Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng HPLC

Hướng tới mục tiêu nâng cao chất lượng và hiệu quả điều trị của thuốc cefaclor sản xuất trong nước thì các đơn vị kiểm nghiệm đều muốn được chủ động phân tích, giám sát nồng độ cefaclor

ĐỖ TRỌNG ĐẠI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFACLOR TRONG HUYẾT TƯƠNG

BẰNG HPLC

HÀ NỘI - 2014

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFACLOR TRONG HUYẾT TƯƠNG

1 Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

2 Công ty cổ phần tập đoàn Merap

HÀ NỘI - 2014

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lê Đình Chi, đồng cảm ơn TS Đào Danh Sơn, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Đồng thời, tôi cũng chân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội; Công ty cổ phần tập đoàn Merap đã tận tình giúp đỡ và tạo những điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi xin phép được gửi những tình cảm sâu sắc và lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014

Đỗ Trọng Đại

1 HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 US-FDA United State-Food Drug

Administration

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ

11 QC Quality Control Samples Mẫu kiểm tra chất lượng

Samples

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

Quantification

Nồng độ trên giới hạn định lượng

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN……… 2

1.1 Tổng quan về cefaclor……… 2

1.1.1 Công thức hóa học……… 2

1.1.2 Tính chất Hóa Lý……… 2

1.1.3 Dược lý, Dược động học ……… 2

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)…… 4

1.2.1 Cơ sở lý thuyết……… 4

1.2.2 Một số đại lượng đặc trưng trong HPLC……… 5

1.2.3 Ứng dụng của HPLC……… 7

1.2.4 Ứng dụng HPLC phân tích cefaclor trong dịch sinh học… 8 1.3 Thẩm đinh phương pháp pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học………

11 1.3.1 Khái niệm……… 11

1.3.2 Nội dungthẩm định phương pháp……… 11

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………

15 2.1 Điều kiện thực nghiệm và nội dung nghiên cứu……… 15

2.1.1 Điều kiện thực nghiệm……… 15

2.1.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi……… 15

2.1.1.2 Dụng cụ, thiết bị……… 16

2.1.2 Nội dung nghiên cứu……… 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 17

2.2.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn cefaclor 17

2.2.2 Xây dựng quy trình chiết cefaclor trong huyết tương… 19

2.2.3 Xác định điều kiện sắc ký……… 21

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích……… 19

2.2.4.1 Tính đặc hiệu chọn lọc……… 19

2.2.4.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính……… 19

2.2.4.6 Độ ổn định của mẫu thử trong huyết tương……… 20

2.3 Phương pháp xử lý kết quả……… 21

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……… 22

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng……… 22

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký……… 22

3.1.2 Khảo sát phương pháp chiết tách cefaclor……… 25

3.2 Thẩm đinh phương pháp phân tích……… 27

3.2.1 Độ đặc hiệu chọn lọc……… 27

3.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính……… 28

3.2.3 Giới hạn định lượng dưới LLOQ……… 30

3.2.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày………… 31

3.2.5 Hiệu suất chiết……… 33

3.2.6 Độ ổn định của mẫu huyết tương……… 34

3.3 Bàn luận……… 36

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 38

4.1 Kết luận……… 38

4.2 Đề xuất……… 39 PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Một số quy trình định lượng cefaclor (trong dịch sinh học) bằng

HPLC

Bảng 2.1 Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Các thuốc thử và dung môi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.3 Các mẫu huyết tương trắng sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.3 Kết quả xác định giới hạn dưới LLOQ

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày

Bảng 3.6.Kết quả khảo sát hiệu suất chiết cefaclor

Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ

đông - rã

Bảng 3.8 Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương thời gian ngắn Bảng 3.9 Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

Hinh 3.5 Sắc ký đồ mẫu huyết tương tủa protein bằng MeCN

Hình 3.6.a SKĐ mẫu huyết tương tủa protein bằng axit pechloric

Hình 3.6.b SKĐ mẫu huyết tương tủa protein bằng axit tricloroacetic

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu (a) huyết tương trắng và (b) cefaclor 10,0 µg/mL trong huyết tương trắng

Hình 3.8 Đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng

độ và đáp ứng píc của cefaclor trong huyết tương

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cefaclor là kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ hai, có nhiều ưu điểm nổi bật như tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram (-) và bền với các men - lactamase của vi khuẩn, do vậy có thể tránh được sự đề kháng thuốc Cefaclor được sử dụng trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn nhạy cảm với thuốc, điều trị viêm nhiễm trùng đường hô hấp trên, nhiễm khuẩn tai mũi họng, đặc biệt là viêm tai giữa, viêm xoang [5] Ngày nay cefaclor đã được sản xuất trong nước dưới dạng bào chế viên nang như viên nang cefaclor Stada 250 mg của công ty STADA Việt Nam, viên nang Mekocefaclor 250 công ty Cổ phần Hóa-Dược Mekophar Cefaclor cũng là thuốc có tên trong Danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu thử tương đương sinh học khi đăng ký thuốc do Bộ y tế ban hành [6]

Tại Việt Nam đã công bố quy trình xử lý mẫu và định lượng cefaclor trong huyết tương người tình nguyện bằng HPLC [8] Tuy nhiên, việc áp dụng tại quy mô phòng thí nghiệm vừa và nhỏ, cơ sở vật chất còn thiếu thốn tại các Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Mỹ phẩm tuyến tỉnh và các công ty sản xuất thuốc trong nước là còn khó khăn Hướng tới mục tiêu nâng cao chất lượng và hiệu quả điều trị của thuốc cefaclor sản xuất trong nước thì các đơn

vị kiểm nghiệm đều muốn được chủ động phân tích, giám sát nồng độ cefaclor trong huyết tương người

Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng sắc

ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu chính:

1 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu, khảo sát điều kiện sắc ký và định lượng cefaclor trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Cefaclor

1.1.1 Công thức hóa học

- Công thức phân tử: C15H14ClN3O4S.H2O [9],[11]

- Khối lượng phân tử: 367,8g/mol [ 9]

- Công thức cấu tạo:[9],[13]

- Tên khoa học: chloro-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic monohydrat [16]

(6R,7R)-7-[[(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3-1.1.2 Tính chất hóa lý

- Bột trắng hoặc vàng nhẹ

- Khó tan trong nước (10g/L), thực tế không tan trong methanol và

methylene chlorid, chloroform, benzene (0,5g/L)

- Nhiệt độ nóng chảy dạng khan: 2200 C

- Hằng số phân ly: pKa1= 1,5; pKa2 = 7,17;

- Hệ số phân bố dầu nước logP (octanol/nước) = 0,35 [12] nên việc chiết cefaclor trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng là khó khăn

- Cefaclor hấp thu bước sóng UV có λmax = 263 nm, do vậy có thể định lượng cefaclor bằng HPLC với detector tử ngoại [3],[12],[20]

- Thời gian bán thải của cefaclor trong huyết tương từ 30-60 phút Chức năng thận mất hoàn toàn thì thời gián bán thải kéo dài thêm 2, 3 đến 22, 8 giờ

- Cefaclor phân bố rộng rãi khắp cơ thể, đi qua nhau thai và bài tiết trong sữa mẹ ở nồng độ thấp

- Cefaclor thải trừ nhanh qua thận, 85% liều sử dụng được thải trừ qua nước tiểu ở dạng không đổi trong vòng 8giờ, phần lớn thải trừ trong 2 giờ đầu

- Tương tác thuốc: Probenecid làm chậm bài tiết cefaclor, một số ít cefaclor được đào thải qua thẩm tách máu [4], [5], [12]

*Chỉ định

- Điều trị các nhiễm khuẩn đường hô hấp do các vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt sau khi dùng các kháng sinh thông thường mà thất bại

- Viêm tai giữa cấp, viêm xoang cấpm viêm họng viêm amidan tái phát

- Viêm phổ viêm phế quản mạn trong đợt diễn biến

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới không biến chứng (viêm bàng quang)

- Nhiễm khuẩn da và phần mềm do Staphylococus aureus nhạy cảm và Streptococus pyogenes [4], [5]

*Chống chỉ định

- Người có tiền sử dị ứng với kháng sinh nhóm cephalosporin [4], [5]

*Thận trọng

- Bệnh nhân có tiền sử dị ứng với penicillin

- Thận trọng khi chỉ định cho bệnh nhân có tiền sử mẫn cảm với cephalosporin, đặc biệt là với cefaclor và penecilin

- Người bệnh có tiền sử đường tiêu hóa, đặc biệt là viêm đại tràng

- Dùng cefaclor dài ngày có thể gây viêm đại tràng giả mạc [4]

- Nhiễm khuần nặng: 1g/lần/ngày 3 lần

- Liều giới hạn kê đơn: 4g/ngày [4], [5]

+Trẻ em:

- Liều thường dùng : 20-40mg/kg cân nặng/2-3 lần/ngày

- Viêm tai giữa: 40mg/kg/cân nặng/2-3 lần/ngày, liều tổng cộng trong ngày không quá 1g

- Liều tố đa: 1,5g/ngày [4], [5]

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1]

1.2.1 Cơ sở lý thuyết [1]

HPLC còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao, là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao

Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố như bản chất của pha tĩnh, độ phân cực của pha động,

pH, nhiệt độ…

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi Detector và sẽ được chuyển sang bộ phận xử lý kết quả [1]

* Nguyên tắc cấu tạo chung của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hình 1 1 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hệ thống thu nhận

dữ liệu

(PC/Recorder)

Thải

Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silica Nhóm - OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan:

R là mạch thẳng có 8 hoặc 18 carbon hoặc các nhóm hữu cơ khác như amin mạch thẳng, nitril, hydrocarbon thơm Tính phân cực của pha tĩnh thay đổi tùy theo gốc R [1]

Phụ thuộc vào độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh mà sắc

ký được phân thành sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo:

- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, còn pha động là dung môi ít phân cực như: hexan, iso propyl ether…Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu giảm dần

- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, còn pha động là dung môi phân cực hơn như : acetonitrile, methanol,…Chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu tăng dần [1]

1.2.2 Một số đại lượng đặc trưng trong HPLC

*Hệ số phân bố (partition coefficient):

Là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh với nồng độ của nó trong pha động:

=Trong đó: K: hệ số phân bố

Cs: nồng độ chất tan trong pha tĩnh

Cm: nồng độ chất tan trong pha động

Hệ số phân bố khác nhau càng nhiều, khả năng tách 2 chất càng lớn

*Thời gian lưu (retention time, t R ):

Thời gian lưu của một chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử tới khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ, là thông tin về mặt định tính Trong

-HCl

một điều kiện sắc ký nhất định, thời gian lưu là một hằng số đối với một chất tan Nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, nếu tR quá lớn thì píc bị loãng, thời gian phân tích kéo dài [1]

*Thể tích lưu (retention volum, V R ):

VR của một chất tan là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra khỏi cột từ lúc bắt đầu tiếm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ

VR= tR x F

Trong đó: VR: thể tích lưu F: lưu lượng của pha động

tR: thời gian lưu

Trên thực tế, thể tích chết là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến khi ra khỏi hệ thống

*Hệ số dung lượng (capacity factor, k’):

Là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động:

Hệ số dung lượng là một thông số không phụ thuộc vào lưu lượng pha động F và chiều dài của cột mà chỉ phụ thuộc vào bản chất chất cần phân tích

và đặc tính của pha tĩnh và pha động

Trị số tối ưu 1≤ k’ ≤ 5; nếu k’> 5 thời gian phân tích sẽ kéo dài, đỉnh bị dãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp

*Độ chọn lọc (selectivity,):

Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất A, B = = =

Theo quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên  >1

Để tách riêng 2 chất thường chọn  trong khoảng 1,05 - 2,0

Nếu  quá lớn thời gian phân tích sẽ dài [1], [2]

Trong đó: W: chiều rộng đáy píc

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

Số đĩa lý thuyết N càng lớn thì hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp)

*Độ phân giải (resolution - R s ):

Là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên cùng một điều kiện sắc ký, được tính theo công thức

Định tính bằng sắc ký phối kết hợp với quang phổ hồng ngoại hoặc kết hợp với khối phổ để cho kết quả chắc chắn hơn Phổ sắc ký nhận biết sự vắng mặt của một chất nào đó trong hỗn hợp; do đó ứng dụng để kiểm tra tạp chất treong mẫu Trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiên

*Ứng dụng trong phân tích định lượng:

Đây là ứng dụng quan trọng nhất của HPLC giúp định lượng nhiều loại hợp chất khác nhau Có thể xác định nồng độ chưa biết của một chất trong dung dịch đã biết trước nồng độ, hay xác định cấu trúc của hoạt chất khi ghép nối với khối phổ MS/MS… Ngày nay HPLC còn cho phép định lượng các thành phần có hàm lượng thấp, thậm chí các thành phần dưới dạng vết trong

hỗn hợp phức tạp

Các phương pháp định lượng gồm có:

+ Phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn)

+ Phương pháp thêm đường chuẩn

+ Phương pháp nội chuẩn

+ Phương pháp chuẩn hóa diện tích

1.2.4 Ứng dụng HPLC phân tích cefaclor trong dịch sinh học

Những năm vừa qua đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích phân tích cefaclor trong dịch sinh học, dựa trên kỹ thuật HPLC Dưới đây là một vài phương pháp xử lý mẫu tiêu biểu và điều kiện sắc ký kèm theo của các tác giả mà chúng tôi đã tham khảo, liệt kê:

Tài

liệu

Điều kiện sắc ký

Xử lý mẫu Cột, Detector Pha động

Na.heptansulfonat + 5ml T.E.A/1L nước, chỉnh pH 2,3) = (16:4:80)

Tốc độ dòng: 1,4 mL/phút

Chiết SPE Hoạt hóa: 2mL MeOH + 2mL nước cất Rửa giải: MeOH bốc hơi dung môi

 hòa tan cắn trong pha động

Tốc độ dòng : 1,0 mL/phút

Tạo dẫn xuất sau cột với Fluorescamin trong MeCN

Tủa protein với axit Tricloroacetic 6%lắc, ly tâm 4000vòng/phút x 10phút

 Lấy dịch nổi Tiêm sắc

Tốc độ dòng: 0,6 mL/phút

40µL mẫu+ 20 µL IS (chuẩn nội) + 25µL pyridine

= 50µL 35 mM CIPIC/800ly tâmlọc,tiêm mẫu

Tủa protein với hỗn hợp acid fomic: MeOH Chiết SPE 0,5mL plasma + 100 µL IS Chiết SPE

Bảng 1.1: Một số quy trình định lượng cefaclor trong dịch sinh học bằng

- Phương pháp xử lý mẫu:

Do cefaclor có hệ số cân bằng dầu nước bằng 0,35 nên khó dùng phương pháp chiết cefaclor trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ vì vậy các tài liệu tham khảo trên đều xử lý mẫu với kỹ thuật cơ bản là loại protein trong huyết tương bằng các tác nhân tạo tủa như MeOH, hỗn hợp acid fomic: MeOH, acid pecloric, hay axit tricloroacetic…

250 x 4mm

Detector : UV

263 nm

phosphate pH3,1 (chứa TBAH)

tỷ lệ 10:14:76

Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

CH2Cl2 Dịch thu được tiêm sắc ký

MeOH tỷ lệ 70:30

Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

Tủa protein 500 µl huyết tương +, 100 µl IS (cefaclor) nồng độ (5 µg/mL) + 400 µL MeOH ly tâm, lấy dịch lọc tiêm sắc ký

Đối với quy trình xử lý mẫu bằng chiết SPE, hoặc tạo dẫn xuất trước và sau cột, sử dụng detector quang hóa… tương đối phức tạp và chi phí cao Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nước ta việc áp dụng phương pháp này thực tế còn gặp nhiều khó khăn do ít phòng thí nghiệm có đủ kinh phí để mua cột, trang thiết bị chiết pha rắn và kinh nghiệm sử dụng phương pháp chiết cột pha rắn còn hạn chế

Trên cơ sở tham khảo các phương pháp định lượng đã được công bố, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng cef trong huyết tương người chọn quy trình xử lý mẫu là tủa protein và sử dụng máy HPLC detector

UV có độ đúng, độ chính xác phù hợp với nghiên cứu

1.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học [7], [8], [19]

1.3.1 Khái niệm:

Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế

Do quá trình phân tích mẫu sinh học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lượng mẫu ít, nồng độ thấp, lẫn nhiều tạp chất là các chất nội sinh (các muối

vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá thể, nên phương pháp phân tích phải được thiết lập và thẩm định để đảm bảo độ tin cậy [7]

1.3.2 Nội dung thẩm định phương pháp

*Tính chọn lọc - đặc hiệu

Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất phân tích khi có mặt các thành phần khác, có thể là tạp chất, hoặc các thành phần cản trở khác Trong HPLC, tính chọn lọc - đặc hiệu được thể hiện khi kết quảthu được trên sắc ký đồ (từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha trong mẫu trắng) cho thấy píc của chất cần phân tích được phân tách hoàn toàn với các píc tạp [8], [19]

*Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của píc và nồng độ chất phân tích trong dịch sinh học Mối quan hệ này thường được đánh giá bằng phương pháp hồi huy, thu được từ phương pháp hồi quy tuyến tính Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính [8], [19]

Đường chuẩn phải có ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học

Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu cần phân tích Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính, có hệ số tương quan r ≥ 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:

- Độ lệch so với giá trị thực của các nồng độ phải ≤ 15%, trừ điểm gần LOQ được chấp nhận ≥ 20%

- Có ít nhất 4/6 điểm trong dãy chuẩn đạt tiêu chuẩn trên, bao gồm cả LOQ

và điểm có nồng độ cao nhất

*Giới hạn định lượng dưới LLOQ

Giới hạn định lượng dưới thể hiện độ nhạy, độ chính xác, độ đúng của phương pháp

Giá trị LLOQ thường nằm trong khoảng 1/30-1/10 Cmax

Nồng độ chuẩn thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhậ LLOQ khi thỏa mãn các điều kiện sau:

- Đáp ứng của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại cùng thời gian lưu

- Độ đúng phải bằng 80% - 120% so với nồng độ thực

- Độ chính xác thể hiện bằng giá trị RSD % khi tiến hành phân tích trên

ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20% [8], [19]

*Độ đúng- Độ chính xác:

Độ đúng của phương pháp: là giá trị phản ánh độ gần sát của kết quả phân tích thu được bằng phương pháp với giá trị của chất phân tích này.Giá trị này nằm trong khoảng 85% - 115%, riêng tại các điểm gần giới hạn dưới có thể trong khoảng 80%-120%

Độ chính xác của phương pháp: là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD) [8], [9]

Yêu cầu:

- Đối với độ chính xác trong ngày thì giá trị RSD % phải ≤15%

- Đối với độ chính xác giữa các ngày thì giá trị RSD % phải ≤15%

*Hiệu suất chiết:

Hiệu suất chiết hay tỉ lệ thu hồi hoạt chất là tỷ số giữa đáp ứng/nồng độ hoạt chất có trong mẫu được chiết tách theo quy trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở nhiệt độ

phòng, độ ổn định khi bảo quản dài ngày, độ ổn định khi pha loãng

- Độ ổn định trong mẫu huyết tương bao gồm

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông - rã đông: Nồng độ thuốc trong mẫu sau 3 chu kỳ “đông - rã “ phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% RSD giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi đã chiết tách: Nồng nộ thuốc trong mẫu được xử lý sau khi được bảo quan một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ

xử lý ngay không quá 15% và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong thời gian dự định: Nồng độ cefaclor trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

+ Độ ổn đinh trong quá trình tiêm mẫu [8], [19]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Điều kiện thực nghiệm và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Điều kiện thực nghiệm

2.1.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất và thuốc thử dùng trong nghiên cứu được trình bày ở các bảng 2.1, 2.2 và 2.3

Bảng 2.1 Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu STT Tên Mục đích

sử dụng

Nơi sản xuất

Số kiểm soát

Hàm lượng nguyên trạng

6 Tetrabutyl ammonium hydroxyl

Bảng 2.3 Các mẫu huyết tương trắng sử dụng trong nghiên cứu

4 Tủ lạnh sâu - 400C Bảo quản mẫu Sanyo DMF-236,

Chuẩn bị mẫu, chiếu

8

Đầu típ cho micropipette 0-200 µL

và 0-1000 µ L

Chuẩn bị mẫu, chuyển

9

Bình định mức,

Pipette chính xác,

thủy tinh Class A

Chuẩn bị mẫu, pha

Bảng 2.5 Cấu hịnh hệ thống HPLC Agilents 1260

STT Bộ phận Model Nơi sản xuất

5 Phần mềm điều khiển&xử lý kết

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

* Xây dựng phương pháp định lượng cefaclor trong huyết tương bằng phương pháp HPLC:

- Lựa chọn điều kiện chiết tách cefaclor: tiến hành khảo sát các cách xử

lý mẫu như: tủa protein trên các mẫu huyết tương tự tạo để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp dựa trên các nguyên lý chiết mẫu

- Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách cefaclor ra khỏi các thành phần tạp trong huyết tương, cho phép định lượng cefaclor có trong mẫu với nồng độ chính xác thích hợp

* Thẩm định phương pháp phân tích về các chỉ tiêu:

Tính đặc hiệu, chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng, hiệu suất chiết, độ ổn định của cefaclor trong huyết tương trong các điều kiện (rã đông, cách ngày…)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn cefaclor

- Mẫu huyết tương trắng không chứa cefaclor

- Mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn cefaclor: Pha dung dịch chuẩn gốc cefaclor nồng độ chính xác khoảng 1000 µg/mL trong MeOH Từ dung dịch chuẩn gốc chuẩn bị 6 dung dịch chuẩn làm việc WSS1, WSS2, .WSS6

trong MeOH 50% có nồng độ chính xác khoảng 5, 10, 30, 50, 100 và 300 µg/mL

Pha dãy đường chuẩn gồm 1 mẫu huyết tương trắng (blank plasma) và

6 mẫu huyết tương có pha chuẩn cefaclor và chuẩn nội cephalexin theo bảng 2.6

Bảng 2.6 Cách chuẩn bị đường chuẩn mẫu huyết tương tự tạo

Bảng 2.7 Cách chuẩn bị mẫu QC STT QC Nồng độ ( µg/mL) V WSS (µL) V Huyết tương trắng (µL)

2.2.2 Xây dựng quy trình chiết cefaclor trong huyết tương

Một điều quan trọng trong việc phân tích dược chất trong mẫu mẫu huyết tương là loại bỏ các protein tan trong nước Các phương pháp thông dụng kết tủa protein; chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn Dựa trên tính chất hóa

lý của cefaclor là một chất rất phân cực và có tính chất lưỡng tính nên rất khó chiết khỏi huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát chiết tách cefaclor trong huyết tương bằng phương pháp tủa protein với các tác nhân gây tủa như MeOH, MeCN, axit Trichloroacetic, axit perchloric…

2.2.3 Xác định điều kiện sắc ký

Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống sắc ký Agilents sử dụng cột sắc ký pha đảo C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm, Zorbax Eclipse XDB-Agilents, USA) với các pha động có thành phần tỷ lệ khác nhau Từ kết quả khảo sát lựa chọn những điều kiện sắc ký phù hợp để có thể tiến hành định lượng cefaclor trong huyết tương bằng HPLC với detector UV-Vis

2.2.4.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Chuẩn bị một dãy nồng độ chuẩn của cefaclor trong huyết tương trắng với các nồng độ trong khoảng 0,5 – 30 µg/mL Tiến hành phân tích các mẫu

Từ đáp ứng píc của cefaclor tại các nồng độ tương ứng, xác định sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng píc và các nồng độ đã pha

Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan tuyến tính r Tính lại nồng độ theo phương trình hồi quy đã xây dựng, xác định độ đúng với từng nồng độ

2.2.4.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Tiến hành tiêm sắc ký 6 mẫu trắng và 6 mẫu chuẩn có nồng độ trong khoảng 0,5 µg/ml Ghi lại đáp ứng píc của mẫu trắng và mẫu chuẩn Tính lại nồng độ của các mẫu khảo sát dựa vào đường chuẩn đã xây dựng trong cùng điều kiện Tính % độ lệch giữa các kết quả của 6 lần phân tích

2.2.4.4 Độ đúng, độ lặp lại

a Độ đúng

Tiến hành chạy sắc ký các lô mẫu bao gồm LQC (1,5 µg/mL), MQC (10,0 µg/mL), HQC (25,0 µg/mL) Mỗi lô mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập có cùng nồng độ Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn đã xây dựng trong cùng điều kiện

So sánh giá trị trung bình các lần định lượng tại mỗi nồng độ với giá trị thực

b Độ lặp lại

- Độ lặp lại trong ngày:

Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán RSD giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày

- Độ lặp lại khác ngày:

Tiến hành tương tự như xác định độ lặp lại trong ngày của các mẫu QC Tính giá trị RSD của kết quả định lượng cho mỗi nồng cho mỗi nồng độ trong ít nhất 3 ngày phân tích khác nhau

2.2.4.5 Hiệu suất chiết (Tỷ lệ thu hồi)

Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC, HQC theo quy trình đã xây dựng, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập có cùng nồng độ Song song tiến hành định lượng các mẫu chuẩn pha trong dung môi không qua giai đoạn chiết tách, có nồng độ tuơng ứng với các mẫu QC

So sánh kết quả đáp ứng của cefaclor trong mẫu QC pha trong huyết tương (có qua chiết tách) với đáp ứng của cefaclor trong mẫu pha trong dung môi (không qua chiết tách)

2.2.4.6 Độ ổn định của mẫu thử trong huyết tương