Nghiên cứu định lượng rifampicin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. ThS: Trần Thị Lan Hương 2. ThS: Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới ThS. Trần Thị Lan Hương và ThS. Tạ Mạnh Hùng, những người thầy đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn các anh chị tại trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Trong suốt 5 năm học tập tại trường đại học Dược Hà Nội, em đã nhận được sự dìu dắt, dạy bảo tận tình của các thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn! Với tất cả tình thương yêu, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, anh chị em và những người bạn – những người luôn động viên, khích lệ em trong suốt thời gian qua. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Văn Đức MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1.Tổng quan về Rifampicin (RIF) 2 1.1.1.Cấu trúc hóa học 2 1.1.2.Tính chất hóa lý 2 1.1.3.Dược động học 3 1.1.4.Phổ tác dụng và cơ chế 3 1.1.5.Chỉ định 3 1.1.6.Một số chế phẩm trên thị trường 4 1.1.7.Một số phương pháp định lượng RIF trong dịch sinh học bằng HPLC 5 1.2.Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7 1.2.1.Định nghĩa 7 1.2.2.Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 7 1.2.3.Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC 8 1.2.4.Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 9 1.2.5.Phương pháp định lượng bằng HPLC 13 1.3.Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 14 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3.Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1.Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu 18 2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích 20 2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương: 24 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn 24 3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu có Rifampicin 28 3.1.3. Qui trình phân tích RIF trong huyết tương 31 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 31 3.2.1. Tính chọn lọc 32 3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 34 3.2.3. Giới hạn định lượng dưới 37 3.2.4. Độ đúng – độ lặp lại trong ngày và khác ngày 37 3.2.5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp 40 3.2.6. Độ ổn định của mẫu huyết tương 42 3.3. Bàn luận 45 3.3.1. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương có Rifampicin 45 3.3.2. Phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CC : Đường chuẩn HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control Sample) HT : Huyết tương IS : Nội chuẩn (Internal Standard) LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification) LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control Sample) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality Control Sample) QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample) RIF : Rifampicin SKĐ : Sắc ký đồ SPE : Chiết pha rắn (Solid-phase extration) ULOQ : Nồng độ giới hạn định lượng trên (Upper Limit Of Quantification) US-FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food and Drug Administration) UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible) WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Các chế phẩm rifampicin trên thị trường 4 1.2 Một số nghiên cứu định lượng rifampicin trong dịch sinh học 5 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 17 2.2 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 18 2.3 Chuẩn bị đường chuẩn 19 2.4 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 20 2.5 Chuẩn bị mẫu giới hạn định lượng dưới 20 3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của rifampicin và nội chuẩn 34 3.2 Kết quả sự tương quan giữa nồng độ rifampicin trong huyết tương và tỷ lệ đáp ứng pic 35 3.3 Kết quả thẩm định đường chuẩn 36 3.4 Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới 37 3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 38 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 39 3.7 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 40 3.8 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi rifampicin 41 3.9 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông–rã 42 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 43 3.11 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ - 80 0 C trong thời gian dài 44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc cột LC – DB 11 1.2 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 11 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS của rifampicin 24 3.2 Sắc đồ chuẩn rifampicin trong pha động: methanol - đệm phosphat (65:35) 26 3.3 Sắc đồ chuẩn nội chuẩn trong pha động: methanol - đệm phosphat (65:35) 26 3.4 Sắc đồ chuẩn rifampicin trong pha động: methanol - acetonitril - đệm phosphat (48,8: 16,2: 35) 27 3.5 Sắc đồ chuẩn nội chuẩn trong pha động: methanol - acetonitril - đệm phosphat (48,8: 16,2: 35) 27 3.6 Sắc đồ chuẩn rifampicin và nội chuẩn với tốc độ dòng khác nhau 28 3.7 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng tủa protein bằng methanol 29 3.8 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thêm rifampicin và nội chuẩn tủa protein với 1,5 mL methanol 29 3.9 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thêm rifampicin và nội chuẩn tủa protein với 1,0 mL methanol 29 3.10 Sắc đồ chuẩn rifampicin trong methanol có Vitamin C 1,0 mg/mL 30 3.11 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 32 3.12 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn rifampicin (nồng độ 0,2 µg/mL) và nội chuẩn 33 3.13 Sắc đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn rifampicin (nồng độ 9,0 µg/mL) và nội chuẩn 33 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lao là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và phổ biến. Bệnh do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây ra. Cơ quan chịu tác động phổ biến nhất của vi khuẩn lao là phổi. Ngoài ra, các vị trí khác có thể gây bệnh của vi khuẩn lao là xương, khớp, hạch và não. Theo tổ chức y tế thế giới, lao là mối đe dọa lớn trên toàn cầu về vấn đề sức khỏe [21]. Việt Nam nằm trong danh sách các nước có số ca mắc lao cao trên thế giới, đứng thứ 12/23 nước có số lượng bệnh nhân lao cao trên toàn cầu. Đặc biệt, những số liệu gần đây cho thấy tỷ lệ số bệnh nhân lao tái phát và thất bại điều trị có xu hướng gia tăng [20]. Rifampicin là một trong năm thuốc của thuốc điều trị lao nhóm 1 gồm có isoniazid, rifampicin, pyrazinamid, ethambutol, streptomycin. Vi khuẩn lao kháng thuốc hiện nay đang có xu hướng gia tăng và là một vấn đề lớn gây thất bại trong điều trị. Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến kết quả trong điều trị trong đó nồng độ thuốc chống lao trong máu có liên quan chặt chẽ đến hiệu quả điều trị thực tế. Để đánh giá chính xác việc điều trị có đạt yêu cầu hay không, việc định lượng nồng độ thuốc trong máu là một yêu cầu cần thiết được đặt ra. Điều đáng chú ý, năm 2010 Bộ Y tế đã ra quy định các thuốc chứa hoạt chất rifampicin phải có báo cáo, số liệu đánh giá tương đương sinh học invivo mới được cấp phép đăng ký và lưu hành trên thị trường Việt Nam [7]. Do vậy, để xác định nồng độ rifampicin trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất rifampicin, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng rifampicin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV. 2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định của US-FDA. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ RIFAMPICIN (RIF) 1.1.1.Cấu trúc hóa học - Công thức phân tử: C 43 H 58 N 4 O 12 ; M=822,95 g/mol - Công thức cấu tạo: - Tên khoa học: (12Z,14E,24E) (2S,16S,17S,18R,19R,20R,21S,22R,23S) – 5,6,9,17,19- pentahydroxy – 23 – methoxy – 2,4,12,16,18,20,22 – heptamethyl – 8 – [N-(4- methyl-1-pipeainyl) pentadecatrienoimino] -1,2-dihydronaphtho [2,1-b] furan -21- yl acetat. [2], [4], [13], [19] 1.1.2.Tính chất hóa lý - Bột kết tinh màu đỏ cam, hoặc đỏ nâu, không bền khi bị ẩm. - Dễ tan trong cloroform; tan trong methanol; tan ít trong nước, ethanol, ether. - Dung dịch RIF không bền và biến đổi tùy thuộc vào pH và nhiệt độ. Ở pH kiềm, RIF dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí làm chuyển RIF sang dạng quinon; Ở pH acid, RIF bị thủy phân ra hợp chất 3-formyl rifamycin SV. Các nhóm ester bị thủy phân ngay ở pH trung tính. [2], [4], [13], [19] [...]... sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng rifampicin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS 2.3.2.2.Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách rifampicin từ huyết tương trên các mẫu chuẩn rifampicin hòa tan trong huyết tương trắng bằng các phương pháp như: + Tủa... trong cùng điều kiện Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu 2.3.3.4 Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trong cùng điều kiện Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch... tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu có nồng độ tương ứng Xác định tỷ lệ thu hồi của RIF và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của RIF và IS trong các mẫu QC có qua xử lý với đáp ứng của RIF và IS trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua xử lý) 2.3.3.7 Độ ổn định của huyết tương Xác định độ ổn định của RIF trong huyết tương sau ba chu kỳ đông – rã đông và trong quá... 1.1.7.Một số phương pháp định lượng RIF trong dịch sinh học bằng HPLC Hiện nay, đối với RIF nguyên liệu có thể định lượng bằng phương pháp đo quang và HPLC Nhưng trong dịch sinh học do có nhiều thành phần nên để đảm bảo chính xác và giảm thiểu sai số định lượng RIF trong huyết tương thì phương pháp HPLC thường được chọn để tiến hành Một số phương pháp định lượng RIF trong dịch sinh học bằng HPLC được trình... cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam 7 1.2.TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 .Định nghĩa Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất... pháp định lượng Rifampicin trong huyết tương bằng HPLC - Quy trình chiết tách RIF: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng – lỏng, tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu tự tạo để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp - Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách RIF khỏi các thành phần tạp trong huyết tương cho phép xác định được lượng. .. điều kiện các chỉ số k’ là hằng định Đo chiều cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thủ từ thấp đến trung bình 1.2.5.2.Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại,... tác nhân gây tủa là: MeOH, HClO4 + Chiết lỏng - lỏng 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 2.3.3.1 Tính đặc hiệu - chọn lọc Chỉ tiêu độ đặc hiệu – chọn lọc được quy định tại mục 1.3.2.1 Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu:  Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau  Huyết tương trắng có pha chuẩn RIF ở nồng độ LLOQ (0,2 µg/mL) và IS  Huyết tương trắng có pha chuẩn RIF ở nồng độ khoảng... trong mẫu với độ chính xác thích hợp 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp đã được lựa chọn với các chỉ tiêu: Tính đặc hiệu/ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), tỷ lệ thu hồi, độ ổn định 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu  Chuẩn bị mẫu chuẩn RIF và IS trong. .. định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày Xác định độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau 2.3.3.5 Giới hạn định lượng dưới Tiến hành sắc ký 6 mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trong khoảng nồng độ tuyến tính Ghi lại đáp ứng pic của các mẫu chuẩn Dựa theo đường chuẩn pha trong . và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất rifampicin, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu định lượng rifampicin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với 2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn:. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGUYỄN VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ