Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2.DS. Trần Thị Thanh Huế Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Phân Tích 2. Phòng Dược lí – Viện KN thuốc TW HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa Dược lý – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn DS. Trần Thị Thanh Huế, người đã giúp đỡ rất tận tình và cho tôi những góp ý chân thành trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện khóa luận. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 3 1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3 1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3 1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5 1.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 6 1.2.1 Công thức cấu tạo 6 1.2.2 Tính chất lí hóa 6 1.2.5 Chỉ định 7 1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim 7 1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang 7 1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC 7 1.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 10 1.4.1 Khái niệm 10 1.4.2 Nguyên tắc 10 1.4.3 Phân loại 10 1.4.4 Các thông số đặc trưng 10 1.4.5 Ứng dụng của HPLC 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn 15 2.2.2. Thiết bị - dụng cụ 16 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 17 2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc kí 17 2.3.3. Đánh giá phương pháp 17 2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 18 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 19 3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 19 3.1.1.1 Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu 19 3.1.1.2. Lựa chọn tỉ lệ dung môi xử lí mẫu 21 3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích 23 3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí 24 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 25 3.1.2.3. Khảo sát thể tích tiêm mẫu 26 3.1.3 Quy trình phân tích 27 3.2.ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 29 3.2.1.Độ thích hợp của hệ thống 29 3.2.2 Độ đặc hiệu 30 3.2.3 Độ tuyến tính 32 3.2.4. Độ đúng 34 3.2.5 Khảo sát độ chính xác 36 3.2.5.1 Độ lặp lại 36 3.2.5.2 Độ chính xác trung gian 36 3.2.6.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 38 3.2.6.1.Giới hạn phát hiện 38 3.2.5.2 Giới hạn định lượng 39 3.3.BÀN LUẬN 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 4.1. KẾT LUẬN 42 4.2. ĐỀ XUẤT 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BP 2010 The Bristist Pharmacopoeia (Dược điển Anh 2010) C 18 Octadecyl DAD Diode array derector (derector chuỗi diod) HPLC High perform liquid chromatography (sắc kí lỏng hiệu năng cao) HPLC-MS High perform liquid chromatography –Mas Spectrometry (sắc kí lỏng khối phổ) MeOH Methanol mg miligram ml mililit PA Pro analysis (tinh khiết phân tích) SĐK Số đăng kí USP 32 The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34) UV - VIS Ultraviolet and visiable absorption Spectrophotometry (phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin 4 Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài 5 Bảng 3.1. Khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 27 Bảng 3.3. Kết quả độ thích hợp của hệ thống 29 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính 33 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng 35 Bảng 3.6. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian 37 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát LOD 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cefixim 6 Hình 2.1 Hóa chất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ 16 Hình 3.1. Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20 Hình 3.2. Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn lượng dung môi xử lí mẫu 22 Hình 3.3. Khảo sát lựa chọn cột sắc kí 25 Hình 3.4. Sắc kí đồ khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 26 Hình 3.5. Mối liên quan giữa thể tích tiêm mẫu và diện tích pic 27 Hình 3.6. Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn (a), mẫu trắng (b), mẫu thử (c) 31 Hình 3.7. Phổ cefixim trong dung dịch thử và trong dung dịch chuẩn 31 Hình 3.8. Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích cefixim và 6 cephalosporin khác 32 Hình 3.9.a. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (ng/ml) và diện tích pic (mAu.s) của cefixim 33 Hình 3.9.b. Sắc kí đồ khảo sát độ tuyến tính 34 Hình 3.10. Sắc kí đồ sát LOD 39 1 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh. Từ đó tới nay đã có rất nhiều dòng kháng sinh mạnh, phổ rộng như cephalosporin, macrolid, quinolon, cloramphenicol… được ra đời. Sự ra đời của các loại thuốc kháng khuẩn và kháng sinh là thành tựu vĩ đại của y học. Các bác sĩ đã có được những loại thuốc kì diệu giá rẻ và hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn. Kháng sinh cùng với các biện pháp vệ sinh, tiêm phòng góp phần gia tăng tuổi thọ của con người trong nhiều năm, thậm chí nhiều thập kỉ. Mỗi lần phát hiện một loài vi khuẩn kháng thuốc, các phòng thí nghiệm lại đưa ra một loại thuốc kháng sinh mới[7], [25]. Tuy nhiên theo cảnh báo của WHO, những loại kháng sinh công hiệu nhất trong điều trị bệnh đang dần bị vô hiệu hóa. Trong cuộc chiến giữa vi khuẩn và con người, phần thắng đang nghiêng về phía các loại vi khuẩn kháng thuốc. Đây gần như là dấu chấm hết cho thời kì hoàng kim của thuốc kháng sinh [26]. Từ năm 1987 đã không hề có một loại kháng sinh nào được phát hiện còn vi khuẩn lại vẫn đang không ngừng biến đổi [25], [26]. Do đó, giảm tỉ lệ kháng thuốc của vi khuẩn là công việc cấp bách hơn bao giờ hết. Một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến vi khuẩn kháng thuốc là do kháng sinh tồn dư trong nước thải đặc biệt là trong nước thải nhà máy sản xuất kháng sinh. Việc loại bỏ không hoàn toàn kháng sinh trong nước thải tại nhà máy dẫn đến việc xả nước vào môi trường tiềm năng ảnh hưởng đến sức khỏe con người và tác động đến hệ sinh thái, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc ngay cả ở nồng độ dấu vết [24]. Do vậy hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh, chất chuyển hóa của chúng và ảnh hưởng của chúng lên con người và môi trường đang rất được quan tâm chú ý đặc biệt là ở các nước phát triển [24], [17]…Đã có nhiều nghiên cứu định lượng kháng sinh trong nước thải và ảnh hưởng của nó lên động thực vật và sức khỏe con người [19]. Tại Việt Nam vấn đề dư lượng kháng sinh trong nước thải cũng đang được quan tâm nghiên cứu như định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện [3]. Công nghiệp dược đang phát triển mạnh với gia tăng số lượng các nhà máy sản xuất 2 dược phẩm cùng với lượng kháng sinh thải ra môi trường ngày càng nhiều. Tuy nhiên lại chưa có nghiên cứu về dư lượng kháng sinh trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm. Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có phổ rộng, có hiệu quả trên nhiều vi khuẩn đã kháng nhiều loại kháng sinh như cephalosporin thế hệ 1, cephalosporin thế hệ 2, penicillin,… đặc biệt cefixim dùng theo đường uống – một đường dùng đơn giản và dễ sử dụng hơn so với nhiều cephalosporin khác. Vì vậy mà cefixim ngày càng được sử dụng nhiều. Để góp phần kiểm soát dư lượng kháng sinh, cụ thể là kháng sinh cefixim trong nhà máy sản xuất dược phẩm chúng tôi thực hiện đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao” Với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp xử lí mẫu và điều kiện phân tích định lượng cefixim trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm. - Thẩm định phương pháp định lượng cefixim trong mẫu nước này. [...]... cefixim trong huyết tương [10] Tuy nhiên những nghiên cứu về cefixim trong nước thải nhà máy còn khá ít Các quy trình định lượng cefixim trong chế phẩm và huyết tương không thể áp dụng cho định lượng cefixim trong nước thải nhà máy Chúng tôi mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng cefixim trong nước thải nhà máy [17] Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lí mẫu bằng chiết... lớn tín hiệu thu được từ chất phân tích trong dung dịch (diện tích pic hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc kí là cơ sở của phép định lượng Các phương pháp định lượng có thể áp dụng là : - Phương pháp dùng chuẩn ngoại - Phương pháp dùng chuẩn nội - Phương pháp thêm chất chuẩn - Phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong đó phương pháp dùng chuẩn ngoại được sử dụng nhiều Đây cũng là phương pháp. .. màng trong tim, nhiễm khuẩn đường hô hấp nặng, nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường mật, nhiễm khuẩn tiết niệu và sinh dục [5], [18] 1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim Nghiên cứu định lượng cefixim rất phong phú với nhiều loại nền mẫu khác nhau Chúng tôi xin giới thiệu một số nghiên cứu định lượng cefixim 1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang - Định lượng. .. cefixim trong chế phẩm, huyết tương tới định lượng trong nước thải Các dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về cefixim [6], [13], [22] Nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương cũng rất được quan tâm chú ý Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng riêng cefixim hay định lượng cefixim đồng thời với các chất khác [16], [19], [20] Tại Việt Nam, cũng đã có những nghiên cứu định lượng cefixim. .. hợp 2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc kí Nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí về cột sắc kí, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu trên thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector DAD nhằm lựa chọn được điều kiện sắc kí phù hợp nhất để định lượng cefixim 2.3.3 Đánh giá phương pháp Xử lí các mẫu nghiên cứu theo phương pháp xử lí đã xây dựng, tiến hành sắc kí... mẫu trong nghiên cứu này Tiến hành lấy mẫu nước thải của công ty Mediplantex vào ngày không sản xuất cefixim, thêm cefixim chuẩn để từ đó xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải nhà máy 2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu : Các chất chuẩn : - Cefixim : Chuẩn quốc gia, SKS : 0105192, hàm lượng. .. cũng là phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này Vì vậy sau đây chúng tôi xin trình bày chi tiết về phương pháp chuẩn ngoại dùng trong định lượng bằng HPLC * Phương pháp dùng chuẩn ngoại Phương pháp dùng chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản Trong đó cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc kí trong cùng một điều kiện Nguyên tắc : so sánh diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu thử với... rắn Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay chưa phổ biến tại Việt Nam Trong khi đó, hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam Vì vậy chúng tôi xây dựng quy trình phân tích cefixim trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng 10 1.4 SẮC... tích định tính và định lượng [1], [2] 1.4.3 Phân loại Các kĩ thuật sắc kí lỏng: sắc kí phân bố, sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, sắc kí loại cỡ, sắc kí ái lực, sắc kí các đồng phân quang học Trong khuôn khổ của đề tài tôi xin trình bày chi tiết về sắc kí phân bố Sắc kí phân bố là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Có thể phân thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh: - Sắc kí lỏng – lỏng: ... quy trình định lượng cefixim trong nước thải cụ thể như sau:  Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn: 28 - Mẫu chuẩn gốc (cefixim 50 µg/ml): Cân chính xác khoảng 25 mg cefixim hòa tan trong vừa đủ 500 ml nước cất - Mẫu thử (cefixim 500ng/ml): pha loãng chính xác 2 ml mẫu chuẩn gốc trong vừa đủ 200 ml mẫu trắng - Mẫu chuẩn (cefixim 500ng/ml) trong nước cất : pha loãng mẫu chuẩn gốc trong nước cất . sinh cefixim trong nhà máy sản xuất dược phẩm chúng tôi thực hiện đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao Với mục tiêu: - Xây dựng phương. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn:. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI