2.3.3.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc
Chỉ tiêu độ đặc hiệu – chọn lọc được quy định tại mục 1.3.2.1 Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu:
Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau
Huyết tương trắng có pha chuẩn RIF ở nồng độ LLOQ (0,2 µg/mL) và IS.
Huyết tương trắng có pha chuẩn RIF ở nồng độ khoảng giữa đường chuẩn (9 µg/mL) và IS
So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính
Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung dịch có nồng độ như sau: 0,2 – 0,5 – 1,0 – 2,0 – 4,0 – 8,0 – 16,0 – 20,0 µg/mL
Tiến hành phân tích các mẫu. Từ đáp ứng pic của RIF và IS tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic của RIF/IS và nồng độ RIF có trong mẫu và xác định hệ số tương quan r. Tính lại nồng độ RIF các mẫu theo phương trình hồi quy, xác định lại độ đúng so với giá trị thực của từng nồng độ.
2.3.3.3. Độ đúng
Chuẩn bị các lô mẫu QC bao gồm: LQC, MQC và HQC, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập có cùng nồng độ.
Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC. Xác định kết quả định lượng các mẫu QC dựa vào đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu.
2.3.3.4. Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày
Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng. Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trong cùng điều kiện.
Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày
Xác định độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau.
2.3.3.5. Giới hạn định lượng dưới
Tiến hành sắc ký 6 mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trong khoảng nồng độ tuyến tính. Ghi lại đáp ứng pic của các mẫu chuẩn. Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu LLOQ. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu. Xác định độ chính xác bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng.
2.3.3.6. Tỷ lệ thu hồi
Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô gồm ít nhất 5 mẫu độc lập. Song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu có nồng độ tương ứng.
Xác định tỷ lệ thu hồi của RIF và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của RIF và IS trong các mẫu QC có qua xử lý với đáp ứng của RIF và IS trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua xử lý).
2.3.3.7. Độ ổn định của huyết tương
Xác định độ ổn định của RIF trong huyết tương sau ba chu kỳ đông – rã đông và trong quá trình xử lí mẫu trên các mẫu LQC và HQC.
Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -800C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi đã tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24 giờ. Lặp lại chu kì đông – rã đông 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông – rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ RIF có trong mẫu. So sánh với kết quả xác định nồng độ RIF có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu). Nồng độ RIF trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn: Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (5 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông. Nồng độ RIF trong mẫu được xử lý sau khi để một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ -800C trong thời gian dài: Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -800C, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định (6, 14, 21 và 28 ngày). So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Nồng độ RIF trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
200 300 400 500 600 700 nm -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 mAU 4.21/ 1.00 2 1 2 2 9 5 3 9 3 7 4 3 7 2 3 2 3 8 3 3 6 4 7 6 7 3 5 7 6 9
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN