Thẩm định phƣơng pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát theo hƣớng dẫn về thẩm định phƣơng pháp phân tích dịch sinh học [4] để đảm bảo phƣơng pháp nghiên cứu là phù hợp. Tiến hành thẩm định trên các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu QC (Quality control sample) tự tạo.
Mẫu chuẩn:
+ Các dung dịch chuẩn gốc: Tiến hành cân chính xác một lƣợng tƣơng ứng khoảng 20 mg mẫu chuẩn FEL hòa tan trong 100 ml MeOH để thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc với nồng độ khoảng 200 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ FEL chính xác 400 ng/ml HT (WS1) và 50 ng/ml HT (WS2).
+ Dung dịch chuẩn nội: Cân một lƣợng chính xác khoảng 40 mg NIF chuẩn hòa tan trong 50 ml methanol. Hút 0,5ml pha loãng trong 100ml methanol để đƣợc dung dịch chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 4 µg/ml.
Bảng 2.1. Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2
Dung dịch Cách pha
Nồng độ chính xác khoảng
Chuẩn làm việc WS1
Lấy 20 µl dd chuẩn gốc + Huyết tƣơng trắng vừa đủ 10ml
400 ng/ml
Chuẩn làm việc WS2
Lấy 1,25 ml dd WS1 + Huyết tƣơng trắng vừa đủ 10 ml
50 ng/ml
Từ các dung dịch chuẩn làm việc chuẩn bị các mẫu chuẩn FEL có nồng độ dự kiến 2- 40 ng/ml HT theo bảng sau:
Bảng 2.2. Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương Mẫu chuẩn S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (ng/ml) 0.2 0.5 1 2 4 10 20 40 VWS1(µl) 0 0 0 0 10 25 50 100 VWS2(µl) 4 10 20 40 0 0 0 0 VHTT(µl) 996 990 980 960 990 975 950 900 VIS(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50
Chuẩn bị mẫu kiểm tra (QC): Chuẩn bị các dung dịch làm việc WSQC1 (400 ng/ml HT) và WSQC2 (50 ng/ml HT) nhƣ mẫu chuẩn. Từ các dung dịch làm việc này chuẩn bị các mẫu chuẩn QC theo bảng sau:
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu QC Mẫu Nồng độ (ng/ml) VWSQC1(µl) VWSQC2(µl) VHTT(µl) VIS(µl) LQC 0.5 0 10 990 50 MQC 20 50 0 950 50 HQC 30 75 0 925 50
2.3.2.1. Độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp
Tiến hành xử lý và phân tích theo phƣơng pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tƣơng trắng có nguồn gốc khác nhau và 6 mẫu chuẩn trong huyết tƣơng FEL ở nồng độ thấp nhất của đƣờng chuẩn và chuẩn nội (mẫu LLOQ). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lƣu của FEL và IS. [4]
2.3.2.2. Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn FEL trong huyết tƣơng có nồng độ từ 0,2-40 ng/ml nhƣ ở trên. Từ đáp ứng pic của FEL và IS ở các nồng độ tƣơng ứng, xây dựng phƣơng trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic của FEL/IS và nồng độ của FEL có trong mẫu. Đƣờng chuẩn phải có hệ số tƣơng quan r > 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đƣờng chuẩn, bao gồm cả điểm nồng độ thấp nhất và nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85-115 %, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đƣờng chuẩn cho phép sai số nhƣng không quá 20%, đồng thời 4/6 điểm phải nằm trên đƣờng chuẩn. [4]
2.3.2.3. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Tiến hành phân tích 6 mẫu trắng, 6 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp nhất của đƣờng chuẩn (nồng độ FEL 0,2 ng/ml). Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/mẫu chuẩn, tính nồng độ FEL có trong mẫu dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc phân tích cùng ngày. Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lƣợng đƣợc (tính từ đƣờng chuẩn) với nồng độ thực.
Nồng độ đƣợc coi là LLOQ của phƣơng pháp trên nếu sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho pic FEL tách biệt với các tạp, có độ đúng từ 80-120 %; độ lặp lại với giá trị RSD ≤ 20% và đáp ứng pic ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng [4].
Độ đúng – độ chính xác trong ngày [4]
Tiến hành phân tích các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC trong cùng một ngày, mỗi lô mẫu làm 6 mẫu độc lập có cùng nồng độ. Xác định kết quả của các mẫu QC dựa theo đƣờng chuẩn chuẩn bị trong huyết tƣơng trắng, đƣợc tiến hành trong cùng một điều kiện.
Độ đúng đƣợc xác định bằng tỷ lệ % giá trị nồng độ tìm thấy so với giá trị nồng độ thực. Độ đúng của phƣơng pháp phải nằm trong khoảng từ 85-115 %.
Độ chính xác đƣợc biểu hiện qua độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) giữa các giá trị mỗi lần định lƣợng của mỗi nồng độ đƣợc phân tích trong cùng một ngày. Độ chính xác phải có RSD ≤ 15%.
Độ đúng – độ chính xác khác ngày [4]
Tiến hành tƣơng tự nhƣ độ đúng độ chính xác ở trong ngày. Tính RSD và tỷ lệ % tìm thấy trong ít nhất 3 ngày khác nhau. Yêu cầu giá trị RSD ≤ 15 % và độ đúng của phƣơng pháp phải nằm trong khoảng từ 85-115 %.
2.3.2.5. Tỷ lệ thu hồi hoạt chất và chất chuẩn nội [4] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội: xử lý 6 mẫu huyết tƣơng trắng có chứa chất chuẩn nội ở nồng độ nhƣ đã khảo sát trong quy trình xử lý mẫu. Tiến hành phân tích, xác định diện tích chuẩn nội. Song song, tiến hành phân tích mẫu chuẩn nội đƣợc pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) có nồng độ tƣơng ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu đã qua chiết tách với mẫu pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu.
- Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất: tiến hành phân tích các lô mẫu LQC, MQC, HQC. Mỗi lô mẫu làm 6 mẫu độc lập. Song song, tiến hành với các mẫu chuẩn pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) ở các nồng độ tƣơng ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi của
FEL bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu QC đã qua chiết tách với các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua chiết tách).
Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội hay FEL đƣợc xác định theo công thức sau:
Trong đó:
St : Diện tích pic của IS/FEL có trong mẫu đã qua chiết tách.
Sc : Diện tích pic của IS/FEL của mẫu chuẩn pha trong dung môi chạy sắc ký. n : Hệ số pha loãng của mẫu đã qua chiết tách.
Phƣơng pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 30-110 %; RSD của các giá trị tỷ lệ thu hồi phải ≤ 15% và tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ±15%.
2.3.2.6. Nghiên cứu độ ổn định [4]
Nghiên cứu độ ổn đinh của Felodipin trong huyết tƣơng theo các chỉ tiêu sau: độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông, độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn, độ ổn định dài ngày và độ ổn định của mẫu sau xử lý ở hai lô LQC và HQC. Mỗi lô tiến hành 6 mẫu. Tính nồng độ của các mẫu dựa vào đƣờng chuẩn xây dựng trong cùng điều kiện.
- Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 40 OC và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi huyết tƣơng tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại tủ đông đó trong khoảng 12-24 giờ, làm lặp lại 3 lần nhƣ vậy. Tiến hành xử lý và phân
tích mẫu xác định nồng độ FEL có trong mẫu. So sánh nồng độ FEL xác định đƣợc trong mẫu xử lý và phân tích ngay sau khi pha. Kết quả lƣợng FEL có trong mẫu sau ba chu kỳ đông – rã và mẫu phân tích ngay sau khi pha phải khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
- Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn: So sánh lƣợng FEL có trong mẫu đƣợc chiết tách ngay sau khi để rã đông và mẫu có nồng độ tƣơng ứng sau khi đã để rã đông và để thêm 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Kết quả hai mẫu phải tƣơng đƣơng nhau, sai khác không có ý nghĩa thống kê.
- Độ ổn định dài ngày: Sau khi chuẩn bị, tiến hành bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 400C. Sau từng khoảng thời gian nhất định (bắt đầu và sau 15, 30 ngày), tiến hành phân tích và xác định nồng độ FEL của các mẫu dựa trên đƣờng chuẩn đƣợc phân tích cùng ngày. So sánh nồng độ hai hoạt chất trên trong các mẫu sau khi bảo quản ở các thời điểm với nồng độ FEL trong các mẫu đƣợc phân tích ngay sau khi chuẩn bị. Mẫu phải ổn định tại điều kiện bảo quản trong khoảng thời gian tối thiểu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tƣơng.
- Độ ổn định của mẫu sau xử lý (độ ổn định trong autosampler ở to
phòng): Chuẩn bị 6 mẫu huyết tƣơng ở nồng độ LQC và HQC, rồi xử lý theo quy trình đã xây dựng. Tiến hành phân tích và so sánh nồng độ của FEL trong mẫu ngay sau khi chiết tách và cùng mẫu đó nhƣng để 12 giờ sau khi xử lý để trong autosample.