứng tỏ mẫu chưa được làm sạch, một số pic tạp và cefixim không tách ra được khỏi nhau do đó phương pháp này không phù hợp để loại protein khỏi huyết tương.
Khảo sát chiết cefixim trong huyết tương với hỗn hợp MeCN: MeOH khác nhau đều nhận thấy đường nền thu được nhiễu, có nhiều pic tạp, và khi tỷ lệ MeCN quỏ lớn (gấp khoảng 10 lần MeCN) thì không còn phát hiện cefixim trong mẫu phân tích.
Khảo sát chiết cefixim bằng methanol thì kết quả thu được khả quan nhất do cefixim tan tốt trong methanol, mặt khác đường nền thu được đẹp, không bị nhiễu và không xuất hiện nhiều pic tạp. Mặt khác tiến hành khảo sát các tỉ lệ thể tích huyết tương và methanol khác nhau nhận thấy tỉ lệ huyết tương: MeOH = 1:2 cho kết quả tốt nhất vì nếu tỉ lệ này là 1:1 thì vẫn còn nhiều pic tạp còn nếu tỉ lệ này là 1:4 thì mẫu bị pha loãng quá nhiều dẫn đến LOQ và LOD cao.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và các mẫu
Dung dịch chuẩn:
- Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 1000 àg/mL: Cõn chớnh xác khoảng 28,2 mg chất chuẩn cefixim vào bình định mức 25 mL, thêm MeOH lắc cho tan, thêm MeOH cho đến vạch, đem lắc và siêu âm cho đồng nhất.
- Pha các dung dịch chuẩn cefixim có nồng độ thấp hơn từ dung dịch chuẩn cefixim 1000 àg/mL : bổ sung cho đủ thể tích bằng hỗn hợp MeOH và đệm phosphat pH 6,8 (tỷ lệ thể tích 2:8).
Mẫu chuẩn:
- Lấy 0,8 mL huyết tương trắng vào các ống nghiệm, thêm 100 àL dung dịch chuẩn, 0,1 mL IS được mẫu huyết tương có nồng độ mong muốn. Đem lắc xoáy 0,5 phút cho phân tán đều.
Mẫu trắng:
- Lấy chính xác 0,8 mL huyết tương, thêm 0,1 mL cefixim ở các nồng độ khác nhau và 0,1 mL chất nội chuẩn nồng độ 1 mg/mL, sau đó thêm chính xác 2,0 mL MeOH. Lắc xoáy 5 phút rồi đem ly tâm 10 phút (tốc độ 4000 vũng/phỳt). Lấy dịch, lọc qua màng lọc 0,2 àm được dịch lọc đem điện di.