Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ TRỌNG ĐẠI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFACLOR TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ TRỌNG ĐẠI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFACLOR TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi. 2. TS. Đào Danh Sơn. Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất. 2. Công ty cổ phần tập đoàn Merap. HÀ NỘI - 2014 LỜI CÁM ƠN *** Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Đình Chi , đồng cảm ơn TS. Đào Danh Sơn , đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Đồng thời, tôi cũng chân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội; Công ty cổ phần tập đoàn Merap đã tận tình giúp đỡ và tạo những điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi xin phép được gửi những tình cảm sâu sắc và lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014 Đỗ Trọng Đại DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu/ Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1 HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao 2 US-FDA United State-Food Drug Administration Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ 3 TĐSH Bioequivalence (BE) Tương đương sinh học 4 SKD Bioavailability (BA) Sinh khả dụng 5 SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn 6 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối 7 SKĐ HPLC chromatography Sắc ký đồ 8 CFC Cefaclor 9 SSS Stock Standard Solution Chuẩn gốc 10 WSS Working Standard Solution Chuẩn làm việc 11 QC Quality Control Samples Mẫu kiểm tra chất lượng 12 HQC High Quality Control Samples Mẫu kiểm tra nồng độ cao 13 MQC Middle Quality Control Samples Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình 14 LQC Low Quality Control Samples Mẫu kiểm tra nồng độ thấp 15 LLOQ Lower Limit of Quantification Nồng độ dưới giới hạn định lượng 16 ULOQ Upper Limit of Quantification Nồng độ trên giới hạn định lượng 17 MeCN Acetonitril 18 MeOH Methanol 19 TB Mean Trung bình MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN…………………………………… 2 1.1 Tổng quan về cefaclor………………………………… 2 1.1.1 Công thức hóa học……………………………………… 2 1.1.2 Tính chất Hóa Lý………………………………………… 2 1.1.3 Dược lý, Dược động học ………………………………… 2 1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)…… 4 1.2.1 Cơ sở lý thuyết…………………………………………… 4 1.2.2 Một số đại lượng đặc trưng trong HPLC………………… 5 1.2.3 Ứng dụng của HPLC…………………………………… 7 1.2.4 Ứng dụng HPLC phân tích cefaclor trong dịch sinh học… 8 1.3 Thẩm đinh phương pháp pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học……………………………………… 11 1.3.1 Khái niệm………………………………………………… 11 1.3.2 Nội dungthẩm định phương pháp………………………… 11 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………. 15 2.1 Điều kiện thực nghiệm và nội dung nghiên cứu………. 15 2.1.1 Điều kiện thực nghiệm…………………………………… 15 2.1.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi………………………………. 15 2.1.1.2 Dụng cụ, thiết bị………………………………………………………. 16 2.1.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………… 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………… 17 2.2.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn cefaclor 17 2.2.2 Xây dựng quy trình chiết cefaclor trong huyết tương… 19 2.2.3 Xác định điều kiện sắc ký………………………………………… 21 2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích……………………………. 19 2.2.4.1 Tính đặc hiệu chọn lọc……………………………………………… 19 2.2.4.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính…………………………… 19 2.2.4.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)…………………………… 20 2.2.4.4 Độ đúng, độ lặp lại……………………………………………………. 20 2.2.4.5 Hiệu suất chiết (Tỷ lệ thu hồi)…………………………………. 20 2.2.4.6 Độ ổn định của mẫu thử trong huyết tương……………… 20 2.3 Phương pháp xử lý kết quả…………………………… 21 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……………… 22 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng…………………… 22 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký………………………………… 22 3.1.2 Khảo sát phương pháp chiết tách cefaclor…………………. 25 3.2 Thẩm đinh phương pháp phân tích……………………. 27 3.2.1 Độ đặc hiệu chọn lọc…………………………………… 27 3.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính……………………… 28 3.2.3 Giới hạn định lượng dưới LLOQ………………………… 30 3.2.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày………… 31 3.2.5 Hiệu suất chiết……………………………………………. 33 3.2.6 Độ ổn định của mẫu huyết tương………………………… 34 3.3 Bàn luận…………………………………………………. 36 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT…………………… 38 4.1 Kết luận………………………………… 38 4.2 Đề xuất………………………………………………… 39 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN Bảng 1.1 Một số quy trình định lượng cefaclor (trong dịch sinh học) bằng HPLC Bảng 2.1. Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2.2. Các thuốc thử và dung môi sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2.3. Các mẫu huyết tương trắng sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2.5. Cấu hịnh hệ thống HPLC Agilents 1260 Bảng 2.6. Cách chuẩn bị đường chuẩn mẫu huyết tương tự tạo Bảng 2.7. Cách chuẩn bị mẫu QC Bảng 3.1. Bảng so sánh các thông số của píc cefaclor trong dung dịch 10 µg/mL với các chất tạo cặp ion khác nhau Bảng 3.2. Sự tương quan giữa nồng độ và đáp ứng píc của cefaclor trong huyết tương Bảng 3.3. Kết quả xác định giới hạn dưới LLOQ Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày Bảng 3.6.Kết quả khảo sát hiệu suất chiết cefaclor Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã Bảng 3.8. Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương thời gian ngắn Bảng 3.9. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN Hình 1. 1 .Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. Hình 3.1. SKĐ chuẩn cefaclor 10 µg/mL ở nồng độ đệm 10 mM trong pha động Hình 3.2. SKĐ chuẩn cefaclor 10 µg/mL ở nồng độ đệm 50 mM trong pha động Hình 3.3. SKĐ chuẩn cefaclor nồng độ 10 µg/mL không có chất tạo cặp ion Hình 3.4. SKĐ chuẩn cefaclor nồng độ 10 µg/mL có chất tạo cặp ion: (a) tetrabutyl ammonium hydroxgen sulfat; (b) triethanolamin Hinh 3.5 Sắc ký đồ mẫu huyết tương tủa protein bằng MeCN Hình 3.6.a. SKĐ mẫu huyết tương tủa protein bằng axit pechloric. Hình 3.6.b. SKĐ mẫu huyết tương tủa protein bằng axit tricloroacetic. Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu (a) huyết tương trắng và (b) cefaclor 10,0 µg/mL trong huyết tương trắng Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và đáp ứng píc của cefaclor trong huyết tương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cefaclor là kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ hai, có nhiều ưu điểm nổi bật như tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram (-) và bền với các men - lactamase của vi khuẩn, do vậy có thể tránh được sự đề kháng thuốc Cefaclor được sử dụng trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn nhạy cảm với thuốc, điều trị viêm nhiễm trùng đường hô hấp trên, nhiễm khuẩn tai mũi họng, đặc biệt là viêm tai giữa, viêm xoang [5]. Ngày nay cefaclor đã được sản xuất trong nước dưới dạng bào chế viên nang như viên nang cefaclor Stada 250 mg của công ty STADA Việt Nam, viên nang Mekocefaclor 250 công ty Cổ phần Hóa-Dược Mekophar Cefaclor cũng là thuốc có tên trong Danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu thử tương đương sinh học khi đăng ký thuốc do Bộ y tế ban hành [6]. Tại Việt Nam đã công bố quy trình xử lý mẫu và định lượng cefaclor trong huyết tương người tình nguyện bằng HPLC [8]. Tuy nhiên, việc áp dụng tại quy mô phòng thí nghiệm vừa và nhỏ, cơ sở vật chất còn thiếu thốn tại các Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Mỹ phẩm tuyến tỉnh và các công ty sản xuất thuốc trong nước là còn khó khăn. Hướng tới mục tiêu nâng cao chất lượng và hiệu quả điều trị của thuốc cefaclor sản xuất trong nước thì các đơn vị kiểm nghiệm đều muốn được chủ động phân tích, giám sát nồng độ cefaclor trong huyết tương người. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu chính: 1. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu, khảo sát điều kiện sắc ký và định lượng cefaclor trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Cefaclor 1.1.1. Công thức hóa học - Công thức phân tử: C 15 H 14 ClN 3 O 4 S.H 2 O [9],[11] - Khối lượng phân tử: 367,8g/mol [ 9] - Công thức cấu tạo:[9],[13] - Tên khoa học: (6R,7R)-7-[[(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3- chloro-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic monohydrat [16] 1.1.2. Tính chất hóa lý - Bột trắng hoặc vàng nhẹ. - Khó tan trong nước (10g/L), thực tế không tan trong methanol và methylene chlorid, chloroform, benzene (0,5g/L). - Nhiệt độ nóng chảy dạng khan: 220 0 C - Hằng số phân ly: pKa1= 1,5; pKa2 = 7,17; - Hệ số phân bố dầu nước logP (octanol/nước) = 0,35 [12] nên việc chiết cefaclor trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng là khó khăn. - Cefaclor hấp thu bước sóng UV có λ max = 263 nm, do vậy có thể định lượng cefaclor bằng HPLC với detector tử ngoại [3],[12],[20]. - Ổn định pH 2,5 - 4,5 [7],[9],[12],[16]. 1.1.3. Dược lý, dược động học *Dược động học: Cefaclor được hấp thu tốt khi uống lúc đói. Với liều 250 mg và 500 mg uống lúc đói, C max đạt 13 µg/mL sau 60 phút. [...]... dung nghiên cứu * Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng phương pháp HPLC: - Lựa chọn điều kiện chiết tách cefaclor: tiến hành khảo sát các cách xử lý mẫu như: tủa protein trên các mẫu huyết tương tự tạo để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp dựa trên các nguyên lý chiết mẫu - Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách cefaclor ra khỏi các... thành phần tạp trong huyết tương, cho phép định lượng cefaclor có trong mẫu với nồng độ chính xác thích hợp * Thẩm định phương pháp phân tích về các chỉ tiêu: Tính đặc hiệu, chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng, hiệu suất chiết, độ ổn định của cefaclor trong huyết tương trong các điều kiện (rã đông, cách ngày…) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo... ghép nối với khối phổ MS/MS… Ngày nay HPLC còn cho phép định lượng các thành phần có hàm lượng thấp, thậm chí các thành phần dưới dạng vết trong hỗn hợp phức tạp Các phương pháp định lượng gồm có: 8 + Phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn) + Phương pháp thêm đường chuẩn + Phương pháp nội chuẩn + Phương pháp chuẩn hóa diện tích 1.2.4 Ứng dụng HPLC phân tích cefaclor trong dịch sinh học Những năm vừa qua... huyết tương + 250 µL trichloroactic 6%, lắc xoáy 30s Ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút Lấy dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,2 µm, tiêm sắc ký 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1 Độ đặc hiệu chọn lọc Tiến hành phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn (nồng độ 10,0 µg/mL cefaclor trong huyết tương) theo phương pháp đã được xây dựng Trên SKĐ 28 (b) Cefaclor của chuẩn cefaclor trong huyết tương thì píc cefaclor. .. 2.3 Phương pháp xử lý kết quả - Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy được xác định bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 - Nồng độ cefaclor trong mẫu chuẩn được xây dựng trong mỗi ngày phân tích 22 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký Dựa vào những đặc tính hóa-lý của cefaclor. .. 500 - Chuẩn bị mẫu giới hạn định lượng dưới LLOQ 0,5 µg/mL như sau: Dùng micropippette lấy chính xác 100 µL dung dịch chuẩn làm việc WSS1, pha loãng bằng huyết tương trắng vừa đủ 1 mL 19 2.2.2 Xây dựng quy trình chiết cefaclor trong huyết tương Một điều quan trọng trong việc phân tích dược chất trong mẫu mẫu huyết tương là loại bỏ các protein tan trong nước Các phương pháp thông dụng kết tủa protein;... độ Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn đã xây dựng trong cùng điều kiện So sánh giá trị trung bình các lần định lượng tại mỗi nồng độ với giá trị thực b Độ lặp lại - Độ lặp lại trong ngày: Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán RSD giữa các lần định lượng của... tiến hành định lượng các mẫu chuẩn pha trong dung môi không qua giai đoạn chiết tách, có nồng độ tuơng ứng với các mẫu QC So sánh kết quả đáp ứng của cefaclor trong mẫu QC pha trong huyết tương (có qua chiết tách) với đáp ứng của cefaclor trong mẫu pha trong dung môi (không qua chiết tách) 2.2.4.6 Độ ổn định của mẫu thử trong huyết tương 21 a Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông rã Khảo sát độ ổn định sau 3... tỉnh - Phương pháp xử lý mẫu: Do cefaclor có hệ số cân bằng dầu nước bằng 0,35 nên khó dùng phương pháp chiết cefaclor trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ vì vậy các tài liệu tham khảo trên đều xử lý mẫu với kỹ thuật cơ bản là loại protein trong huyết tương bằng các tác nhân tạo tủa như MeOH, hỗn hợp acid fomic: MeOH, acid pecloric, hay axit tricloroacetic… 11 Đối với quy trình xử lý mẫu bằng chiết... tương đối phức tạp và chi phí cao Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nước ta việc áp dụng phương pháp này thực tế còn gặp nhiều khó khăn do ít phòng thí nghiệm có đủ kinh phí để mua cột, trang thiết bị chiết pha rắn và kinh nghiệm sử dụng phương pháp chiết cột pha rắn còn hạn chế Trên cơ sở tham khảo các phương pháp định lượng đã được công bố, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng cef trong . tiêu chính: 1. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu, khảo sát điều kiện sắc ký và định lượng cefaclor trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng. 2 . sát nồng độ cefaclor trong huyết tương người. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng sắc ký. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFACLOR TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ TRỌNG ĐẠI XÂY DỰNG PHƯƠNG