c/ Định lượng cefixim trong huyết tương trong sự có mặt của một số thuốc khác
3.3.4. Định lượng cefixim trong huyết tương thỏ
Quy trình định lượng trong huyết tương thỏ
*Xử lý mẫu
Lấy mẫu máu: Vào các thời điểm thích hợp dùng kim bướm vô khuẩn luồn vào tĩnh mạch ở tai thỏ, cố định kim. Không lấy lại nhiều lần trên cùng một điểm, tránh làm vỡ hồng cầu. Sau khi lấy mẫu mỏu, cỏc mẫu được li tâm ở tốc độ cao 4000 vũng/ phỳt trong 10 phút. Tách riêng lấy phần huyết tương,
chia nhỏ vào các ống nghiệm và bảo quản ở -20oC cho tới khi đem phân tích.
Rã đông mẫu phân tích: Rã đông từ từ, ngâm ống nghiệm trong nước và lắc nhẹ, mẫu cần được phân tích ngay sau khi rã đông.
Làm sạch mẫu phân tích ( tủa và loại protein) : Thêm từ từ 2mL MeOH và 0,1 mL IS 0,1 mol/L vào 0,9 mL huyết tương, . Lắc xoáy trong 5 phút. Ly tâm 4000 vũng/phỳt. Lọc qua màng lọc 0,2 àm.
* Chương trình điện di:
Dung dịch đệm: natri phosphat pH 6,8,
Cột Agilent HPCE l = 40 cm, id = 50 àm,
Điện thế : 25 kV,
Detector: 283 nm,
Cân bằng mao quản (preconditioning): - 0,5 phút với SDS 10 mM,
- 0,5 phút với nước cất tinh khiết, - 1 phút với NaOH 0,1M,
- 0,5 phút với nước cất tinh khiết, - 2 phút với đệm,
Áp suất 50 mbar x 10 giây.
Xây dựng đường chuẩn
Cân chính xác khoảng 25 mg Cefixim, thờm 5 mL MeOH, thêm dung dịch đệm phosphat vừa đủ 25 mL ( dung dịch gốc 1). Chuẩn bị dãy dung dịch trong huyết tương trắng ( được rã đông và điều chỉnh đến nhiệt độ phòng) với các nồng độ từ 1 àg/mL đến 15 àg/mL (lấy 6 điểm) từ dung dịch gốc 1. Tiến hành xử lý mẫu như trên và điện di theo chương trình đã chọn. Từ kết quả thu được lập đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ (àg/mL) và diện tích pic (mAu.phỳt).
Tính toán kết quả
diện tích pic. Tính toán nồng độ hoạt chất trong mẫu đem đi phân tích dựa vào đường chuẩn đã xây dựng trên như sau:
Đường chuẩn được biểu diễn bằng phương trình y = ax + b trong đó y là đại lượng biểu diễn diện tích pic, x là đại lượng biểu diễn nồng độ.
Nồng độ hoạt chất trong huyết tương được tính theo công thức sau: x (àg/mL) = ( y + b ) /a.
Ứng dụng định lượng nồng độ hoạt chất trong huyết tương thỏ dùng thuốc
Thỏ được lựa chọn theo tiêu chí: cân nặng từ 2,2 đến 2,5 kg, khỏe mạnh
Thỏ được dùng thuốc như sau:
Tên thuốc: Tacoxim 200 ( cefixim 200 mg)
Nơi sản xuất: Yeva Therapeutics Pvt., Ltd - Ấn Độ SKS : VN-4089-07
Liều dùng: Tính toán liều dùng sao cho liều dùng này tương đương với người nặng 50 kg uống liều đơn 400 mg, cách tính theo [7] cụ thể như sau:
Vì người nặng 50 kg uống liều đơn 400 mg nên mỗi kg tương ứng với 8 mg, vì hệ số nội suy giữa thỏ và người là 3 nên mối kg thỏ phải tương ứng với 24 mg cefixim. Thỏ đều được chọn có cân nặng từ 2,2 -2,5 kg nên phải uống tương đương liều khoảng 50mg.
Lấy 2 viên Tacoxim 200 nghiền mịn, hòa tan trong 50 mL nước cất được dung dịch có nồng độ 8 mg/mL. Cho mỗi thỏ uống 6mL dung dịch trên.
Lấy mẫu và phân tích mẫu: Sau các khoảng thời gian nhất định lấy mẫu máu và xử lý mẫu theo đúng quy trình. Mẫu sau khi xử lý được phân tích theo chương trình điện di đã khảo sát. Kết quả thu được của 3 thỏ được trình bày trong bảng 3.20 và cỏc hỡnh từ 3.18 đến 3.21 sau:
Bảng 3.20: Kết quả định lượng cefixim trên huyết tương thỏ
STT Kết quả 1h 2h 3h 4h
Nồng độ (àg/mL) - 3,51 5,39 4,21 2 Tỉ số diện tích pic - 1,2540 1,3630 1,2966 Nồng độ (àg/mL) - 3,44 5,47 4,23 3 Tỉ số diện tích pic - 1,2567 1,3676 1,2992 Nồng độ (àg/mL) - 3,49 5,55 4,28 Nồng độ trung bình (àg/mL) - 3,48 5,47 4,24
Hình 3.18: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 1h uống thuốc
Hình 3.19: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 2h uống thuốc
Hình 3.20: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 3h uống thuốc
Hình 3.21: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 4h uống thuốc
Nhận xét: Như vậy so với phương pháp HPLC, phương pháp CE có thời gian thực hiện 1 mẫu ngắn hơn do quy trình xử lý mẫu đơn giản hơn, mặt khác chi phí cho việc thực hiện 1 mẫu phân tích theo phương pháp CE thấp
hơn do dựng ớt hóa chất và dung môi hơn do đó phương pháp CE rất phù hợp để định lượng hoạt chất trong huyết tương nhằm mục đích nghiên cứu cá thể hóa điều trị.