Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương bằng GC MS

ĐẶT VẤN ĐỀHiện nay cùng với sự phát triển của xã hội ngày càng nhanh, mô hình bệnh tật ởnƣớc ta đang có nhiều biến động to lớn. Các bệnh không lây nhiễm, trong đó có các bệnh tim mạch đang có khuynh hƣớng tăng lên rõ rệt. Những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu là: bệnh lý tim mạch đặc biệt là tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, tai biến mạch máu não và ung thƣ. Trong đó, các bệnh lý tim mạch chiếm vị trí đứng đầu. Theo điều tra gần đây nhất (2008) của Viện Tim mạch Việt Nam, thì tỷ lệ tăng huyết áp của những ngƣời từ 25 tuổi trở lên ở nƣớc ta đã là 25,1%.Felodipin là một trong những thuốc đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị, nó là chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu. Hiện nay, nhóm nghiên cứu ở Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đang triển khai nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo dài của Felodipin. Để so sánh chất lƣợng của chế phẩm nghiên cứu với chế phẩm lƣu hành trên thị trƣờng thì việc đánh giá sinh khả dụng (SKD) của thuốc là rất cần thiết.Để thực hiện đƣợc các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng quy trình chiết tách, xử lý mẫu và phân tích, định lƣợng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tƣơng, nƣớc tiểu...). Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thƣờng gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thƣờng rất thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hƣởng tới quá trình phân tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dƣợc chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tƣơng tự với dƣợc chất nên việc phân tách để định lƣợng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phƣơng pháp phân tích phải đƣợc xây dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy.

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN MẠNH XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG GC-MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 1 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN MẠNH XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG GC-MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn : 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2. DS Ngô Thị Quỳnh Nga Nơi thực hiện: 1. Bộ môn hóa phân tích và độc chất - Đại học Dƣợc Hà Nội 2. Trung tâm Giám Định Ma Túy – Viện Khoa Học Hình sự - Bộ Công An HÀ NỘI - 2014 2 LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng và sự chân thành, tôi xin đƣợc bày tỏ niềm biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phó trƣởng phòng Quản lý khoa học, Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội và DS. Ngô Thị Quỳnh Nga - những ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân Tích và Độc chất – Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội, các anh chị ở Trung tâm Giám Định Ma Túy – Viện Khoa học Hình Sự đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt, dạy bảo tận tình trong suốt năm năm tôi học tập tại đây. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ kính yêu, ngƣời thân, bạn bè – những ngƣời đã luôn bên cạnh động viên, yêu quý và chăm lo cho tôi trong cuộc sống. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Văn Mạnh 1 MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cƣơng về Felodipin 3 1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa [5] 3 1.1.2. Dƣợc động học [2] [10] 4 1.1.3. Tác dụng dƣợc lý 4 1.1.4. Chỉ định [2] 4 1.1.5. Chống chỉ định [2] 5 1.1.6. Một số chế phẩm trên thị trƣờng 5 1.2. Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin trong dịch sinh học 6 1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 10 1.3.1. Khái niệm [3] 10 1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng [3] 10 1.3.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí [3] 11 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu thiết bị 16 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 16 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích 17 2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 18 2.3.3. Xử lý và biểu thị kết quả nghiên cứu 24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1. Kết quả xây dựng phƣơng pháp phân tích 25 3.1.1. Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội. 25 3.1.2. Khảo sát chƣơng trình sắc ký 26 3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28 3.2. Kết quả thẩm định phƣơng pháp phân tích 33 3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc. 33 3.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính. 37 3.2.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 40 3.2.5. Tỷ lệ thu hồi 43 3.2.6. Độ ổn định 46 3.3. Bàn luận 50 3.3.1. Phƣơng pháp sử dụng 50 3.3.2. Kết quả thu đƣợc so với các phƣơng pháp khác 51 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1. Kết luận 53 4.2. Đề xuất 54 TÀI LIÊU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMLO Amlodipin DC Dƣợc chất FEL Felodipin GC Sắc kí khí HQC Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control Sample) HT Huyết tƣơng HTT Huyết tƣơng trắng IS Nội chuẩn (Internal Standard) LLOQ Giới hạn định lƣợng dƣới (Lower Limit of Quantitation) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LQC Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample) MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Medium Quality Control Sample) MS Phƣơng pháp phổ khối lƣợng NIF Nifedipin RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) SKD Sinh khả dụng của thuốc TDSH Tƣơng đƣơng sinh học 4 DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trường 5 Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng GC 6 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao. 8 Bảng 1.4 Cách tiêm mẫu trong sắc kí khí 12 Bảng 2.1 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2 19 Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương 20 Bảng 2.3 Cách chuẩn bị mẫu QC 20 Bảng 3.1 Thể tích dung môi chiết toluen khảo sát 30 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết 31 Bảng 3.3 Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp. 37 Bảng 3.4 Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính. 38 Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới 40 Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày 41 Bảng 3.7 Độ đúng, độ chính xác khác ngày 42 Bảng 3.8 Tỷ lệ thu hồi của IS 44 Bảng 3.9 Tỷ lệ thu hồi của FEL 45 Bảng 3.10 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau ba chu kì đông rã. 46 Bảng 3.11 Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng. 47 Bảng 3.12 Độ ổn định của mẫu sau xử lý 48 Bảng 3.13 Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 49 5 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hình Tên hình Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Felodipin 3 Hình 1.2 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí 11 Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống máy khối phổ 14 Hình 3.1 Sắc kí đồ hỗn hợp ba chất Fel, NIF, AMLO trong methanol 25 Hình 3.2 Phổ khối của FEL 27 Hình 3.3 Phổ khối của NIF 28 Hình 3.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong huyết tương băng phương pháp chiết lỏng-lỏng 29 Hình 3.5 Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích chiết 32 Hình 3.6 Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng 34 Hình 3.7 Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng có pha IS 35 Hình 3.8 Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn FEL 36 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ FEL trong huyết tương (ng/ml) với tỉ lệ diện tích FEL /IS 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay cùng với sự phát triển của xã hội ngày càng nhanh, mô hình bệnh tật ở nƣớc ta đang có nhiều biến động to lớn. Các bệnh không lây nhiễm, trong đó có các bệnh tim mạch đang có khuynh hƣớng tăng lên rõ rệt. Những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu là: bệnh lý tim mạch đặc biệt là tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, tai biến mạch máu não và ung thƣ. Trong đó, các bệnh lý tim mạch chiếm vị trí đứng đầu. Theo điều tra gần đây nhất (2008) của Viện Tim mạch Việt Nam, thì tỷ lệ tăng huyết áp của những ngƣời từ 25 tuổi trở lên ở nƣớc ta đã là 25,1%. Felodipin là một trong những thuốc đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị, nó là chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu. Hiện nay, nhóm nghiên cứu ở Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đang triển khai nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo dài của Felodipin. Để so sánh chất lƣợng của chế phẩm nghiên cứu với chế phẩm lƣu hành trên thị trƣờng thì việc đánh giá sinh khả dụng (SKD) của thuốc là rất cần thiết. Để thực hiện đƣợc các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng quy trình chiết tách, xử lý mẫu và phân tích, định lƣợng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tƣơng, nƣớc tiểu ). Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thƣờng gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thƣờng rất thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hƣởng tới quá trình phân tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dƣợc chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tƣơng tự với dƣợc chất nên việc phân tách để định lƣợng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phƣơng pháp phân tích phải đƣợc xây dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy. 2 Nhằm đóng góp một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học đơn giản, hiệu quả và kinh tế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương bằng sắc kí khí” với các mục tiêu sau: Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Felodipin trong huyết tƣơng bằng GC-MS [...]... ca c tim Felodipin lm tng kh nng gng sc v gim s cn au tht ngc ngi bnh au tht ngc n nh [2] Gión mch nóo nờn tng mỏu vo nóo, c dựng cho nhng ngi tai bin mch mỏu nóo [1] 1.1.4 Ch nh [2] - Bnh tng huyt ỏp - iu tr d phũng cn au tht ngc n nh 5 1.1.5 Chng ch nh [2] - Quỏ mn vi dihydropyridin - Nhi mỏu c tim cp - Suy tim mt bự hoc cha kim soỏt c - au tht ngc khụng n nh - Ph n cú thai - Khụng dựng felodipin. .. Felodipin trờn th trng Vit Nam STT Tờn bit dc Enfelo-5 Thnh phn Felodipin Nh sn xut Dng thuc Viờn nộn phúng Aegis., Ltd - Kibris thớch chm-5mg 1 Felodipin 2 Viờn nộn bao Korea United Pharm Inc - HN phim gii phúng Felodil ER QUC chm-5mg Felodipin 3 Felodipin Viờn nộn gii Stadapharm GmbH - C phúng chm Stada 10mg retard Felodipin 4 Felodipin Stada 5 mg Viờn nộn tỏc Stadapharm GmbH - C dng chm retard Felodipin. .. Tỏc dng dc lý Tỏc dng h ỏp ng mch: Felodipin l thuc chn kờnh calci chm cú tớnh cht chn lc thuc nhúm dihydropyridin Felodipin lm gim trng lc ng mch (nht l trờn tiu ng mch), dn n tỏc dng gión mch gõy h huyt ỏp [2] Tỏc dng chng au tht ngc: Felodipin ci thin s cõn bng trong cung v cu oxy ca c tim Lu lng ng mch vnh cng nh lng cung cp oxy cho c tim tng lờn nh gión mch vnh Felodipin gim huyt ỏp ton thõn nờn... nh lng Felodipin trong dch sinh hc Trờn th gii, nhiu phng phỏp ó c xõy dng nh lng FEL trong dch sinh hc c tng hp bng 1.2 v bng 1.3 sau: Bng 1.2 Mt s nghiờn cu nh lng Felodipin bng GC Ti liu Martin Ahnoff v Cs( 1984) Mu th HT ngi Detector Ct sc ký Chun ni (25 m x 0,32 m) Dung mụi chit - Nhit Detector: 300 0C - 380 0C Ct mao qun ECD iu kin sc ký Toluen:H2O H 165/04 (1:1) [9] J.D- Y Dru v HT MS Cs (1995)... ngi v [6] HT chú MS- MS - Pha ng: hn hp ammonium : Capcell Pak Hohyun kim acetateacetonitrile (20:80), PH 6,0 column (2,0 Nifedipin ó c kh khớ trc khi s dng mm ì150 - Tc dũng: 200 àL/phỳt mm, 5,0 àm - Tng thi gian chy 5,0 phỳt particle) Diethyl ether 10 1.3 Tng quan v phng phỏp sc ký khớ khi ph GC- MS 1.3.1 Khỏi nim [3] Sc ký khớ l phng phỏp tỏch cỏc cht th khớ bay hi trong hn hp, trong ú pha ng l... sc ký Khỏc vi cỏc dng sc ký khỏc, trong GC pha ng khụng tng tỏc vi cht phõn tớch m ch lm chc nng vn chuyn cht phõn tớch qua ct Trong sc ký khớ-lng (GLC), pha tnh l cht lng Pha ny c bao hay gn lờn mt cht mang l pha rn, ta cú sc ký khớ phõn b Trong sc ký khớ-rn (GCS), pha tnh l cht rn: pha tnh rn l cht hp ph, ú l sc ký khớ khớ hp ph 1.3.2 Nguyờn tc sc ký khớ-lng [3] Trong GLC, cht tan ch cú th di chuyn... Cỏc dung dch chun gc: Tin hnh cõn chớnh xỏc mt lng tng ng khong 20 mg mu chun FEL hũa tan trong 100 ml MeOH thu c dung dch chun gc vi nng khong 200 àg/ml T dung dch chun gc, tin hnh pha cỏc dung dch chun lm vic vi nng FEL chớnh xỏc 400 ng/ml HT (WS1) v 50 ng/ml HT (WS2) 19 + Dung dch chun ni: Cõn mt lng chớnh xỏc khong 40 mg NIF chun hũa tan trong 50 ml methanol Hỳt 0,5ml pha loóng trong 100ml methanol... thit b 2.1.1 Nguyờn liu, húa cht, dung mụi - Cht chun : Felodipin (FEL): Chun lm vic, hm lng 99,76%, m 0,01% - Cht chun ni: + Nifedipin (NIF): Chun lm vic, hm lng 99,51%, m 0,02% + Amlodipin (AMLO): Chun lm vic, hm lng 99,71%, m 0,00% - Dung mụi húa cht: MeOH, toluen, n-hexan, t tiờu chun tinh khit dựng cho GC- MS - Huyt tng trng khụng cú Felodipin: ca vin Huyt hc- Truyn mỏu Trung ng 2.1.2 Dng c,... Scientifica (3000 vũng/phỳt), c - T lnh sõu ( -40 oC), Sanyo MDF -236 - Micropipet 1-10 àl, 10-100 àl, 100-1000 àl, Nht - Bỡnh nh mc, dng c thy tinh (class A) dựng trong phõn tớch 2.2 Ni dung nghiờn cu 17 - Xõy dng phng phỏp nh lng FEL trong HT bng phng phỏp GC- MS: la chn cht chun ni, iu kin sc ký v quy trỡnh x lý mu chit tỏch FEL t HT - Thm nh phng phỏp phõn tớch: thm nh v cỏc ch tiờu: c hiu - chn lc, ng... thi phự hp khi phõn tớch cựng FEL D kin ni chun la chn gm NIF v AMLO Hai cht ny c pha trong MeOH (800 àg/ml) sau ú c pha loóng bng MeOH thnh nng ( 4 àg/ml) v c bm trc tip vo mỏy GC- MS xỏc nh mnh ph v thi gian lu cựng vi FEL Pha hn hp ba cht FEL (1àg/ml), NIF (4àg/ml) v AMLO (4àg/ml) trong MeOH v c bm trc tip vo mỏy GC xỏc nh din tich pic v hỡnh nh pic ca ba cht, t ú la chn IS cho phự hp 2.3.1.2 Kho . trình phân tích thuốc trong dịch sinh học đơn giản, hiệu quả và kinh tế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương bằng sắc kí khí” với. kí khí” với các mục tiêu sau: Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Felodipin trong huyết tƣơng bằng GC-MS 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về Felodipin 1.1.1. Công thức và. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG GC-MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 1 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN MẠNH XÂY