Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Do vậy hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh, chất chuyển hóa của chúng và ảnh hưởng của chúng lên con người và môi trường đang rất được quan tâm chú ý đặc biệt là ở các nước phát triể

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY ỄN THỊ LAN ANH

CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG

HÀ N ỘI – 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY ỄN THỊ LAN ANH

CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG

Người hướng dẫn:

1.PGS.TS Nguy ễn Thị Kiều Anh 2.DS Tr ần Thị Thanh Huế

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa Phân Tích

2 Phòng Dược lí – Viện KN thuốc TW

HÀ N ỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa Dược lý – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn DS Trần Thị Thanh Huế, người đã giúp

đỡ rất tận tình và cho tôi những góp ý chân thành trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các

thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2013

Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh

MỤC LỤC

M ỤC LỤC

DANH M ỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH M ỤC CÁC BẢNG

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1TỔNGQUANVỀCEPHALOSPORIN 3

1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3

1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3

1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5

1.2TỔNGQUANVỀCEFIXIM 6

1.2.1 Công thức cấu tạo 6

1.2.2 Tính chất lí hóa 6

1.2.5 Chỉ định 7

1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim 7

1.2.6.1 Nghiên c ứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang 7

1.2.6.2 Nghiên c ứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC 7

1.4SẮCKÍLỎNGHIỆUNĂNGCAO 10

1.4.1 Khái niệm 10

1.4.2 Nguyên tắc 10

1.4.3 Phân loại 10

1.4.4 Các thông số đặc trưng 10

1.4.5 Ứng dụng của HPLC 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1.ĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU 15

2.2.PHƯƠNGTIỆNNGHIÊNCỨU 15

2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn 15

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ 16

2.3.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 17

2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 17

2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc kí 17

2.3.3 Đánh giá phương pháp 17

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 18

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19

3.1XÂYDỰNGQUYTRÌNHPHÂNTÍCH 19

3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 19

3.1.1.1 L ựa chọn loại dung môi xử lí mẫu 19

3.1.1.2 L ựa chọn tỉ lệ dung môi xử lí mẫu 21

3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích 23

3.1.2.1 Kh ảo sát lựa chọn cột sắc kí 24

3.1.2.2 Kh ảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 25

3.1.2.3 Kh ảo sát thể tích tiêm mẫu 26

3.1.3 Quy trình phân tích 27

3.2.ĐÁNHGIÁPHƯƠNGPHÁP 29

3.2.1.Độ thích hợp của hệ thống 29

3.2.2 Độ đặc hiệu 30

3.2.3 Độ tuyến tính 32

3.2.4 Độ đúng 34

3.2.5 Khảo sát độ chính xác 36

3.2.5.1 Độ lặp lại 36

3.2.5.2 Độ chính xác trung gian 36

3.2.6.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 38

3.2.6.1.Gi ới hạn phát hiện 38

3.2.5.2 Gi ới hạn định lượng 39

3.3.BÀNLUẬN 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42

4.1.KẾTLUẬN 42

4.2.ĐỀXUẤT 43

TÀI LI ỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

BP 2010 The Bristist Pharmacopoeia (Dược điển Anh 2010)

C18 Octadecyl

DAD Diode array derector (derector chuỗi diod)

HPLC High perform liquid chromatography (sắc kí lỏng hiệu năng cao) HPLC-MS High perform liquid chromatography –Mas Spectrometry (sắc kí

lỏng khối phổ) MeOH Methanol

mg miligram

ml mililit

PA Pro analysis (tinh khiết phân tích)

SĐK Số đăng kí

USP 32 The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34)

UV - VIS Ultraviolet and visiable absorption Spectrophotometry (phổ hấp

thụ tử ngoại khả kiến)

DANH MỤC CÁC BẢNG

B ảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin 4

B ảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài 5

B ảng 3.1 Khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20

B ảng 3.2 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 27

B ảng 3.3 Kết quả độ thích hợp của hệ thống 29

B ảng 3.4 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 33

B ảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng 35

B ảng 3.6 Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian 37

B ảng 3.7 Kết quả khảo sát LOD 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức chung của cephalosporin 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cefixim 6

Hình 2.1 Hóa chất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ 16

Hình 3.1 Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20

Hình 3.2 Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn lượng dung môi xử lí mẫu 22

Hình 3.3 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí 25

Hình 3.4 Sắc kí đồ khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 26

Hình 3.5 Mối liên quan giữa thể tích tiêm mẫu và diện tích pic 27

Hình 3.6 Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn (a), mẫu trắng (b), mẫu thử (c) 31

Hình 3.7 Phổ cefixim trong dung dịch thử và trong dung dịch chuẩn 31

Hình 3.8 Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích cefixim và 6 cephalosporin khác 32

Hình 3.9.a Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (ng/ml) và diện tích pic (mAu.s) của cefixim 33

Hình 3.9.b Sắc kí đồ khảo sát độ tuyến tính 34

Hình 3.10 Sắc kí đồ sát LOD 39

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm

Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh Từ đó tới nay

đã có rất nhiều dòng kháng sinh mạnh, phổ rộng như cephalosporin, macrolid, quinolon, cloramphenicol… được ra đời Sự ra đời của các loại thuốc kháng khuẩn

và kháng sinh là thành tựu vĩ đại của y học Các bác sĩ đã có được những loại thuốc

kì diệu giá rẻ và hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn Kháng sinh cùng với các biện pháp vệ sinh, tiêm phòng góp phần gia tăng tuổi thọ của con người trong nhiều năm,

thậm chí nhiều thập kỉ Mỗi lần phát hiện một loài vi khuẩn kháng thuốc, các phòng thí nghiệm lại đưa ra một loại thuốc kháng sinh mới[7], [25]

Tuy nhiên theo cảnh báo của WHO, những loại kháng sinh công hiệu nhất trong điều trị bệnh đang dần bị vô hiệu hóa Trong cuộc chiến giữa vi khuẩn và con người, phần thắng đang nghiêng về phía các loại vi khuẩn kháng thuốc Đây gần như là dấu chấm hết cho thời kì hoàng kim của thuốc kháng sinh [26] Từ năm 1987

đã không hề có một loại kháng sinh nào được phát hiện còn vi khuẩn lại vẫn đang không ngừng biến đổi [25], [26] Do đó, giảm tỉ lệ kháng thuốc của vi khuẩn là công việc cấp bách hơn bao giờ hết Một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến vi khuẩn kháng thuốc là do kháng sinh tồn dư trong nước thải đặc biệt là trong nước thải nhà máy sản xuất kháng sinh Việc loại bỏ không hoàn toàn kháng sinh trong nước thải tại nhà máy dẫn đến việc xả nước vào môi trường tiềm năng ảnh hưởng đến sức khỏe con người và tác động đến hệ sinh thái, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc ngay cả ở nồng độ dấu vết [24] Do vậy hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh, chất chuyển hóa của chúng và ảnh hưởng của chúng lên con người và môi trường đang rất được quan tâm chú ý đặc biệt là ở các nước phát triển [24], [17]…Đã có nhiều nghiên cứu định lượng kháng sinh trong nước thải và ảnh hưởng của nó lên động thực vật và sức khỏe con người [19]

Tại Việt Nam vấn đề dư lượng kháng sinh trong nước thải cũng đang được quan tâm nghiên cứu như định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện [3] Công nghiệp dược đang phát triển mạnh với gia tăng số lượng các nhà máy sản xuất

dược phẩm cùng với lượng kháng sinh thải ra môi trường ngày càng nhiều Tuy nhiên lại chưa có nghiên cứu về dư lượng kháng sinh trong nước thải nhà máy sản

xuất dược phẩm

Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có phổ rộng, có hiệu quả trên nhiều vi khuẩn đã kháng nhiều loại kháng sinh như cephalosporin thế hệ 1, cephalosporin thế hệ 2, penicillin,… đặc biệt cefixim dùng theo đường uống – một đường dùng đơn giản và dễ sử dụng hơn so với nhiều cephalosporin khác Vì vậy

mà cefixim ngày càng được sử dụng nhiều Để góp phần kiểm soát dư lượng kháng sinh, cụ thể là kháng sinh cefixim trong nhà máy sản xuất dược phẩm chúng tôi thực

hiện đề tài:

“ Xây d ựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc

kí l ỏng hiệu năng cao”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN

1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc

Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã phân

lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium Dịch lọc môi trường nuôi cấy

nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và

có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng và bệnh thương hàn ở người

Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton (Anh) từ môi trường nuôi cấy này

(nay được gọi là Acremonium chrysogenum) đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh

cephalosporin P1, cephalosporin C và penicillin N Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất được cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C

Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu Vì vậy người ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam

Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn có

hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính thấp Vì vậy chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [8]

1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

* Công thức chung của cephalosporin:

S N

NH

R1O

R2 H

O

O O

H

H H

R3

Hình 1.1: Công th ức chung của cephalosporin

Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), mang cấu trúc 3-cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam

để hợp chất có tác dụng sinh học

Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7)đều có cấu hình R, và hầu như

là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu truyền khá mạnh [7]

* Phân lo ại và phổ tác dụng

Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác

dụng Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại Phổ chung của các thế hệ cephalosporin được giới thiệu tại bảng 1.1 [9]

…

- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu kháng methicillin)

- Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Shigella

Thế hệ II Cephaclor

Cephuroxim Cefotetan…

- Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1 Tuy nhiên tác

dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn

Thế hệ III Cefixim

Cefoperazon Cefotaxim

- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với lactamase, tác dụng trên cả P aeruginosa

β Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1

1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu

Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số cephalosporin được sử dụng nghiên cứu trong đề tài tại bảng 1.2 [6], [7], [9], [13], [18], [22]

B ảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài

Tên ch ất Th h ệ Công thức phân tử ế Tính ch ất vật lí

1 Cephadroxil

monohydrat

I C16H17N3O5S.H2O - Bột màu trắng hoặc gần như trắng

- Khó tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%

2.Cefuroxim II C20H22N4O10S - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Ít tan trong nước, tan trong aceton, ethyl acetat và methanol, ít tan trong ethanol

3.Cefdinir III C14H13N5O5S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH = 7), ít tan trong nước, trong alcol và diethyl ether

4.Ceftazidim III C22H22N6O7S2.5H2O - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Tan trong dung dịch kiềm, và trong dimethyl sulfoxid, ít tan trong dimethylformamid, methanol, nước, không tan trong aceton, ethanol, cloroform, dioxan, ether, ethyl acetat, toluen

5.Cefotaxim

natri

III C16H16N5NaO7S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Dễ tan trong nước, hơi tan trong methanol, thực tế không tan trong ether

6.Cefoperazon III C25H26N9NaO8S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Dễ tan trong nước, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96%

1.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM

1.2.1 Công th ức cấu tạo

Hình 1.2: Công th ức cấu tạo của cefixim

+ Công thức phân tử:C16H15N5O7S2.3H2O

+ Khối lượng phân tử: 507,5

+Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy

methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo[4.2.0] oct- 2- en- 2- carboxylic trihydrat [6], [13], [22]

1.2.2 Tính ch ất lí hóa

Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm Ít tan trong nước, aceton, glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch sorbitol 70% và octanol Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH từ 2,6 đến 4,1 [6], [13], [22]

- Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes

.3H2O

- Vi khuẩn Gram (-): Haemophilus influenzae (tiết hoặc không tiết beta – lactamase), Moraxella catarrhalis ( đa số tiết beta – lactamase), Escherichia coli, Proteus mirabilis, Neisseria gonorrhoeae (tiết hoặc không tiết penicillinase)

Cefixim không có hoạt tính đối với Enterococcus, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa và h ầu hết các chủng Bacteroides và Clostridia [5], [9],

[11], [12], [18]

1.2.5 Ch ỉ định

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính

- Nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng

- Viêm niệu đạo do lậu cầu

- Điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn đã kháng cephalosporin thế

hệ I và thế hệ II: Viêm màng não cấp, áp xe não, nhiễm khuẩn đường huyết, viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn đường hô hấp nặng, nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường mật, nhiễm khuẩn tiết niệu và sinh dục [5], [18]

1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim

Nghiên cứu định lượng cefixim rất phong phú với nhiều loại nền mẫu khác nhau Chúng tôi xin giới thiệu một số nghiên cứu định lượng cefixim

1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang

- Định lượng cefixim trong viên nén khi đánh giá độ hòa tan tại λ = 288 nm,

mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 7,2 (6,8 g KH2PO4, điều chỉnh

pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6], [22]

1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC

 M ẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch

 M ẫu dịch sinh học

 Ph ạm Thu Trang: mẫu huyết tương

- Tủa protein bằng dung dịch acid HClO4 20%

- Điều kiện phân tích:

o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40

o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH2PO4 12,5 mM, KH2PO4 5 mM; TBAH 0,06 mM) = 35 : 65, tốc độ dòng 1,5 ml/phút

o Detector: DAD λ =285nm [10]

 Abbas Khan và c ộng sự: mẫu huyết tương

- Tủa protein bằng acid tricloroacetic

- Điều kiện phân tích:

o Cột Supelco Discovery HS C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 50

o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic(19:81), tốc độ dòng 2 ml/phút

o Detector: UV λ = 285 nm [16]

 Joy A McAteer và c ộng sự: mẫu huyết tương

- Tủa protein bằng ACN

 Emirhan Nemutlu và c ộng sự: mẫu huyết tương và nước ối

- Chi ết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X)

 M ẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống

Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước uống

có những nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương [10]

Tuy nhiên những nghiên cứu về cefixim trong nước thải nhà máy còn khá ít Các quy trình định lượng cefixim trong chế phẩm và huyết tương không thể áp dụng cho định lượng cefixim trong nước thải nhà máy Chúng tôi mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng cefixim trong nước thải nhà máy [17] Nghiên cứu này sử

dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lí mẫu bằng chiết pha rắn Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay chưa phổ biến tại Việt Nam Trong khi đó, hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng khá thông dụng, dễ

kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam Vì vậy chúng tôi xây dựng quy trình phân tích cefixim trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng

1.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.4.3 Phân lo ại

Các kĩ thuật sắc kí lỏng: sắc kí phân bố, sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion,

sắc kí loại cỡ, sắc kí ái lực, sắc kí các đồng phân quang học

Trong khuôn khổ của đề tài tôi xin trình bày chi tiết về sắc kí phân bố

Sắc kí phân bố là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Có thể phân thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh:

- Sắc kí lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang

rắn, đó là chất nhồi cột Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự phân bố

giữa 2 pha lỏng

- Sắc kí pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn ví

dụ như silica, alumina [1], [2]

1.4.4 Các thông số đặc trưng

* H ệ số phân bố K

Trong đó CS

CS : nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh

CM: nồng độ mol của chất tan trong pha động

K càng lớn, sự di chuyển của các chất của chất tan qua pha tĩnh càng chậm

Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách

diễn ra càng dễ dàng hơn [1]

* Th ời gian lưu t R

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích đến derector Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của

mỗi chất là hằng định Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các

chất [1]

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH pha động

Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu [1]

* H ệ số đối xứng của pic AF

AF =

Ở đây:

W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic,

: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 AF 2 [1]

* S ố đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N:

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

2

2 / 1

2

54,5

RA RB A

B

RA RB S

W W

t t W

W

t t R

2 / 1 2

/ 1

) (

18 , 1 ) (

2

+

−

= +

−

=

- Trong đó : tRA, tRB : Thời gian lưu của 2 pic liền kề

WA, WB : Độ rộng của pic đo ở các đáy pic

W1/2A, W1/2B : Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic

Các giá trị tRA, tRB ,WA, WB , W1/2A, W1/2B phải tính theo cùng đơn vị [1]

- Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5

1.4.5 Ứng dụng của HPLC

- Định tính :

- Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc kí đồ của chuẩn và thử là cơ sở của phép định tính Trên các máy HPLC hiện đại với detector mảng diod ta có thể quét

phổ UV-VIS của chất phân tích trên sắc kí đồ mẫu chuẩn và mẫu thử rồi chồng phổ

với nhau để xác định sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI- similarity index)

- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn

- Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao

- Hệ số Match 0,990 : hai phổ tương tự nhau

- Hệ số 0,900 Match 0,990 : hai phổ có những điểm tương đồng

- Hệ số Match 0,900 : hai phổ khác nhau

- Định lượng :

Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ chất phân tích trong dung dịch (diện tích pic hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc kí là cơ sở của phép định lượng

Các phương pháp định lượng có thể áp dụng là :

- Phương pháp dùng chuẩn ngoại

- Phương pháp dùng chuẩn nội

- Phương pháp thêm chất chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong đó phương pháp dùng chuẩn ngoại được sử dụng nhiều Đây cũng là phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này Vì vậy sau đây chúng tôi xin trình bày chi tiết về phương pháp chuẩn ngoại dùng trong định lượng bằng HPLC

* Phương pháp dùng chuẩn ngoại

Phương pháp dùng chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản Trong đó

cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc kí trong cùng một điều kiện

Nguyên tắc : so sánh diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu thử với diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu chuẩn để tính nồng độ các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm

 Chuẩn hóa 1 điểm : Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của

mẫu thử

Tính nồng độ mẫu thử theo công thức :

CX = CS SX/SS Trong đó :

CX : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

CS : nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn

SX (HX) : diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử

SS (HS) : diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm :Tiến hành qua các bước như sau :

Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc kí Các đáp ứng thu được là diện tích pic hoặc chiều cao pic của mỗi dung dịch chuẩn

Để tính toán nồng độ của chất phân tích có thể sử dụng 1 trong 2 cách sau :

- Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C) Từ diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử và đường chuẩn đã xây dựng sẽ suy ra được nồng độ của chất thử

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định

Y = a CX + b Trong đó :

Y : Diện tích pic

b : Giao điểm của đường chuẩn với trục tung

a : Độ dốc của đường chuẩn

CX : Nồng độ chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy tính nồng độ chất thử :

CX = (Y-b)/a Lưu ý : Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử phải nằm trong

đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1], [2]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Sử dụng nước thải nhà máy dược phẩm của công ty Mediplantex – một trong

những công ty có dây chuyền sản xuất các cephalosporin trong đó có cefixim làm

nền mẫu trong nghiên cứu này

Tiến hành lấy mẫu nước thải của công ty Mediplantex vào ngày không sản

xuất cefixim, thêm cefixim chuẩn để từ đó xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải nhà máy

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn

Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu :

Thuốc thử, dung môi sử dụng trong nghiên cứu như sau :

- ACN, MeOH loại tinh khiết dùng cho HPLC, nơi sản xuất Merck, Đức

- Dicloromethan, cloroform, diethyl ether, natri dihydrophosphat, acid phosphoric loại PA, nơi sản xuất Merck, Đức

- Giấy thử pH, nơi sản xuất VKNTTW

a.H ệ thống HPLC Merck - Hitachi b.M ột số chất chuẩn – hóa chất

c.M ẫu nước thải của nhà máy Mediplantex

Hình 2.1 Hóa ch ất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ tại Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương (được chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP ) gồm có :

- Máy lắc siêu âm LK 106 (Đức)

- Cân phân tích Metler Toledo (d=0,01 mg, e = 0,1 mg) (Thụy Sĩ)

- Máy li tâm Hettich zentrifugen (Đức)

- Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Merck – Hitachi với detector DAD, phần mềm Multi-system manager, Interface D700, Nhật Bản

- Dụng cụ thủy tinh các loại

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu

- Mục đích: tìm được loại dung môi, tỉ lệ dung môi xử lí mẫu có hiệu suất cao,

loại được nhiều tạp chất

- Tiến hành xử lí mẫu thử chứa cefixim bằng các cách khác nhau Định lượng

hoạt chất theo quy trình đã lựa chọn Đánh giá và tìm ra cách xử lí phù hợp

2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc kí

Nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí về cột

sắc kí, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu trên thiết bị sắc kí lỏng

hiệu năng cao với detector DAD nhằm lựa chọn được điều kiện sắc kí phù hợp nhất

để định lượng cefixim

2.3.3 Đánh giá phương pháp

Xử lí các mẫu nghiên cứu theo phương pháp xử lí đã xây dựng, tiến hành sắc

kí các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và

độ chính xác, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

 Độ thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian

lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liên tiếp

Yêu c ầu: RSD% về thời gian lưu và diện tích pic < 2% [15]

 Độ đặc hiệu :Trên sắc kí đồ, mẫu trắng phải không có pic có thời gian lưu

tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn [15]

 Độ tuyến tính: Kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng

nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử

Xây dựng đường chuẩn 6 điểm (X1 đến X6) của dung dịch có chứa chất chuẩn cefixim ở trong khoảng nồng độ phù hợp

Tiến hành sắc kí theo điều kiện đã chọn Tiêm 3 lần mỗi mẫu Tính giá trị trung bình

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan r của cefixim

Yêu c ầu: r > 0,997 [15]

 Độ đúng: sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trị đối

chiếu được chấp nhận

Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích trên mẫu tự

tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng Tiến hành trên 3 điểm nồng độ: 2

- 3 lần LLOQ, 40 - 60% ULOQ, 70 – 90% ULOQ Tính tỉ lệ chuẩn thu hồi lại được

và lượng chuẩn thêm vào để có được độ đúng của phương pháp

Yêu c ầu:

- Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: độ thu hồi từ 80 – 110 % [21]

- Nồng độ từ 10 – 100 ng/ml: độ thu hồi từ 60 – 115 % % [21]

 Độ chính xác: sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép

đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô

tả

Độ chính xác có thể chia làm 3 cấp độ: Độ lặp lại, độ chính xác trung gian và

độ tái lặp Chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian

- Độ lặp lại: tiến hành cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn

Yêu c ầu: Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: RSD% từ 11 – 15% [21]

- Độ chính xác trung gian: thực hiện trong cùng một phòng thí nghiệm, thực

hiện ở hai ngày khác nhau

Yêu c ầu: Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: RSD% từ 11 – 15% [21]

- Gộp kết quả 2 ngày: FTN < FLT

Với FTN = (FTN > 1)

FLT (0,05,5,5)

 Kh ảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD) của cefixim được xác định dựa vào hệ số góc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của đáp ứng

- Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện [15]

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu

Các kết quả thống kê được tính dựa vào các hàm trong Microsoft Excel

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu

Qua tham khảo tài liệu chúng tôi tiến hành xử lí mẫu bằng cách kết tủa protein

và loại tạp bằng dung môi trước khi phân tích HPLC vì phương pháp này đơn giản, kinh tế, tiết kiệm thời gian Chúng tôi khảo sát để lựa chọn dung môi xử lí mẫu và lượng dung môi để tìm ra quy trình xử lí mẫu sạch nhất, hiệu suất cao, dễ thực hiện

Kết quả khảo sát được đánh giá qua hiệu suất xử lí mẫu : lượng cefixim tính được trong mẫu sau xử lí so sánh với lượng cefixim thêm vào mẫu nước thải

3.1.1.1 Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu

Cefixim có giá trị log Poctanol/nước = -0,64 nên việc chuyển cefixim từ pha nước (nước thải) sang pha dung môi là khá khó khăn Chúng tôi tiến hành xử lí mẫu với

mục đích loại tạp chất tan trong dung môi hữu cơ, cefixim vẫn ở trong pha nước

Do đó cần lựa chọn dung môi ít hòa tan cefixim nhất Chúng tôi khảo sát xử lí mẫu nước thải chứa cefixim với 3 dung môi : dicloromethan, diethyl ether, cloroform với cùng tỉ lệ mẫu thử : ACN : dung môi = (5 : 1 : 3)

Chuẩn bị các mẫu thử và mẫu chuẩn :

- Mẫu chuẩn gốc (cefixim 50 µg/ml trong nước cất): Cân chính xác khoảng 25

mg cefixim hòa tan trong vừa đủ 500 ml nước cất

- Mẫu thử: pha loãng chính xác 2 ml mẫu chuẩn gốc trong vừa đủ 200 ml mẫu nước thải trắng

- Mẫu chuẩn: pha loãng mẫu chuẩn gốc trong nước cất để được nồng độ cefixim 500 ng/ml

 Tiến hành:

- Lần lượt xử lí mẫu thử với từng dung môi trong 3 dung môi dicloromethan, cloroform, diethyl ether

- Dung dịch thử: mẫu thử được acid hóa với HCl 1N đến pH khoảng bằng 3,

thử bằng giấy chỉ thị màu pH Lấy chính xác 5 ml dung dịch thử vào các ống nghiệm, thêm 1ml ACN, lắc xoáy trong 30s, đem ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút